Ringraziamo il Centro per la Medicina Comparata e la Ricerca del Dartmouth College per aver fornito l'allevamento quotidiano degli animali utilizzati in questo protocollo. Ringraziamo anche Leah Jacob e Adwaita Bose per il loro aiuto nel testare il protocollo e fotografare gli animali. Infine, ringraziamo il laboratorio di Ann Miller per la formazione nella pratica del tatuaggio. Questo lavoro è stato sostenuto dalla sovvenzione NIH R00 GM147826 a J.L.

Tutte le procedure per gli animali descritte sono state approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali del Dartmouth College.
1. Configurazione dell'attrezzatura
NOTA: Sono inclusi un flusso di lavoro per la procedura e un esempio di configurazione del banco (Figura 1).
<ol><li>Collegare la pistola per tatuaggi e il pedale all'alimentazione. Posizionare il pedale sotto la superficie di lavoro.</li>
	<li>Assemblaggio della pistola per tatuaggi<ol><li>Utilizzando una chiave a brugola o un cacciavite esagonale, allentare le viti nell'impugnatura (Figura 2A, cerchiate in rosso).</li>
		<li>Inserire la punta di plastica fino in fondo nell'impugnatura. Serrare la vite per tenerla in posizione.</li>
		<li>Inserire il tubo metallico nella parte posteriore dell'impugnatura (Figura 2A). Questo verrà regolato, quindi inseriscilo a metà della sua lunghezza. Serrare la vite per tenerla in posizione.</li>
		<li>Inserisci un ago per tatuaggio attraverso la parte posteriore dell'impugnatura in modo che si trovi comodamente nella punta di plastica nella parte anteriore dell'impugnatura (Figura 2B).</li>
		<li>Far scorrere la parte posteriore dell'ago e il tubo metallico attraverso il morsetto del tubo. Regolare il tubo di metallo in modo che l'ago si adatti comodamente alla punta di plastica (Figura 2B). Stringere a mano il morsetto del tubo fino a quando il tubo non è in grado di muoversi (Figura 2C).</li>
		<li>Rimuovere l'O-ring nero e agganciare l'ago al braccio del rotore; sostituire l'O-ring per fissare l'ago in posizione (Figura 2C).</li>
	</ol></li>
	<li>Impostare la tensione sull'alimentatore in modo che ci sia abbastanza potenza per perforare la pelle, ma non così potente da essere difficile da controllare. Una volta che l'alimentatore è collegato e collegato, premere il pedale per assicurarsi che la macchina funzioni. Fare attenzione a non puntare l'ago verso se stessi o altri membri del personale. NOTA: La macchinetta per tatuaggi utilizzata in questo protocollo funziona meglio tra 6,0 e 9,0 V, ma questo può variare tra le macchinette per tatuaggi e gli alimentatori di tensione e dovrebbe essere determinato empiricamente.</li>
	<li>Riempire il tappo di una provetta per microcentrifuga da 1,5 ml o di un calamaio di plastica in dotazione con inchiostro nero per tatuaggi fino a circa tre quarti.</li>
</ol>2. Anestesia
<ol><li>Preparare l'anestesia in una vasca abbastanza grande da immergere una femmina adulta di rana X. laevis .<ol><li>Utilizzando acqua sicura per le rane (senza cloro), aggiungere la tricaina alla concentrazione finale di 1,5 g/L e il bicarbonato di sodio alla concentrazione finale di 3,5 g/L. Mescolare per sciogliere. Il pH di questa soluzione è 7,15. ATTENZIONE: La tricaina è irritante.</li>
	</ol></li>
	<li>Immergere una rana nella vasca di anestesia. Assicurarsi che la rana rimanga immersa nella soluzione di tricaina fino a quando non viene anestetizzata (7-8 min).<ol><li>Per verificare se la rana è completamente anestetizzata, raccoglila, tienila a testa in giù e stringila con decisione su un piede. Se la rana non sussulta o non risponde, può essere tatuata.</li>
		<li>Se le rane impiegano costantemente più di 10 minuti per essere anestetizzate, preparare una soluzione fresca di tricaina tamponata con bicarbonato di sodio. NOTA: Le rane non dovrebbero trascorrere più di 30 minuti nella soluzione di tricaina15.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Tatuaggio
NOTA: Prima di tatuare un animale vivo, può essere utile esercitarsi su un frutto con una buccia soda (come un limone o una banana).
<ol><li>Prepara una vasca di recupero per le rane prima di tatuare. Riempi un serbatoio con 10-15 L di acqua fresca sicura per le rane e aggiungi un'isola di polistirolo. Questo fornirà una superficie in cui la rana si sveglierà senza annegare. NOTA: Un'isola di polistirolo può essere realizzata utilizzando il coperchio di un contenitore di spedizione freddo in polistirolo posizionato all'interno di una borsa con cerniera.</li>
