<p> JLN è stato sostenuto da MH 68347. </p>

<p class="jove_step"> Prima dell&#39;isolamento dell&#39;ippocampo </p><p class="jove_content"> Prima di iniziare l&#39;isolamento dell&#39;ippocampo, assicurarsi che tutti gli strumenti sono sterili. Spray giù il cappuccio della cultura con il 70% di etanolo, e atto gli strumenti all&#39;interno della cappa. Avrete bisogno di 6 - e 10 cm di piastre di Petri, sterile poli-L coprioggetto vetro rivestito, pipette e le punte, pipette monouso, e un pipettatore elettrica. Da questo punto in poi, ricordatevi di usare correttamente la tecnica sterile. </p><ol><li> Accendere il bagno d&#39;acqua e fare in modo che viene riscaldato fino a 37 ° C. </li><li> Le seguenti soluzioni che vengono conservati a 4 ° C saranno necessarie: <ul><li> Media modificato Eagle (MEM) </li><li> Neurobasal </li><li> Soluzione salina tamponata di Hank (HBSS) </li><li> Soluzione tampone borato </li><li> Piruvato di sodio soluzione </li><li> Sterile filtrata soluzione di glucosio al 20% in acqua distillata <br /><br /></li><li> Assicurati di spruzzare tutte le bottiglie con il 70% di etanolo prima di metterli nel cofano. <br /><br /></li></ul></li><li> Prendete queste soluzioni congelato dal freezer e metterli in un bagno di acqua riscaldata: <ul><li> Un&#39;aliquota di 5 ml di siero di cavallo </li><li> A 1 ml di aliquota B-27 supplemento </li><li> A 1 ml di aliquota 100X antibiotico (penicillina più streptomicina) </li><li> E di 0,5 ml aliquota di L-glutammina </li></ul></li><li> Dopo le soluzioni sono scongelati, li tolga dal bagno d&#39;acqua, spruzzi giù con il 70% di etanolo, e metterli nel cofano. Ora il medium placcatura e Neurobasal possono essere preparati. </li><li> Dopo le soluzioni sono preparate, tappo i contenitori ermeticamente e metterli nella vasca 37 ° C per riscaldarsi durante l&#39;esecuzione l&#39;isolamento dell&#39;ippocampo. </li><li> Inoltre, prendere una aliquota della proteasi tripsina (2,5%) dal freezer e metterlo in bagno d&#39;acqua. Tripsina sarà digerire l&#39;ippocampo sezionato, che sarà isolato nella fase successiva. </li><li> Prendete un tubo 15ml conica, riempirlo con HBSS, e l&#39;etichetta con il gruppo di trattamento. E &#39;qui che isolato dell&#39;ippocampo saranno raccolti nella fase successiva. </li></ol><p class="jove_step"> Isolamento dell&#39;ippocampo </p><ol><li> Per iniziare l&#39;isolamento dell&#39;ippocampo, assicurarsi che i cuccioli appena nati sono pulite e hanno avuto la loro band il latte, placente e cordoni ombelicali rimosso dalla madre. </li><li> Posizionare i cuccioli in piastre di Petri, spruzzare con il 70% di etanolo per la pulizia, e metterli nel cofano. Gli animali sono l&#39;eutanasia immediatamente prima coltura. </li><li> Per la sterilizzazione ulteriore prendere uno cucciolo dal piatto, immergere il cucciolo in etanolo al 70%, e poi in due lavaggi di HBSS sterile. </li><li> Rimuovere la testa dal corpo con le forbici. Utilizzando le forbici stesso, tagliare attraverso la pelle e il cranio. </li><li> Utilizzando un paio di pinzette bene, la buccia del cranio di distanza dal cervello e mettere il cervello in una piccola scatola di Petri che contiene una piccola quantità di HBSS sterile. </li><li> Staccare gli emisferi cerebrali. L&#39;ippocampo è una piccola struttura a forma di cavalluccio marino nel lobo temporale mediale. </li><li> Rimuovere l&#39;ippocampo e il luogo in 3 ml di HBSS in una provetta da 15 ml. Ripetere questi passaggi con ogni cucciolo, e svolge ogni ippocampo isolato nel tubo da 15 ml. Ora, è tempo di dissociare il tessuto di singole cellule. <br /></li></ol><p class="jove_step"> Dissociazione delle cellule dell&#39;ippocampo </p><ol><li> Dopo tutto dell&#39;ippocampo sono state isolate, riempire il tubo 15 ml a 4,5 ml con HBSS. </li><li> Rimuovere la tripsina dal bagno d&#39;acqua, spruzzare con l&#39;etanolo, e posto nel cofano. Aggiungere 0,5 ml di tripsina al tubo, e incubare per 15 minuti a 37 ° C. </li><li> Nel cofano, rimuovere il HBSS / tripsina soluzione dal tubo con una pipetta sterile, facendo attenzione a non disturbare il dell&#39;ippocampo che si sono insediati sul fondo della provetta. Aggiungere 5 ml di HBSS al tubo e miscelare delicatamente. Incubare a 37 ° C per 5 minuti. </li><li> Ripetere questo passaggio due volte, la rimozione del vecchio HBSS e la sostituzione con una soluzione fresca. </li><li> Prelevare un &#39;aliquota di DNAsi I fuori dal freezer. Aggiungere 0,5 ml di DNasi al dell&#39;ippocampo HBSS in 4,5 ml. La DNAsi è aggiunto a promuovere l&#39;inattivazione dell&#39;enzima. </li><li> Triturare la soluzione (o pipetta su e giù) finché non è omogeneo. Fare attenzione a non introdurre bolle in omogenato. </li><li> Determinare la vitalità cellulare con il metodo trypan esclusione blu. </li><li> Prendete un piatto di 10 centimetri Petri contenente 6-8 vetrini, e aggiungere 10 ml di terreno placcatura. Pipettare il numero desiderato di cellule al piatto contenente il coprioggetto. Agitare delicatamente per disperdere le cellule, e assicurarsi che il coprioggetto non si sovrappongano. </li><li> Permettono alle cellule di attaccare per 2-4 ore in un umidificata a 37 ° C incubatore con 5% di CO <sub>2.</sub> Dopo aver confermato che le cellule sono vitali e hanno attaccato, trasferire i coprioggetti ai piatti singoli contenenti terreno Neurobasal. Luogo questi piatti nuovamente dentro l&#39;incubatrice. </li><li> Una volta alla settimana, sostituire un terzo del mezzo con freschi di media Neurobasal e le cure sperimentali, se necessario. Ora, le proprietà funzionali di queste cellule in coltura sono pronti per essere studiati. </li></ol><p class="jove_step"> Fura-2 Imaging di calcio di neuroni dell&#39;ippocampo </p><ol><li> Dopo colture di neuroni dell&#39;ippocampo sono state <em>in vitro</em> per 48 ore (ma non prima), gli esperimenti di imaging di calcio può avere inizio. A questo punto, questi neuroni dovrebbero avere iniziato a estendere i processi. La fascia di età ottimale per l&#39;imaging calcio è dal primo giorno <em>in vitro</em> 3 a 7. </li><li> Culture di carico con Fura-2 AM per 30 minuti a 37 ° C, dopo di che può essere ripreso sotto un obiettivo 20X usando una lampada ad arco allo xeno per eccitare il colorante indicatore di calcio e una fotocamera da 512 bit ccd, che campioni di ogni 150ms. </li></ol>

