in-vivo-detection-protein-protein-interactions-on-micro-patterned

<em>In-vivo</em> Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

Unraveling the interaction network of molecules in-vivo is key to understanding the mechanisms that regulate cell function and metabolism. A multitude of ...

Johannes Kepler Universitat Linz

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We have recently devised a method to quantify interactions between a membrane protein ("bait") and a fluorophore-labeled protein ("prey") directly in the live-cell plasma membrane (Schwarzenbacher et al. Nature Methods 5:1053-1060 2008). The idea is to seed cells on surfaces containing micro-patterned antibodies against the exoplasmic domain of the bait, and monitor the co-patterning of the fluorescent prey via fluorescence microscopy. Here, we characterized the time course of bait and prey micropattern formation upon seeding the cells onto the micro-biochip. Patterns were formed immediately after contact of the cells with the surface. Cells were able to migrate over the chip surface without affecting the micropattern contrast, which remained constant over hours. On single cells, bait contrast may be subject to fluctuations, indicating that the bait can be released from and recaptured on the micropatterns. We conclude that interaction studies can be performed at any time-point ranging from 5 min to several hours post seeding. Monitoring interactions with time opens up the possibility for new assays, which are briefly sketched in the discussion section.

Temporal resolution of protein-protein interactions in the live-cell plasma membrane.

Nous avons r&#xE9;cemment mis au point une m&#xE9;thode pour quantifier les interactions entre une prot&#xE9;ine membranaire (&#xAB;app&#xE2;t&#xBB;) et une prot&#xE9;ine fluorophore marqu&#xE9; (&#xAB;proie&#xBB;) directement dans la membrane plasmatique des cellules vivantes (Schwarzenbacher et de ses m&#xE9;thodes al Nature. 5:1053-1060 2008 ). L&#x26;#39;id&#xE9;e est de cellules de semence sur des surfaces contenant des micro-textur&#xE9;es anticorps contre le domaine exoplasmique de l&#x26;#39;app&#xE2;t, et de surveiller le co-structuration de la proie fluorescente par microscopie &#xE0; fluorescence. Ici, nous avons caract&#xE9;ris&#xE9; l&#x26;#39;&#xE9;volution temporelle de l&#x26;#39;app&#xE2;t et la proie micromotif formation sur l&#x26;#39;ensemencement des cellules sur la micro-biopuce. Motifs ont &#xE9;t&#xE9; form&#xE9;s imm&#xE9;diatement apr&#xE8;s le contact des cellules avec la surface. Les cellules ont &#xE9;t&#xE9; en mesure de migrer sur la surface de la puce sans affecter le contraste micromotif, qui est rest&#xE9;e constante pendant des heures. Sur des cellules individuelles, contraste app&#xE2;t peut &#xEA;tre sujet &#xE0; des fluctuations, ce qui indique que l&#x26;#39;app&#xE2;t peut &#xEA;tre lib&#xE9;r&#xE9; de et repris sur les micropatterns. Nous concluons que les &#xE9;tudes d&#x26;#39;interaction peut &#xEA;tre effectu&#xE9;e &#xE0; n&#x26;#39;importe quel point dans le temps allant de 5 min &#xE0; l&#x26;#39;ensemencement apr&#xE8;s plusieurs heures. Suivi des interactions avec le temps ouvre la possibilit&#xE9; pour de nouveaux tests, qui sont bri&#xE8;vement esquiss&#xE9;es dans la section discussion.