	<li>Posizionare la rana anestetizzata sul dorso su un tovagliolo di carta asciutto o carta da banco (Figura 3A). Usa tovaglioli di carta non sbiancati (marroni) per tutti i lavori che coinvolgono le rane.</li>
	<li>Usando un panno asciutto e privo di lanugine, rimuovere l'acqua e il muco dal petto della rana.</li>
	<li>Trova lo sterno al centro del torace della rana con le dita e, usando la mano non dominante, tieni tesa la pelle.</li>
	<li>Marcatura della rana<ol><li>Tenere la pistola per tatuaggi assemblata verticalmente rispetto alla superficie di lavoro e immergere l'ago nell'inchiostro (Figura 3B).</li>
		<li>Mantenendo la pistola per tatuaggi assemblata in verticale, premere la punta dell'ago sulla pelle della rana prima di premere il pedale. Disegna delle linee sulla pelle della rana applicando una pressione uniforme. NOTA: Qualche lieve sanguinamento o arrossamento è normale, così come una piccola desquamazione della pelle.</li>
		<li>Se l'ago si impiglia nella pelle della rana, rimuovere l'inchiostro in eccesso o la pelle dall'ago con una salvietta. L'eccesso di inchiostro è normale durante il tatuaggio.</li>
		<li>Se il petto della rana è coperto da troppo inchiostro per vedere chiaramente l'area da contrassegnare (Figura 3C), rimuovere l'inchiostro in eccesso con acqua sicura per le rane e una salvietta (Figura 3C'). Quindi, rimuovere l'umidità con un panno asciutto e continuare a inchiostrare. NOTA: Prima del tatuaggio si può preparare una bottiglia di acqua sicura per le rane.</li>
		<li>Continuare a inchiostrare la stessa area fino a quando rimangono numeri scuri e leggibili dopo aver rimosso l'inchiostro in eccesso (Figura 3D). Invece di disegnare l'intero segno o numero in un solo tratto, fai ripetutamente tratti più piccoli, soprattutto per le curve.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Recupero
<ol><li>Inumidisci un tovagliolo di carta con acqua sicura per le rane e posizionalo in piano sopra l'isola di polistirolo (Figura 4A).</li>
	<li>Riportare le rane nei serbatoi in piedi<ol><li>Appoggiare la rana a pancia in giù sull'asciugamano rivolto verso l'acqua (Figura 4B). Piega metà del tovagliolo di carta sulla metà posteriore del nasetto e, usando le mani a coppa, bagna la parte superiore del nasetto. Una volta che una rana emerge dall'anestesia (circa 1 ora dopo il tatuaggio), entrerà in acqua in modo indipendente e nuoterà normalmente.</li>
		<li>Riporta le rane in un alloggio a lungo termine dopo 24 ore, una volta che il tatuaggio è completamente guarito.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Pulizia e manutenzione delle attrezzature
<ol><li>Riutilizzo e sterilizzazione in autoclave degli aghi per tatuaggi<ol><li>Sciacquare gli aghi con isopropanolo al 100% e acqua deionizzata per sciogliere l'inchiostro e rimuovere l'inchiostro rimanente che non si è sciolto.</li>
		<li>Dopo lo strofinamento, posizionare gli aghi in una custodia metallica per autoclave o avvolgerli con un foglio di alluminio e sterilizzarli in autoclave per 30 minuti con ciclo a secco.</li>
	</ol></li>
	<li>Se c'è dell'inchiostro su pezzi della macchinetta per tatuaggi o di altre attrezzature, puliscilo con etanolo al 100% e un tovagliolo di carta.</li>
	<li>La soluzione anestetica ha una concentrazione finale di tricaina di circa lo 0,5%. Smaltire questo secondo le linee guida istituzionali per la gestione dei rifiuti pericolosi.</li>
	<li>Stoccaggio e manutenzione delle attrezzature<ol><li>Se possibile, conservare la macchinetta per tatuaggi in un luogo asciutto. L'umidità in eccesso danneggerà i componenti elettrici e ridurrà la longevità della macchina.</li>
		<li>Per mantenere la macchinetta per tatuaggi in buone condizioni, controllare il cuscinetto sul rotore (Figura 2C) per assicurarsi che non si sia allentato a causa delle vibrazioni22. Questo può essere serrato con una chiave a brugola o un cacciavite esagonale.</li>
		<li>Circa una volta al mese, lubrificare il cuscinetto sul braccio del rotore con un grasso lubrificante denso22.</li>
		<li>Su alcune macchinette per tatuaggi, il braccio del rotore può bloccarsi e non vibrare. Per correggere questo problema, ruotare il braccio del rotore o comprimere la molla in modo che l'ago sia in posizione abbassata (Figura 2C).</li>
	</ol></li>
</ol>

