Ringraziamo Harald Hutter e Helena Decker per la loro attenta lettura di questo manoscritto. Ringraziamo anche Reg. Sidhu di Leica Microsystems per la sua competenza tecnica. Questa ricerca è stata sostenuta dalla Scienze e Ingegneria del Consiglio Nazionale del Canada, Premio # 327100-06, e la Simon Fraser Facoltà Universitaria di Scienze.

Parte 1: Transfection dei neuroni utilizzando Lipofectamine 2000 (Invitrogen) Attrezzature di set-up: Neuroni dell&#39;ippocampo di ratto o il mouse sono coltivate secondo Kaech e banchiere, 2006 [4]. La densità tipica cellula usata per trasfezioni è di 250.000 piatto cells/6-cm. Reagenti necessari e le attrezzature includono 50 acido kynurenic mM, regolare titolare tubo da banco, un dispositivo di raffreddamento da banco (meglio per mantenere freddo Lipofectamine reagenti), Reagente Lipofectamine, MEM, tubi microcentrifuga, micropipetters e pinza sterile. Procedimento: <ol><li> Per ogni etichetta trasfezione due provette da 1,5 ml, uno per contenere il DNA plasmidico, uno per contenere i reagenti di trasfezione. Le incubazioni seguenti possono avvenire a temperatura ambiente. <ol><li> Combina 1,0 mg di DNA plasmidico con 100 microlitri MEM in una provetta (senza supplementi di qualsiasi tipo; MEM non ha bisogno di essere temperatura di pH equilibrato). </li><li> Combina 6,0 microlitri Lipofectamine con 100 microlitri MEM negli altri 1,5 ml tubo. <ol><li> Nessuna rettifica per trasfezioni doppie sono necessari anche se la Lipofectamine: rapporto di DNA saranno dimezzati in questi casi. Il rapporto tra Lipofectamine: il DNA è ancora entro il suggerimento del produttore. E &#39;meglio verificare 0,5-1,0 mg per ogni plasmide per l&#39;espressione ottimale. </li><li> Per preservare la durata di conservazione del reattivo Lipofectamine, dovrebbe essere rimosso dal frigorifero per il minor tempo possibile e posto in un dispositivo di raffreddamento da banco, quando non in uso. Tempo totale dal frigorifero dovrebbe essere ridotto al minimo. </li></ol></li></ol></li><li> Incubare le provette per 5 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Trasferire il DNA in-MEM soluzione nel tubo di lipidi, e mescolare delicatamente con una pipetta, poi incubare per 30 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Dopo 25 minuti, prima coprioggetto flipping, aggiungere 60 ml di 50 mM acido kynurenic per minimizzare i danni excitoxic al piatto di neuroni in coltura. <ol><li> Coprioggetto con attenzione capovolgere piedi-side-up con pinza sterile, e organizzare in modo che non si sovrappongano. Fare attenzione a non grattare il neurone rivestita superficie del vetrino o la glia rivestita superficie del piatto. </li></ol></li><li> Di circa 0,5 ml di mezzo dai 6 cm piatto e mescolare delicatamente con il DNA in provetta, trasferire la soluzione di DNA di nuovo al piatto gocciolamento in modo uniforme sulla superficie del terreno. </li><li> Non turbolenza, ma dolcemente scivolare piatto avanti e indietro in una direzione, poi fermarsi e ripetere in direzione perpendicolare a distribuire uniformemente il DNA Lipofectamine complessi. Incubare per 90 minuti nel tessuto culturale incubatore (37 ° C, 5% CO 2). </li><li> Flip copri-piedi-side-down, e organizzare in modo che non si sovrappongano. Consenta loro di esprimere a procedere per il tempo desiderato, di solito durante la notte per 48 ore. </li></ol> Parte 2: immagini dal vivo di GFP-tagged densi-core vescicole in colture di neuroni dell&#39;ippocampo Attrezzature di set-up: <ol><li> Imaging di cellule vive richiede un microscopio a fluorescenza dotato di una fotocamera CCD, usiamo un microscopio invertito Leica DMI 6000B equipaggiato con la variabile Leica, lampada fluorescente. C&#39;è bisogno anche di una camera di imaging con regolatore di temperatura e un riscaldatore obiettivo. Usiamo il Warner