R&#xE9;solution temporelle de interactions prot&#xE9;ine-prot&#xE9;ine dans la membrane plasmique des cellules vivantes

Vor kurzem haben wir eine Methode zur Quantifizierung der Interaktionen zwischen einem Membranprotein (&quot;K&ouml;der&quot;) und einem Fluorophore beschriftet Protein (&quot;Beute&quot;) direkt in der Plasmamembran Leben-Zelle entwickelt (Schwarzenbacher Et Al. Nature Methods 5:1053-1060 2008). Die Idee ist auf Saatgut Zellen auf Oberfl&auml;chen, die mit Mikro-gemustert-Antik&ouml;rpern gegen die Exoplasmic-Dom&auml;ne des K&ouml;ders und &uuml;berwacht die Co-patterning der fluoreszierenden Beute per Fluoreszenzmikroskopie. Hier wir charakterisiert den zeitlichen Verlauf des K&ouml;ders und micropat-Bildung bei der Aussaat der Zellen auf der Mikro-Biochip zum Opfer. Muster bildeten sich sofort nach dem Kontakt mit der Oberfl&auml;che der Zellen. Zellen konnten &uuml;ber die Chip-Fl&auml;che ohne Auswirkungen auf den micropat-Kontrast, der &uuml;ber Stunden konstant zu migrieren. Auf einzelne Zellen unterliegen K&ouml;der Kontrast Schwankungen, die darauf hinweist, dass der K&ouml;der entbunden und auf die Micropatterns zur&uuml;ckerobert werden kann. Wir schlie&szlig;en, dass Interaktion Studien durchgef&uuml;hrt werden k&ouml;nnen, zu jeder Zeit-Punkt zwischen 5 min. bis mehrere Stunden Post Aussaat. &Uuml;berwachung von Interaktionen mit der Zeit er&ouml;ffnet sich die M&ouml;glichkeit f&uuml;r neue Assays, die im Abschnitt kurz skizziert werden.

Zeitliche Aufl&ouml;sung von Protein-Protein-Interaktionen in der Plasmamembran Leben-Zelle.

Noi abbiamo recentemente messo a punto un metodo per quantificare le interazioni tra una proteina di membrana (&quot;esca&quot;) e una proteina fluoroforo (&quot;preda&quot;) direttamente nella membrana del plasma live-cella (metodi di natura Schwarzenbacher et al. 5:1053-1060 2008). L&#39;idea &egrave; di cellule seme su superfici contenenti micro-fantasia di anticorpi contro il dominio di exoplasmic dell&#39;esca e monitorare il co-patterning della preda fluorescente tramite microscopia di fluorescenza. Qui, abbiamo caratterizzato il decorso dell&#39;esca e la preda micropattern formazione sulla semina delle cellule sul micro-biochip. Modelli si formarono immediatamente dopo il contatto delle cellule con la superficie. Le cellule sono state in grado di migrare sulla superficie del chip senza alterare il contrasto micropattern, che &egrave; rimasto costante per ore. Su singole cellule, esca contrasto possa essere soggetti a fluttuazioni, che indica che l&#39;esca pu&ograve; essere rilasciato da e riconquistarono sul microdisegni. Possiamo concludere che gli studi di interazione possono essere eseguiti in qualsiasi punto di tempo dai 5 min a parecchie ore post semina. Monitoraggio interazioni con il tempo si apre la possibilit&agrave; per nuove analisi, che vengono brevemente abbozzato nella sezione discussione.

Risoluzione temporale delle interazioni della proteina-proteina nella membrana del plasma live-cella.