Ottimizzare la marcatura degli anfibi: una guida al tatuaggio di Xenopus

<ol>
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Gli autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.

Tatuare gli esseri umani è una forma d'arte che risale a migliaia di anni fa e, da quando gli esseri umani si tatuano, hanno anche tatuato o marchiato animali23. Le attrezzature e le tecniche per marcare gli animali, in particolare i mammiferi, sono ben consolidate, ben documentate e ampiamente accessibili. Mentre la marcatura degli animali era originariamente per distinguere il bestiame e i deterrenti contro i furti23, il suo ruolo nella ricerca biomedica è diventato alt...

I modelli animali sono strumenti utili per indagare su questioni relative alla salute umana. In pratica, la ricerca biomedica che utilizza modelli animali richiede un'attenta organizzazione e il mantenimento di una colonia animale sana. Le migliori pratiche per la gestione e l'allevamento etico degli animali mirano a ridurre il numero di animali necessari per la sperimentazione e a perfezionare le pratiche per garantire il benessere degli animali1. Il genere della rana artigliata, tra cui Xenopus laevis (X. laevis; Rana artigliata africana) e Xenopus tropicalis (X. tropicalis; Rana artigliata occidentale), sono stati utilizzati nella ricerca biomedica dal 1930, quando X. laevis è stato utilizzato dai medici sudafricani per condurre i primi test di gravidanza2. Sebbene i moderni test di gravidanza non richiedano più rane, il ruolo della ricerca su Xenopus persiste. I vantaggi dell'utilizzo di Xenopus per la ricerca biomedica includono i genomi ben annotati3, l'ovulazione inducibile tutto l'anno di grandi covate di uova4 e gli ovuli deposti esternamente suscettibili di fecondazione in vitro. Queste caratteristiche li rendono una risorsa utile per l'embriologia e lo sviluppo dei vertebrati 5,6,7, la biologia molecolare e cellulare di base 7,8,9,10 e per la modellazione delle malattie umane 7,11,12,13.
Metodi affidabili per tracciare i singoli animali di Xenopus sono essenziali per registrare le repliche biologiche e migliorare il rigore e la riproducibilità della ricerca. Poiché gli Xenopus sono spesso alloggiati in gruppi, la marcatura degli animali consente ai ricercatori di rintracciare facilmente i singoli animali4. Mantenere un registro accurato degli animali può far risparmiare tempo e risorse e migliorare la capacità di monitorare la salute degli animali. Ad esempio, l'identificazione individuale degli animali può migliorare i flussi di lavoro organizzativi per la generazione di linee transgeniche di Xenopus , poiché ciò richiede più generazioni di rane con genotipi specifici verificati dal sequenziamento14, che richiede l'organizzazione e l'identificazione individuale degli animali. Ciò è particolarmente vero quando queste mutazioni mancano di fenotipi adulti facilmente distinguibili. Allo stesso modo, l'uso di ovociti ed embrioni di Xenopus per studiare la biologia cellulare e dello sviluppo di base trae vantaggio dal monitoraggio dei singoli animali. Dopo aver indotto l'ovulazione, gli animali devono riposare per un minimo di 3 mesi per prevenire complicazioni di salute come la sindrome da iper-ovulazione15. I metodi di identificazione individuali garantiscono che gli animali non siano indotti a ovulare troppo frequentemente.
La marcatura e il monitoraggio degli animali consentono inoltre al personale di laboratorio di tenere traccia dei problemi di salute degli animali. Gli animali dello stesso genotipo che si ammalano possono indicare un'eccessiva consanguineità o problemi di salute imprevisti associati al transgene. Allo stesso modo, gli animali che si ammalano dopo una recente ovulazione possono indicare problemi con reagenti, materiali o tecniche. Il monitoraggio degli animali e della loro salute consente al personale di laboratorio e ai veterinari di seguire quando le preoccupazioni riemergono e di adottare misure preventive per prevenire malattie future. Nei mammiferi esistono numerosi metodi di identificazione. I metodi permanenti per i topi includono punzonatura dell'orecchio, marchi auricolari, tatuaggi e microchip sottocutanei16. Questi possono differenziare in modo chiaro e affidabile gli animali all'interno di una colonia o di una gabbia e possono essere facilmente somministrati dal personale di laboratorio. Metodi come la punzonatura dell'orecchio sono minimamente invasivi, richiedono solo un'attrezzatura specializzata e funzionano per animali della maggior parte delle età. Sebbene questi sistemi siano semplici e utili per i topi, il loro utilizzo nelle rane presenta una serie unica di sfide. Le rane e gli altri anfibi mancano di un padiglione auricolare (struttura dell'orecchio esterno). Alcuni ricercatori hanno attaccato etichette alla mascella, al dito del piede o all'arto posteriore dell'animale17,18. Questo approccio ha comportato vari problemi: le etichette della mascella causavano irritazione e le rane agitate tentavano di staccare le etichette con gli arti anteriori17. Le targhette perforavano la fettuccia tra le dita dei piedi, compromettendo i movimenti e correndo il rischio di perdersi. Pertanto, gli anfibi richiedono i propri metodi per l'identificazione. Storicamente, il toe-clipping è stato utilizzato anche per marcare gli anfibi17,19. Il dito del piede viene tagliato con un paio di forbici affilate e l'animale può essere identificato dalla lunghezza delle dita dei piedi anteriori e posteriori o dall'angolo con cui il dito è ricresciuto (nelle salamandre). Tuttavia, questo metodo pone la preoccupazione etica che il taglio delle dita dei piedi possa compromettere il movimento dell'animale17. Inoltre, questo può causare sanguinamento e introdurre un rischio di infezione. Un altro sistema di marcatura consolidato è l'autotrapianto cutaneo, in cui la pelle viene prelevata da una parte della rana e attaccata chirurgicamente a un'altra parte. Ad esempio, viene descritto un metodo per marcare la schiena o la spalla di una rana utilizzando un innesto di pelle di colore chiaro dal suo torace20. Gli innesti cutanei comportano anche limitazioni e rischi: la procedura è invasiva e introduce il rischio di infezione da Aeromonas hydrophila, o gamba rossa, un'afflizione potenzialmente fatale; la guarigione completa dell'autotrapianto richiede fino a 6 settimane; E con i metodi descritti, solo 6 rane possono essere alloggiate insieme a causa dei posti limitati per mettere un autotrapianto20.