Instruments RC-21BR modificato per un 18 mm coprioggetto oltre ad un riscaldatore piattaforma (cat. # PH2) e controllo della temperatura (cat. # TC324B). La camera non contiene le porte aperte, una modifica che può essere incluso al momento dell&#39;ordine della camera. Un riscaldatore obiettivo è altamente consigliato per aiutare a mantenere la temperatura del coprioggetto e minimizzare le modifiche a fuoco a causa di fluttuazioni di temperatura. Le immagini sono acquisite con un Hamamatsu Orca-ER utilizzando Metamorph (Molecular Devices), software, tra cui la modalità &#39;streaming&#39; di acquisizione drop-in. Nota-Non usiamo una camera climatica che racchiude l&#39;intero microscopio. Tale aggiunta è costosa e non necessaria per il breve termine di imaging descritto qui. </li><li> Altre attrezzature e reagenti sono appena terreno preparato immagini dal vivo (1X Hanks con Ca 2 + e Mg 2 +, glucosio 0,6%, e HEPES 10mM), ulteriori 18 mm coprioggetto di vetro, pinza sterile, non sterile pinze, Kimwipes, grasso vuoto , e una siringa (senza ago o con modificato ampio tunnel ago) con cui ingrassare. </li></ol> Procedimento: <ol><li> Preparare fresca medio vivere per immagini (1X Hanks con Ca 2 + e Mg 2 +, glucosio 0,6%, e HEPES 10mM). Noi di solito preparare 50mls alla volta e conservare a 4 ° C quando non in uso. La cosa migliore è prepararsi a sufficienza per non più di una settimana alla volta. ML circa 5-10 vengono utilizzati per ogni piatto di neuroni. </li><li> Avviare microscopio, macchina fotografica, lampada fluorescente, e acquisizione di software immagine. Anche accendere alla piattaforma da camera e riscaldatori obiettivo. </li><li> Preparare la immaginag camera. <ol><li> La camera di Warner include un inserto in teflon per il montaggio di coprioggetto. Per la facilità di manipolazione, etichetta un lato della &quot;top&quot; inserire con un pennarello indelebile. </li><li> Applicare un anello di grasso al solco che circonda il buco nel lato della camera etichetta &quot;top&quot;. Evitare di utilizzare l&#39;eccesso come sarà entrare nella camera e ridurre l&#39;area osservabile. </li><li> Utilizzando pinze, allegare un ambiente pulito, inutilizzati da 18 centimetri coprioggetto al lato &quot;top&quot; della camera, applicare una leggera pressione al coprioggetto ai bordi per creare una perfetta tenuta nel solco incasso della camera. </li><li> Girare la camera di sopra e applicare un anello simile di grasso nella scanalatura sul lato opposto (in basso) lato della camera. </li><li> Mettere il preparato camera-basso verso l&#39;alto, sul coperchio di un tubo da 50 ml, che è un titolare camera ideale. </li><li> Aggiungere 750 ml di medium di imaging per la camera. Si tratta di una quantità eccessiva, ma il grasso dovrebbe impedire il terreno dalla traboccanti e l&#39;eccesso aiuterà a prevenire le bolle di essere intrappolati quando la cella coperto coprioggetto viene applicato. </li><li> Mantenere la camera preparata nel tessuto culturale incubatore fino al momento dell&#39;uso. Incubazioni prolungate, ~ 1 ora dovrebbe essere evitato come mezzo di imaging evaporerà e il cambiamento nella composizione. </li></ol></li><li> Eseguire l&#39;assemblaggio finale da camera e l&#39;imaging cellulare dal vivo. <ol><li> Spostare la camera preparata e un piatto di coprioggetto transfettate dal termostato alla cappa coltura dei tessuti. </li><li> L&#39;assemblaggio finale della camera deve essere eseguito rapidamente per garantire le cellule rimangono immersi nel medio e a 37 ° C in continuo. </li><li> Utilizzando pinza sterile, rimuovere con attenzione uno coprioggetto dal piatto transfettate, toccare il bordo del vetrino ad un Kimwipe ad allontanarsi mezzo di crescita. </li><li> Posizionare il coprioggetto neurone-side-down verso la camera di preparazione. Toccare un lato del