<ol>
	<li>Banker, G., Goslin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> <em style='font-style: italic'>Culturing Nerve Cells, 2nd Edition</em>. , (1998).</li></ol>

<p> Questo protocollo è stato sviluppato come una modifica del lavoro seminale di Gary Banker e Kim Goslin <sup>1.</sup> Questo libro è una risorsa essenziale per chiunque sia interessato a cellule di coltura - non solo il neurone arricchito di culture descritte nel protocollo corrente. </p><p> I tre fattori più critici nella coltura delle cellule sono: la sterilità, la velocità, la scelta del mezzo utilizzato. </p><p> <strong>Sterilità</strong> - un flusso laminare / cappa sterile, condizioni asettiche, e una sterile incubatore sono obbl...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Antibiotic antimitotic</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15240062</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>B-27 Supplement</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>17504044</td>
<td>Serum free</td>
</tr>
<tr>
<td>Boric Acid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>B6768</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dnase I</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>DN25</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fura-2, AM cell permeant</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Probes</td>
<td>F1221</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glucose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G7528</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HBSS (10X)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>14185052</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HEPES</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15630080</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-Glutamine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G7513</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>51200038</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Neurobasal</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>12348017</td>
<td>Without phenol red</td>
</tr>
<tr>
<td>Poly-L-Lysine Hydrobromide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P6282</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pyruvic Acid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P2256</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium Pyruvate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P2256</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium Tetraborate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trypsin, 2.5% (10X)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15090046</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>
	

primary culture of hippocampal neurons from p0 newborn rats

<p class="jove_content">Le proprietà fisiologiche dei neuroni dell&#39;ippocampo sono comunemente indagati, soprattutto per il coinvolgimento dell&#39;ippocampo nell&#39;apprendimento e nella memoria. Primaria coltura delle cellule dell&#39;ippocampo neuroscienziati permette di esaminare le attività e le proprietà dei neuroni in singole cellule e del livello singola sinapsi. In questo video ci dimostra come isolare e coltivare cellule primarie di ippocampo di ratti neonati. L&#39;ippocampo possono essere isolati gli uni dagli animali appena nati nel più breve 2-3 minuti, e le culture può essere mantenuta per un massimo di due settimane. Ci sarà anche brevemente illustrare come utilizzare questi neuroni dell&#39;ippocampo per l&#39;imaging di calcio raziometrico. Anche se questo protocollo descrive il processo per l&#39;ippocampo, con poca o nessuna modifica, può essere applicato ad altre regioni del cervello.</p>

Watch this Scientific Journal Video about Primary Culture of Hippocampal Neurons from P0 Newborn Rats at JoVE.com

Primary Culture of Hippocampal Neurons from P0 Newborn Rats

<p class="jove_content">La dissezione e la crescita delle cellule da una zona del cervello individuale facilita l&#39;investigazione dei parametri cellulari e fisiologici. Descriviamo un metodo per la coltura di cellule primarie che produce neurone arricchito di culture in un ambiente privo di siero.</p>

Cultura primaria di neuroni dell&#39;ippocampo da P0 ratti neonati

The physiological properties of hippocampal neurons are commonly investigated, especially because of the involvement of the hippocampus in learning and ...

primary-culture-of-hippocampal-neurons-from-p0-newborn-rats

Research

JoVE Journal

Biology

76.3K Views.  Michigan State University (MSU). La dissezione e la crescita delle cellule da una zona del cervello individuale facilita l'investigazione dei parametri cellulari e fisiologici. Descriviamo un metodo per la coltura di cellule primarie che produce neurone arricchito di culture in un ambiente privo di siero.