Gli approcci di marcatura meno invasivi includono perle di vetro e chip transponder17,19. Nel metodo delle perle di vetro, le perle di vetro vengono infilate su una piccola sutura e cucite nella pelle della rana. Ciò fornisce una maggiore variabilità rispetto agli autotrapianti cutanei, con almeno 60 combinazioni di colori distintive. C'è, tuttavia, il rischio che la sutura possa fuoriuscire e provocare la perdita delle perline. In alternativa, un transponder a microchip può essere impiantato sotto la pelle nel sacco linfatico dorsale della rana. Questo è considerato il metodo di marcatura più permanente e consente di identificare e catalogare individualmente un numero potenzialmente infinito di animali. Tuttavia, questo è anche il metodo più costoso, poiché i singoli microchip sono costosi e una grande colonia sarebbe costosa da marcare. I microchip richiedono anche uno scanner speciale per leggere19. Un approccio comune per l'identificazione di Xenopus è fare riferimento alla colorazione e al disegno naturale degli animali. Questo funziona particolarmente bene per le rane come X. laevis, che hanno modelli distinti che rimangono per tutta l'età adulta. Tuttavia, questi modelli possono cambiare nel tempo con lo stress e la colorazione può apparire diversa quando le rane vengono spostate tra contenitori trasparenti e colorati15. Inoltre, questo metodo di identificazione è meno utile per X. tropicalis, che ha modelli di marcatura meno distinti rispetto a X. laevis, o per gli animali albini, che non hanno marcature colorate21. Anche per le specie con marcature distinte, il personale di laboratorio può interpretare il posizionamento e le dimensioni delle marcature in modo diverso, il che può causare errori nell'identificazione. Per questo motivo, fotografare gli animali è più affidabile in combinazione con un metodo di identificazione aggiuntivo. Pertanto, cerchiamo di marcare e identificare gli animali Xenopus utilizzando una tecnica facilmente distinguibile, permanente e minimamente invasiva.
Ci sono poche risorse pubblicate che descrivono i metodi per tatuare gli anfibi. Il tatuaggio è stato descritto insieme ad altre tecniche di branding, tra cui marchi di calore, marchi di nitrato d'argento e marchi di congelamento17. Nella stessa risorsa, il tatuaggio è stato fatto disegnando numeri con un ago ipodermico da 27G, e il processo è stato notato per non causare infezioni, in contrasto con le altre tecniche di marchiatura, che utilizzavano un filo a forma di numero o altro segno. In un'altra fonte, una macchinetta elettrica per tatuaggi (descritta come un ago vibrante) è stata utilizzata per marcare le rane, ma sono stati forniti pochi dettagli sulla tecnica17,19. Gli autori avvertono che disturbando lo strato protettivo di melma della rana, questa procedura aumenta il rischio di zampe rosse. Sebbene non esista un metodo di marcatura o identificazione che sia completamente non invasivo (come le fotografie) e permanente (come i microchip), il tatuaggio fornisce un compromesso efficace. Il tatuaggio è relativamente semplice rispetto ad altre tecniche, come gli autotrapianti cutanei. Ulteriori vantaggi includono una curva di apprendimento più piccola e attrezzature relativamente economiche. Tatuare gli anfibi acquatici comporta alcune sfide, che possono intimidire i ricercatori e compromettere la marcatura degli animali. Questo articolo mira a fornire ai ricercatori metodi ben documentati per tatuare Xenopus adulti con una macchinetta rotativa.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3 needle round liners</td>
			<td>Worldwide Tattoo Supply</td>
			<td>1203RLB</td>
			<td>Packaged sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 Needle Round Disposable ULTRA</td>
			<td>Worldwide Tattoo Supply</td>
			<td>HTIPRS5-U</td>
			<td>Packaged sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 needle round liners</td>
			<td>Worldwide Tattoo Supply</td>
			<td>1205RLB</td>
			<td>Packaged sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7 needle round liners</td>
			<td>Worldwide Tattoo Supply</td>
			<td>1207RLB</td>
			<td>Packaged sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clip Cord</td>
			<td>Worldwide Tattoo Supply</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foot pedal</td>
			<td>Worldwide Tattoo Supply</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inkpots</td>
			<td>Worldwide Tattoo Supply</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes, delicate task wipes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-666A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RCA Connection</td>
			<td>Worldwide Tattoo Supply</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scream Ink Pitch Black, 1oz</td>
			<td>Worldwide Tattoo Supply</td>
			<td>SI101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate (NaHCO3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel grips</td>
			<td>Worldwide Tattoo Supply</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stealth 2.0 Rotary Tattoo Machine</td>
			<td>Worldwide Tattoo Supply</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stealth 2.0 Rotary Tattoo Machine Box Set</td>
			<td>Worldwide Tattoo Supply</td>
			<td>STEALTH2-SET</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Styrofoam island</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>This is the lid of a styrofoam cold shipping container</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine (ethyl 3-aminobenzonate methanesulfate)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E10521</td>
			<td>CAUTION: IRRITANT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unbleached paper towels</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>2U229</td>
			<td>Paper towels MUST be unbleached, bleach is toxic to amphibians</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Voltage Supply</td>
			<td>Worldwide Tattoo Supply</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash bottle (with frog-safe water)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0340923T</td>
			<td>Frog safe water is dechlorinated, pH 7.0-8.5, conductivity 1200-1800 uS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X. laevis adult female</td>
			<td>Xenopus1</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zip-top plastic bag</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>This bag should be large enough to hold the styrofoam island</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods for tattooing xenopus laevis with a rotary tattoo machine