coprioggetto per il grasso prima e fare pressione sui bordi per portare il coprioggetto piatto senza bolle cattura. Medio di imaging in eccesso si riverserà come previsto. </li><li> Rimuovere l&#39;eccesso medio di imaging, ma attenzione a non scivolare i coprioggetti fuori posizione. </li><li> Spostare la camera di pre-riscaldato riscaldatore piattaforma e fissare la camera in posizione. </li><li> Trasferimento della camera sul palco. </li><li> Per ridurre photobleaching e photoxicity, regolare la lampada per la quantità minima di intensità necessario trovare cellule transfettate. </li><li> Trova una cella di interesse con un obiettivo di petrolio a basso ingrandimento (40X). È bene attenersi a un modello di ricerca previste per garantire la copertura massima coprioggetto ed evitare acquisizioni di immagini ridondanti, ad esempio, in alto a sinistra del coprioggetto, scansione su e giù di lavoro a destra. </li><li> Passare a un obiettivo alto olio ingrandimento (60-100x) una volta al campo desiderato è stato individuato. </li><li> Usare &quot;acquisizione stream&quot; o funzione analoga del software di imaging per registrare un video della dinamica della proteina fluorescente-etichettati. </li><li> Prendete una immagine di fase e altre immagini di accompagnamento (ad esempio, GFP solubile) per una successiva analisi e la presentazione. </li><li> Salva tutte le immagini prima di esplorare ulteriormente il coprioggetto e registrare il video successivo. </li><li> Tipicamente 3-5 video da un coprioggetto è considerata riuscita. Fototossicità e la salute delle cellule generale dovrebbe essere tenuto a mente come il trasporto viene ridotta nelle cellule danneggiate. La salute delle cellule può essere monitorato attraverso l&#39;osservazione al microscopio di fase. Generalmente le registrazioni vengono eseguite per circa 30 minuti per coprioggetto. </li></ol></li></ol> Parte 3: Risultati Rappresentante: Osservazioni dal vivo imaging cellulare consistono tipicamente di video (anche conosciuto come &quot;stack&quot; di immagini) che mostrano il movimento di organelli fluorescente-tag all&#39;interno del campo di vista (Figura 1A). Che accompagna ogni video sono spesso di supporto delle immagini che illustrano l&#39;orientamento del campo visivo rispetto alle cellule del corpo, il livello di espressione proteica e / o la salute della cellula. Video di trasporto può essere sottoposto ad analisi quantitativa per la trasformazione in kymographs (Figura 1B). Kymographs sono immagini che illustrano il movimento delle particelle per giustapposizione di scansioni linea in cui è rappresentata ogni volta da un punto di colonna nella chimografo. La Figura 2 mostra come due particelle che si muovono in direzione opposta sono rappresentati in un chimografo. Ulteriori analisi di kymographs in grado di fornire informazioni su flusso di particelle, velocità, lunghezza corsa, inversioni e particelle stazionarie. <img src="/files/ftp_upload/1144/fig1.jpg" alt="" /> Figura 1. Rappresentante vivo cellulare Osservazioni Imaging. (A) dei fotogrammi selezionati da un video di mCherry-tagged attivatore tissutale del plasminogeno (TPA) di trasporto. Singole particelle in movimento nella anterograda (frecce verdi) e retrograda (frecce rosse) sono indicate le direzioni. (B) Kymographs illustrando TPA-mCherry movimento nelassone. Le linee orizzontali in kymographs rappresentano oggetti stazionari, mentre le linee diagonali rappresentano gli organelli abbandonando (pendenza positiva) o verso (pendenza negativa) il corpo cellulare. Le frecce lunghe verde e rosso mostrano i percorsi corrispondenti alle particelle (A). I cambiamenti nel trasporto a causa del reagente depolimerizzazione microtubuli, nocodazole, è illustrato con una chimografo. Si noti la riduzione organelli in movimento per l&#39;assenza di linee diagonali.