I modelli animali ampliano l'ambito della ricerca biomedica, migliorando la nostra comprensione della biologia dello sviluppo, molecolare e cellulare e consentendo ai ricercatori di modellare le malattie umane. La registrazione e il monitoraggio dei singoli animali consente ai ricercatori di ridurre il numero di animali necessari per lo studio e di perfezionare le pratiche per migliorare il benessere degli animali. Esistono diversi metodi ben documentati per marcare e rintracciare i mammiferi, tra cui la punzonatura delle orecchie e i marchi auricolari. Tuttavia, i metodi per marcare le specie di anfibi acquatici sono limitati, con le risorse esistenti obsolete, inefficaci o proibitive. In questo manoscritto, descriviamo i metodi e le migliori pratiche per marcare lo Xenopus laevis con una macchinetta rotativa. Un tatuaggio corretto si traduce in tatuaggi di alta qualità, rendendo gli individui facilmente distinguibili per i ricercatori e ponendo un rischio minimo per la salute degli animali. Evidenziamo anche le cause dei tatuaggi di scarsa qualità, che possono portare a tatuaggi che sbiadiscono rapidamente e causano danni inutili agli animali. Questo approccio consente a ricercatori e veterinari di marcare gli anfibi, consentendo loro di tracciare le repliche biologiche e le linee transgeniche e di tenere registri accurati della salute degli animali.

Animal models are useful tools for investigating questions pertaining to human health. In practice, biomedical research using animal models requires careful organization and maintenance of a healthy animal colony. Best practices for ethical animal handling and husbandry aim to reduce the number of animals needed for experimentation and refine practices to ensure animal welfare1. The clawed frog genus, including Xenopus laevis (X. laevis; African clawed frog) and Xenopus tropicalis (X. tropicalis; Western clawed frog), have been used in biomedical research since the 1930s when X. laevis were used by South African doctors to conduct the first pregnancy tests2. While modern pregnancy tests no longer require frogs, the role of Xenopus research persists. Advantages of using Xenopus for biomedical research include their well-annotated genomes3, year-round inducible ovulation of large clutches of eggs4, and externally laid eggs amenable to in vitro fertilization. These features make them a useful asset for vertebrate embryology and development5,6,7, basic molecular and cellular biology7,8,9,10, and for modeling human disease7,11,12,13.
Reliable methods for tracking individual Xenopus animals are essential for recording biological replicates and improving rigor and reproducibility in research. As Xenopus are frequently housed in groups, animal marking allows researchers to easily track individual animals4. Maintaining an accurate record of animals can save time and resources and improve the ability to track animals&#39; health. For example, individual identification of animals can improve organization workflows for generating transgenic Xenopus lines, as this requires multiple generations of frogs with specific genotypes verified by sequencing14, which requires organization and individual identification of animals. This is particularly true when these mutations lack easily discernible adult phenotypes. Similarly, the use of Xenopus oocytes and embryos to study basic cellular and developmental biology benefits from tracking individual animals. After inducing ovulation, animals need to rest for a minimum of 3 months to prevent health complications such as hyper-ovulation syndrome15. Individual identification methods ensure that animals are not induced to ovulate too frequently.
Marking and tracking animals also enables lab personnel to track animals&#39; health concerns. Animals of the same genotype falling ill can indicate excessive inbreeding or unanticipated health concerns associated with the transgene. Similarly, animals falling ill after recent ovulation can indicate issues with reagents, materials, or techniques. Tracking animals and their health enables lab personnel and veterinarians to follow up when concerns resurface and take preventative measures to prevent future illness. In mammals, there are numerous identification methods. Permanent methods for mice include ear punching, ear tags, tattooing, and subcutaneous microchips16. These can clearly and reliably differentiate animals within a colony or cage and can be easily administered by laboratory personnel. Methods such as ear punching are minimally invasive, require only one piece of specialized equipment, and work for animals of most ages. While these systems are straightforward and useful for mice, their use in frogs presents a unique set of challenges. Frogs and other amphibians lack a pinna (external ear structure). Some researchers have attached tags to the animal&#39;s jaw, toe, or hind limb17,18. This approach resulted in various problems: jaw tags caused irritation, and agitated frogs attempted to pull off tags with their forelimbs17. Toe tags pierced the webbing between toes, impairing movement and carrying the risk of becoming lost. As such, amphibians require their own methods for identification. Historically, toe-clipping has also been used to mark amphibians17,19. The toe is clipped with a sharp pair of scissors, and the animal can be identified by the length of toes on the forefeet and hind feet or by the angle at which the toe has grown back (in salamanders). However, this method poses the ethical concern that toe clipping may impair the animal&#39;s movement17. In addition, this can cause bleeding and introduce a risk of infection. Another established marking system is skin autografts, in which skin is taken from one part of the frog and surgically attached to another part. For example, a method is described for marking a frog&#39;s back or shoulder using a light-colored skin graft from its chest20. Skin grafts also come with limitations and risks: the procedure is invasive and introduces the risk of Aeromonas hydrophila infection, or red leg, a potentially fatal affliction; complete healing of the autograft takes up to 6 weeks; and with the methods described, only 6 frogs can be housed together because of limited places to put an autograft20.
Less invasive marking approaches include glass beads and transponder chips17,19. In the glass bead method, glass beads are threaded onto a small suture and sewn into the frog&#39;s skin. This provides greater variability than skin autografts, with at least 60 distinctive color combinations. There is, however, a risk that the suture can come out and result in the beads being lost. Alternatively, a microchip transponder can be implanted under the skin in the frog&#39;s dorsal lymph sac. This is considered the most permanent marking method and enables a potentially infinite number of animals to be individually identified and cataloged. However, this is also the most expensive method, as individual microchips are expensive, and a large colony would be costly to mark. Microchips also require a special scanner to read19. One common approach for Xenopus identification is referring to animals&#39; natural coloring and patterning. This works especially well for frogs such as X. laevis, which have distinct patterns that remain throughout adulthood. However, these patterns can change over time with stress, and coloring can appear different when frogs are moved between transparent and tinted containers15. Additionally, this identification method is less useful for X. tropicalis, which has less distinct marking patterns compared to X. laevis, or for albino animals, which have no color markings21. Even for species with distinct markings, lab personnel can interpret the placement and size of markings differently, which can cause errors in identification. Because of this, photographing animals is most reliable in conjunction with an additional identification method. Therefore, we seek to mark and identify Xenopus animals using a technique that is easily discernable, permanent, and minimally invasive.
There are limited published resources describing methods for tattooing amphibians. Tattooing has been described alongside other branding techniques, including heat brands, silver nitrate brands, and freeze brands17. In the same resource, tattooing was done by drawing numerals with a 27G hypodermic needle, and the process was noted not to cause infection, in contrast to the other branding techniques, which used a wire shaped into a numeral or other mark. In another source, an electric tattooing machine (described as a vibrating needle) was used to mark frogs, but little detail was provided on the technique17,19. The authors warn that by disturbing the frog&#39;s protective slime layer, this procedure increases the risk of red leg. While there is no marking or identification method that is both completely noninvasive (such as photographs) and permanent (such as microchips), tattooing provides an effective compromise. Tattooing is relatively straightforward compared to other techniques, such as skin autografts. Additional benefits include a smaller learning curve and relatively inexpensive equipment. Tattooing aquatic amphibians comes with certain challenges, which can intimidate researchers and impair successful animal marking. This paper aims to provide researchers with well-documented methods for tattooing adult Xenopus with a rotary tattoo machine.