<ol>
	<li>Kulic, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+microtubule+movement+in+bidirectional+organelle+transport.">The role of microtubule movement in bidirectional organelle transport.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (29), 10011-10016 (2008).</li><li>Jacobson, C., Schnapp, B., Banker, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+change+in+the+selective+translocation+of+the+Kinesin-1+motor+domain+marks+the+initial+specification+of+the+axon.">A change in the selective translocation of the Kinesin-1 motor domain marks the initial specification of the axon.</a> Neuron. 49 (6), 797-804 (2006).</li><li>Barkus, R. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+an+Axonal+Kinesin-3+Motor+for+Fast+Anterograde+Vesicle+Transport+that+Facilitates+Retrograde+Transport+of+Neuropeptides.">Identification of an Axonal Kinesin-3 Motor for Fast Anterograde Vesicle Transport that Facilitates Retrograde Transport of Neuropeptides.</a> Mol Biol Cell. 19 (1), 274-283 (2008).</li><li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+hippocampal+neurons.">Culturing hippocampal neurons.</a> Nat Protoc. 1 (5), 2406-2415 (2006).</li></ol>

L&#39;imaging cellulare dal vivo è una tecnica difficile, ma potente per l&#39;osservazione diretta del trasporto degli organelli nei neuroni in coltura. Le difficoltà possono sorgere a monte della procedura con la salute dei neuroni poveri a causa di complicazioni cultura. Di conseguenza, la salute delle cellule (per esempi vedi rif. 4) deve essere valutata prima e dopo la trasfezione osservando i coprioggetti mentre nel mezzo di crescita mediante una cultura microscopio dei tessuti leggeri. Il processo di trasferime...

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David M. Kwinter, Michael A. Silverman

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David Kwinter, Michael Silverman.

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Erratum: Live Imaging of Dense-core Vesicles in Primary Cultured Hippocampal Neurons.

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<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>MEM-Eagle with Earle salts and L-glutamine</td>
<td>Reagent</td>
<td>Mediatech</td>
<td>10-010-CV</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lipofectamine 2000</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11668-027</td>
<td>Transfection reagent</td>
</tr>
<tr>
<td>10X Hanks with Ca2+ and Mg2+</td>
<td>Reagent</td>
<td>Gibco/Invitrogen</td>
<td>14185-052</td>
<td>Live-imaging medium</td>
</tr>
<tr>
<td>1M HEPES</td>
<td>Reagent</td>
<td>Gibco/Invitrogen</td>
<td>15630-130</td>
<td>Live-imaging medium</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

live imaging of dense-core vesicles in primary cultured hippocampal neurons

L&#39;osservazione e la caratterizzazione dinamica dei processi cellulari può fornire informazioni importanti sulle attività cellulare che non possono essere acquisite immagini statiche. Vital sonde fluorescenti, in particolare proteina fluorescente verde (GFP) hanno rivoluzionato la biologia delle cellule che derivano dalla capacità di etichetta specifici comparti intracellulari e strutture cellulari. Per esempio, l&#39;immagine dal vivo di GFP (e le sue varianti spettrale) chimere hanno permesso un&#39;analisi dinamica del citoscheletro, il trasporto degli organelli, e le dinamiche della membrana in una moltitudine di organismi e di tipi di cellule [1-3]. Sebbene l&#39;imaging dal vivo è diventata prevalente, questo approccio pone ancora molti problemi tecnici, in particolare nella scuola primaria neuroni coltivati. Una sfida è l&#39;espressione di proteine ​​GFP-tagged in post-mitotico neuroni, l&#39;altro è la capacità di catturare immagini a fluorescenza, riducendo al minimo fototossicità, photobleaching, e mantenere la salute generale delle cellule. Qui forniamo un protocollo che descrive un metodo a base di lipidi transfezione che produce un tasso di trasfezione relativamente basso (~ 0,5%), è tuttavia ideale per l&#39;imaging di neuroni completamente polarizzata. Un tasso di trasfezione basso è essenziale in modo che gli assoni e dendriti singolo può essere caratterizzato da loro orientamento verso il corpo cellulare per confermare la direzionalità di trasporto, cioè, anterograda v. retrograda. Il nostro approccio all&#39;imaging GFP che esprimono i neuroni si basa su uno standard a grande campo microscopio a fluorescenza equipaggiato con una telecamera CCD, software per la cattura delle immagini, e una camera di imaging riscaldata. Abbiamo immaginato una grande varietà di organelli o strutture, ad esempio, densi-core vescicole, mitocondri, coni di crescita, e actina senza ottica o esigenze particolari di eccitazione che non sia un fonte di luce fluorescente. Inoltre, spettralmente-distinte, proteine ​​fluorescente, ad esempio, GFP-tagged DsRed e proteine, possono essere visualizzati simultaneamente vicino a caratterizzare co-trasporto o altri eventi coordinati cellulare. L&#39;approccio di imaging qui descritto è flessibile per una varietà di applicazioni di imaging e può essere adottata da un laboratorio per il costo relativamente poco fornito un microscopio è disponibile.