Autore in primo piano: Affinamento delle tecniche di marcatura di Xenopus laevis per gli studi biomedici

Metodi per tatuare lo Xenopus laevis con una macchinetta rotativa per tatuaggi

Our research is focused on investigating the organization of the cell cortex using Xenopus egg extracts and supported lipid bilayers. We are trying to understand how dynamic cytoskeletal patterns are regulated within the cortex and how these patterns support basic cell functions like cell division. This protocol outlines an effective and safe method for marking Xenopus laevis.This approach enables researchers to track genetic lines and experimental replicates and to monitor animal health. Tattooing is a cost-effective permanent marking technique for amphibians. It's much less invasive than other permanent methods, such as skin graft or tags, it's also more reliable than qualitative methods, like photos or pattern recognition.

I tatuaggi di alta qualità avranno tratti scuri e leggibili sul petto della rana e possono essere chiaramente differenziati da diversi metri di distanza (Figura 5A). In generale, i numeri e i segni più grandi sono migliori per la leggibilità, ma i nomi e i numeri più lunghi possono essere rimpiccioliti per adattarsi comodamente al petto della rana. La longevità del tatuaggio è più difficile da giudicare, ma i tatuaggi di rana di alta qualità dovrebbero rimanere scuri e leggibili per ...

Qui, descriviamo i metodi per tatuare Xenopus laevis adulto (rana artigliata africana) con una macchinetta per tatuaggi rotante. Un tatuaggio corretto si traduce in numeri scuri e facilmente leggibili che durano per diversi mesi e rendono gli animali facilmente distinguibili per scopi di ricerca e registrazione.