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Live Imaging of Dense-core Vesicles in Primary Cultured Hippocampal Neurons

L&#39;imaging cellulare Live è di particolare utilità quando si studiano le dinamiche del traffico di organelli. Qui si descrive un protocollo per l&#39;imaging dal vivo di denso-core vescicole in neuroni coltivati ​​con grande campo microscopia a fluorescenza. Questo protocollo è flessibile e può essere adattato a organelli altra immagine come i mitocondri, endosomi e perossisomi.

Immagini dal vivo di Dense-core Vescicole nella Primaria neuroni coltivati ​​ippocampale

Observing and characterizing dynamic cellular processes can yield important information about cellular activity that cannot be gained from static images.  ...

live-imaging-dense-core-vesicles-primary-cultured-hippocampal

Research

JoVE Journal

Biology

12.5K Views.  Simon Fraser University. L'imaging cellulare Live è di particolare utilità quando si studiano le dinamiche del traffico di organelli. Qui si descrive un protocollo per l'imaging dal vivo di denso-core vescicole in neuroni coltivati ​​con grande campo microscopia a fluorescenza. Questo protocollo è flessibile e può essere adattato a organelli altra immagine come i mitocondri, endosomi e perossisomi.

Video: Live Imaging of Dense-core Vesicles in Primary Cultured Hippocampal Neurons

Gene-gun Transfection of Hippocampal Neurons

Gene-gun trasfezione di neuroni dell&#39;ippocampo

Ricerca

Biologia

Primary Culture of Hippocampal Neurons from P0 Newborn Rats

The physiological properties of hippocampal neurons are commonly investigated, especially because of the involvement of the hippocampus in learning and memory. Primary hippocampal cell culturing allows neuroscientists to examine the activity and properties of neurons at the individual cell and single synapse level. In this video, we will demonstrate how to isolate and grow primary hippocampal cells from newborn rats. The hippocampus may be isolated from each newborn animal in as short as 2 to 3 minutes, and the cultures can be maintained for up to two weeks. We will also briefly demonstrate how to use these hippocampal neurons for ratiometric calcium imaging. While this protocol describes the process for the hippocampus, with little to no modification, it can be applied to other regions of the brain.

The dissection and growth of cells from an individual brain area facilitates investigation of cellular and physiological parameters. We describe a method for primary cell culturing that produces neuron-enriched cultures in a serum-free environment.

Cultura primaria di neuroni dell&#39;ippocampo da P0 ratti neonati

The physiological properties of hippocampal neurons are commonly investigated, especially because of the involvement of the hippocampus in learning and ...

Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily accessible at all stages of development. Moreover, their optical clarity allows high resolution imaging of cell and molecular dynamics in the natural environment of the intact embryo. We are using a live imaging approach to analyze cell behaviors during neural crest cell migration and the outgrowth and guidance of neuronal axons.
Live imaging is particularly useful for understanding mechanisms that regulate cell motility processes. To visualize details of cell motility, such as protrusive activity and molecular dynamics, it is advantageous to label individual cells. In zebrafish, plasmid DNA injection yields a transient mosaic expression pattern and offers distinct benefits over other cell labeling methods. For example, transgenic lines often label entire cell populations and thus may obscure visualization of the fine protrusions (or changes in molecular distribution) in a single cell. In addition, injection of DNA at the one-cell stage is less invasive and more precise than dye injections at later stages.
Here we describe a method for labeling individual developing neurons or neural crest cells and imaging their behavior in vivo. We inject plasmid DNA into 1-cell stage embryos, which results in mosaic transgene expression. The vectors contain cell-specific promoters that drive expression of a gene of interest in a subset of sensory neurons or neural crest cells. We provide examples of cells labeled with membrane targeted GFP or with a biosensor probe that allows visualization of F-actin in living cells1.
Erica Andersen, Namrata Asuri, and Matthew Clay contributed equally to this work.

This protocol describes imaging of individual neurons or neural crest cells in living zebrafish embryos. This method is used to examine cellular behaviors and actin localization using fluorescence confocal time-lapse microscopy.

Immagini dal vivo della motilità cellulare e citoscheletro dei singoli neuroni e cellule della cresta neurale in embrioni di zebrafish

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily ...

Adenovirus-mediated Genetic Removal of Signaling Molecules in Cultured Primary Mouse Embryonic Fibroblasts

The ability to genetically remove specific components of various cell signalling cascades has been an integral tool in modern signal transduction analysis. One particular method to achieve this conditional deletion is via the use of the Cre-loxP system. This method involves flanking the gene of interest with loxP sites, which are specific recognition sequences for the Cre recombinase protein. Exposure of the so-called floxed (flanked by loxP site) DNA to this enzyme results in a Cre-mediated recombination event at the loxP sites, and subsequent excision of the intervening gene3. Several different methods exist to administer Cre recombinase to the site of interest. In this video, we demonstrate the use of an adenovirus containing the Cre recombinase gene to infect primary mouse embryonic fibroblasts (MEFs) obtained from embryos containing a floxed Rac1 allele1. Our rationale for selecting Rac1 MEFs for our experiments is that clear morphological changes can be seen upon deletion of Rac1, due to alterations in the actin cytoskeleton2,5. 72 hours following viral transduction and Cre expression, cells were stained using the actin dye phalloidin and imaged using confocal laser scanning microscopy. It was observed that MEFs which had been exposed to the adeno-Cre virus appeared contracted and elongated in morphology compared to uninfected cells, consistent with previous reports2,5. The adenovirus method of Cre recombinase delivery is advantageous as the adeno-Cre virus is easily available, and gene deletion via Cre in nearly 100% of the cells can be achieved with optimized adenoviral infection.

In this video we use an adenovirus carrying the Cre recombinase gene to infect primary mouse embryonic fibroblasts carrying a floxed Rac1 allele.

Adenovirus-mediata rimozione genetica di molecole di segnalazione in fibroblasti di topo coltivate primarie embrionali

The ability to genetically remove specific components of various cell signalling cascades has been an integral tool in modern signal transduction ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to replenish depleted endoplasmic reticulum (ER) or sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ stores1,2. Since Ca2+ is a ubiquitous second messenger, it is not surprising to see that SOCE plays important roles in a variety of cellular processes, including proliferation, apoptosis, gene transcription and motility. Due to its wide occurrence in nearly all cell types, including epithelial cells and skeletal muscles, this pathway has received great interest3,4. However, the heterogeneity of SOCE characteristics in different cell types and the physiological function are still not clear5-7.
The functional channel properties of SOCE can be revealed by patch-clamp studies, whereas a large body of knowledge about this pathway has been gained by fluorescence-based intracellular Ca2+ measurements because of its convenience and feasibility for high-throughput screening. The objective of this report is to summarize a few fluorescence-based methods to measure the activation of SOCE in monolayer cells, suspended cells and muscle fibers5,8-10. The most commonly used of these fluorescence methods is to directly monitor the dynamics of intracellular Ca2+ using the ratio of F340nm and F380nm (510 nm for emission wavelength) of the ratiometric Ca2+ indicator Fura-2. To isolate the activity of unidirectional SOCE from intracellular Ca2+ release and Ca2+ extrusion, a Mn2+ quenching assay is frequently used. Mn2+ is known to be able to permeate into cells via SOCE while it is impervious to the surface membrane extrusion processes or to ER uptake by Ca2+ pumps due to its very high affinity with Fura-2. As a result, the quenching of Fura-2 fluorescence induced by the entry of extracellular Mn2+ into the cells represents a measurement of activity of SOCE9. Ratiometric measurement and the Mn+2 quenching assays can be performed on a cuvette-based spectrofluorometer in a cell population mode or in a microscope-based system to visualize single cells. The advantage of single cell measurements is that individual cells subjected to gene manipulations can be selected using GFP or RFP reporters, allowing studies in genetically modified or mutated cells. The spatiotemporal characteristics of SOCE in structurally specialized skeletal muscle can be achieved in skinned muscle fibers by simultaneously monitoring the fluorescence of two low affinity Ca2+ indicators targeted to specific compartments of the muscle fiber, such as Fluo-5N in the SR and Rhod-5N in the transverse tubules9,11,12.

The extent of store-operated Ca2+ entry (SOCE) can be monitored using fluorescent Ca2+ indicators. Mn2+ quenching of such indicators assays SOCE in cultured cells and skeletal muscle fibers. A technique allowing spatial and temporal resolution of SOCE by confocal imaging of mechanically skinned muscle fibers is also described.