Animal models expand the scope of biomedical research, furthering our understanding of developmental, molecular, and cellular biology and enabling ...

methods-for-tattooing-xenopus-laevis-with-a-rotary-tattoo-machine

Research

JoVE Journal

Biology

Methods for Tattooing Xenopus laevis with a Rotary Tattoo Machine

377 Views.  Dartmouth College. La nostra ricerca è focalizzata sullo studio dell'organizzazione della corteccia cellulare utilizzando estratti di uova di Xenopus e doppi strati lipidici supportati. Stiamo cercando di capire come i modelli dinamici del citoscheletro sono regolati all'interno della corteccia e come questi modelli supportano le funzioni cellulari di base come la divisione cellulare. Questo protocollo delinea un metodo efficace e sicuro per marcare Xenopus laevis.Quest...

Video: Autore in primo piano: Affinamento delle tecniche di marcatura di Xenopus laevis per gli studi biomedici

Animal models expand the scope of biomedical research, furthering our understanding of developmental, molecular, and cellular biology and enabling researchers to model human disease. Recording and tracking individual animals allows researchers to reduce the number of animals required for study and refine practices to improve animal wellbeing. Several well-documented methods exist for marking and tracking mammals, including ear punching and ear tags. However, methods for marking aquatic amphibian species are limited, with the existing resources being outdated, ineffective, or prohibitively costly. In this manuscript, we outline methods and best practices for marking Xenopus laevis with a rotary tattoo machine. Proper tattooing results in high-quality tattoos, making individuals easily distinguishable for researchers and posing minimal risk to animals' health. We also highlight the causes of poor-quality tattoos, which can result in tattoos that fade quickly and cause unnecessary harm to animals. This approach allows researchers and veterinarians to mark amphibians, enabling them to track biological replicates and transgenic lines and to keep accurate records of animal health.

Here, we describe methods for tattooing adult Xenopus laevis (African clawed frog) with a rotary tattoo machine. Proper tattooing results in dark, easily legible numerals that last for several months and make animals easily distinguishable for research and recordkeeping purposes.

Ricerca

Biologia

Preparation of the Tattoo Gun to Mark Frogs for Research Purposes

To begin, connect the tattoo gun and foot pedal to the power supply. Position the foot pedal underneath the working surface. For assembling the tattoo gun, loosen the screws in the grip with an Allen wrench.Insert the plastic tip all the way into the grip and tighten the screw to hold it in place. Then insert the metal tube in the back of the grip to half of its length and tighten the screw while adjusting the length. Insert a tattoo needle through the back of the grip to secure it in the plastic tip at the front of the grip.Slide the back of the needle and metal tube through the tube clamp. After adjusting the metal tube, hand tighten the tube clamp until it cannot move. Remove the black O-ring, hook the needle onto the rotor arm, and replace the O-ring.Next, set the required voltage on the power supply. Once the power supply is plugged in, press the foot pedal to check if the machine works. Fill the plastic ink pot with black tattoo ink to about three quarters full before tattooing.

Preparazione della pistola per tatuaggi per marcare le rane a scopo di ricerca

Rotary Tattoo Method for Long-Term Marking of Xenopus in Research Environments

To begin, set up the equipment for tattooing. Place the anesthetized frog on its back on a dry, unbleached paper towel. Using a dry, lint-free wipe, clear the water and mucus from the frog's chest.Then find the sternum in the center of the frog's chest with fingers, and using the non-dominant hand, hold the skin taught. Position the assembled tattoo gun vertically relative to the working surface and dip the needle into the ink. Keeping the gun vertical, press the needle tip onto the frog's skin, followed by the foot pedal.Draw lines onto the frog's skin while applying even pressure. If the needle gets stuck, clear excess ink or skin from the needle with a wipe. If necessary, clear excess ink on the frog's chest with frog-safe water and a wipe, and then wick away moisture with a dry wipe.Continue to ink the same area until dark, legible numbers persist after wiping away excess ink. Fill a tank with 10 to 15 liters of fresh frog-safe water and add a styrofoam island to provide a surface for the frog to wake up without drowning. Wet a paper towel with frog-safe water and place it flat on the styrofoam island.Next, lay the frog belly down on the towel facing the water. Fold half of the paper towel over the back half of the frog, and using cupped hands, wet its top portion. After 24 hours, when the tattoo is healed, return the frog to its long-term housing unit.Of the frogs tattooed, 100%had visible tattoos immediately after tattooing, 100%had them 24 hours after tattooing, and 91%had them four months after tattooing.