Basato sulla fluorescenza Misura Store-Entry operato di calcio in cellule vive: dal Cancer Cell coltura per fibra muscolare scheletrica

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental conditions and an intracellular environment that is tightly packed, sticky, and hazardous to protein stability1. The ability to dynamically balance protein production, folding and degradation demands highly-specialized quality control machinery, whose absolute necessity is observed best when it malfunctions. Diseases such as ALS, Alzheimer's, Parkinson's, and certain forms of Cystic Fibrosis have a direct link to protein folding quality control components2, and therefore future therapeutic development requires a basic understanding of underlying processes. Our experimental challenge is to understand how cells integrate damage signals and mount responses that are tailored to diverse circumstances.
The primary reason why protein misfolding represents an existential threat to the cell is the propensity of incorrectly folded proteins to aggregate, thus causing a global perturbation of the crowded and delicate intracellular folding environment1. The folding health, or "proteostasis," of the cellular proteome is maintained, even under the duress of aging, stress and oxidative damage, by the coordinated action of different mechanistic units in an elaborate quality control system3,4. A specialized machinery of molecular chaperones can bind non-native polypeptides and promote their folding into the native state1, target them for degradation by the ubiquitin-proteasome system5, or direct them to protective aggregation inclusions6-9.
In eukaryotes, the cytosolic aggregation quality control load is partitioned between two compartments8-10: the juxtanuclear quality control compartment (JUNQ) and the insoluble protein deposit (IPOD) (Figure 1 - model). Proteins that are ubiquitinated by the protein folding quality control machinery are delivered to the JUNQ, where they are processed for degradation by the proteasome. Misfolded proteins that are not ubiquitinated are diverted to the IPOD, where they are actively aggregated in a protective compartment.
Up until this point, the methodological paradigm of live-cell fluorescence microscopy has largely been to label proteins and track their locations in the cell at specific time-points and usually in two dimensions. As new technologies have begun to grant experimenters unprecedented access to the submicron scale in living cells, the dynamic architecture of the cytosol has come into view as a challenging new frontier for experimental characterization. We present a method for rapidly monitoring the 3D spatial distributions of multiple fluorescently labeled proteins in the yeast cytosol over time. 3D timelapse (4D imaging) is not merely a technical challenge; rather, it also facilitates a dramatic shift in the conceptual framework used to analyze cellular structure.
We utilize a cytosolic folding sensor protein in live yeast to visualize distinct fates for misfolded proteins in cellular aggregation quality control, using rapid 4D fluorescent imaging. The temperature sensitive mutant of the Ubc9 protein10-12 (Ubc9ts) is extremely effective both as a sensor of cellular proteostasis, and a physiological model for tracking aggregation quality control. As with most ts proteins, Ubc9ts is fully folded and functional at permissive temperatures due to active cellular chaperones. Above 30 &deg;C, or when the cell faces misfolding stress, Ubc9ts misfolds and follows the fate of a native globular protein that has been misfolded due to mutation, heat denaturation, or oxidative damage. By fusing it to GFP or other fluorophores, it can be tracked in 3D as it forms Stress Foci, or is directed to JUNQ or IPOD.

Cellular viability depends on timely and efficient management of protein misfolding. Here we describe a method for visualizing the different potential fates of a misfolded protein: refolding, degradation, or sequestration in inclusions. We demonstrate the use of a folding sensor, Ubc9ts, for monitoring proteostasis and aggregation quality control in live cells using 4D microscopy.

4D Imaging di aggregazione proteica in cellule vive

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

Vivere Imaging di apoptotica delle cellule libera nel corso<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriogenesi

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Organelle Transport in Cultured Drosophila Cells: S2 Cell Line and Primary Neurons.

Drosophila S2 cells plated on a coverslip in the presence of any actin-depolymerizing drug form long unbranched processes filled with uniformly polarized microtubules. Organelles move along these processes by microtubule motors. Easy maintenance, high sensitivity to RNAi-mediated protein knock-down and efficient procedure for creating stable cell lines make Drosophila S2 cells an ideal model system to study cargo transport by live imaging. The results obtained with S2 cells can be further applied to a more physiologically relevant system: axonal transport in primary neurons cultured from dissociated Drosophila embryos. Cultured neurons grow long neurites filled with bundled microtubules, very similar to S2 processes. Like in S2 cells, organelles in cultured neurons can be visualized by either organelle-specific fluorescent dyes or by using fluorescent organelle markers encoded by DNA injected into early embryos or expressed in transgenic flies. Therefore, organelle transport can be easily recorded in neurons cultured on glass coverslips using living imaging. Here we describe procedures for culturing and visualizing cargo transport in Drosophila S2 cells and primary neurons. We believe that these protocols make both systems accessible for labs studying cargo transport.

Organelle Transport in Cultured Drosophila Cells: S2 Cell Line and Primary Neurons.

Drosophila S2 cells and cultured neurons are great systems for imaging of motor-driven organelle transport in vivo. Here we describe detailed protocols for culturing both cell types, their imaging and analysis of transport.

Organelle Trasporti in Colta<em&gt; Drosophila</em&gt; Celle: Cell Line S2 e Primaria neuroni.

Drosophila S2 cells plated on a coverslip in the presence of any actin-depolymerizing drug form long unbranched processes filled with uniformly polarized ...

Visualization of G3BP Stress Granules Dynamics in Live Primary Cells

SGs can be visualized in cells by immunostaining of specific protein components or polyA+ mRNAs. SGs are highly dynamic and the study of their assembly and fate is important to understand the cellular response to stress. The deficiency in key factors of SGs like G3BP (RasGAP SH3 domain Binding Protein) leads to developmental defects in mice&#160;and alterations of the Central Nervous System. To study the dynamics of SGs in cells from an organism, one can culture primary cells and follow the localization of a transfected tagged component of SGs. We describe time-lapse experiment to observe G3BP1-containing SGs in Mouse Embryonic Fibroblasts (MEFs). This technique can also be used to study G3BP-containing SGs in live neurons, which is crucial as it was recently shown that these SGs are formed at the onset of neurodegenerative diseases like Alzheimer&#39;s disease. This approach can be adapted to any other cellular body and granule protein component, and performed with transgenic animals, allowing the live study of granules dynamics for example in the absence of a specific factor of these granules.

Stress granules (SGs) are cytoplasmic RNA granules containing stalled ribonucleoprotein particles (RNPs), and important in cellular response to various stresses. Dynamics of SGs can be followed in live cells by visualizing the localization of a tagged component of SGs in transfected primary cells after stress.

Visualizzazione dei G3BP stress Granuli Dynamics in cellule primarie in diretta

SGs can be visualized in cells by immunostaining of specific protein components or polyA+ mRNAs. SGs are highly dynamic and the study of their assembly ...

Live Cell Imaging of Primary Rat Neonatal Cardiomyocytes Following Adenoviral and Lentiviral Transduction Using Confocal Spinning Disk Microscopy

Primary rat neonatal cardiomyocytes are useful in basic in vitro cardiovascular research because they can be easily isolated in large numbers in a single procedure. Due to advances in microscope technology it is relatively easy to capture live cell images for the purpose of investigating cellular events in real time with minimal concern regarding phototoxicity to the cells. This protocol describes how to take live cell timelapse images of primary rat neonatal cardiomyocytes using a confocal spinning disk microscope following lentiviral and adenoviral transduction to modulate properties of the cell. The application of two different types of viruses makes it easier to achieve an appropriate transduction rate and expression levels for two different genes. Well focused live cell images can be obtained using the microscope&#8217;s autofocus system, which maintains stable focus for long time periods. Applying this method, the functions of exogenously engineered proteins expressed in cultured primary cells can be analyzed. Additionally, this system can be used to examine the functions of genes through the use of siRNAs as well as of chemical modulators.

This protocol describes a method of live cell imaging using primary rat neonatal cardiomyocytes following lentiviral and adenoviral transduction using confocal spinning disk microscopy. This enables detailed observations of cellular processes in living cardiomyocytes.

Imaging cellulare dal vivo di primaria ratto neonato Cardiomyocytes seguito Adenoviral e lentivirali trasduzione Uso confocale Spinning Disk Microscopia

Primary rat neonatal cardiomyocytes are useful in basic in vitro cardiovascular research because they can be easily isolated in large numbers in a single ...

Immagini dal vivo di Dense-core Vescicole nella Primaria neuroni coltivati ​​ippocampale

Immagini dal vivo di Dense-core Vescicole nella Primaria neuroni coltivati ippocampale