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&#xC6B0;&#xB9AC;&#xAC00; &#xCD5C;&#xADFC;&#xC5D0; &#xB9C9; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; (&quot;&#xBBF8;&#xB07C;&quot;)&#xC640; &#xB77C;&#xC774;&#xBE0C; &#xC138;&#xD3EC; &#xC6D0;&#xD615;&#xC9C8; &#xB9C9;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC9C1;&#xC811; fluorophore &#xD45C;&#xC2DC; &#xB41C; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; (&quot;&#xBA39;&#xC774;&quot;) &#xAC04;&#xC758; &#xC0C1;&#xD638; &#xC791;&#xC6A9;&#xC744; &#xCE21;&#xC815; &#xD558;&#xB294; &#xBC29;&#xBC95;&#xC744; &#xACE0;&#xC548; (Schwarzenbacher &#xC678;. &#xC790;&#xC5F0; &#xBC29;&#xBC95; 5:1053-1060 2008). &#xC544;&#xC774;&#xB514;&#xC5B4;, &#xBBF8;&#xB07C;&#xC758; exoplasmic &#xB3C4;&#xBA54;&#xC778;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xD56D; &#xCCB4; &#xB9C8;&#xC774;&#xD06C;&#xB85C; &#xD328;&#xD134;&#xC744; &#xD3EC;&#xD568; &#xD558;&#xB294; &#xD45C;&#xBA74;&#xC5D0; &#xC2DC;&#xB4DC; &#xC140; &#xC774;&#xBA70; &#xD615;&#xAD11; &#xD604;&#xBBF8;&#xACBD; &#xAC80;&#xC0AC; &#xBC95;&#xC744; &#xD1B5;&#xD574; &#xD615;&#xAD11; &#xBA39;&#xC774;&#xC758; co-patterning&#xB97C; &#xBAA8;&#xB2C8;&#xD130;&#xB9C1;. &#xC5EC;&#xAE30;, &#xC6B0;&#xB9AC;&#xAC00; &#xBBF8;&#xB07C;&#xC758; &#xC2DC;&#xAC04; &#xACFC;&#xC815; &#xD2B9;&#xC9D5; &#xBC0F; micropattern &#xD615;&#xC131; &#xB9C8;&#xC774;&#xD06C;&#xB85C; &#xBC14;&#xC774;&#xC624; &#xCE69;&#xC5D0; &#xC140; &#xC2DC;&#xB4DC;&#xB97C; &#xB530;&#xB77C; &#xBA39;&#xC774;. &#xD328;&#xD134; &#xC140; &#xC11C;&#xD53C;&#xC2A4;&#xC640; &#xC811;&#xCD09; &#xC9C1;&#xD6C4; &#xD615;&#xC131; &#xB418;&#xC5C8;&#xB2E4;. &#xC140; &#xC2DC;&#xAC04; &#xB3D9;&#xC548; &#xC77C;&#xC815; &#xD558; &#xAC8C; &#xC720;&#xC9C0; &#xD558;&#xB294; micropattern &#xB300;&#xBE44;&#xC5D0; &#xC601;&#xD5A5;&#xC744; &#xC8FC;&#xC9C0; &#xC54A;&#xACE0; &#xCE69; &#xD45C;&#xBA74;&#xC5D0; &#xB9C8;&#xC774;&#xADF8;&#xB808;&#xC774;&#xC158;&#xD560; &#xC218; &#xC788;&#xC5C8;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xB2E8;&#xC77C; &#xC140;&#xC5D0; &#xBBF8;&#xB07C; &#xB300;&#xBE44; &#xBBF8;&#xB07C;&#xC5D0;&#xC11C; &#xBC1C;&#xD45C; &#xD558;&#xB294; micropatterns&#xC5D0; &#xC0DD;&#xD3EC; &#xB098;&#xD0C0;&#xB0B4;&#xB294; &#xBCC0;&#xB3D9; &#xB420; &#xC218; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294; &#xC5B4;&#xB5A4; &#xC2DC;&#xAC04; &#xD3EC;&#xC778;&#xD2B8;&#xC5D0;&#xC11C;&#xC5D0;&#xC11C;&#xAE4C;&#xC9C0; 5 &#xBD84; &#xC2DC;&#xB4DC; &#xBA87; &#xC2DC;&#xAC04; &#xAC8C;&#xC2DC;&#xBB3C;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC0C1;&#xD638; &#xC791;&#xC6A9; &#xC5F0;&#xAD6C;&#xB97C; &#xC218;&#xD589;&#xD560; &#xC218; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4; &#xACB0;&#xB860; &#xC9C0;&#xC5C8;&#xB2E4;. &#xBAA8;&#xB2C8;&#xD130;&#xB9C1; &#xC2DC;&#xAC04; &#xC0C1;&#xD638; &#xD1A0;&#xB860; &#xC139;&#xC158;&#xC5D0;&#xC11C; &#xAC04;&#xB2E8; &#xD558; &#xAC8C; &#xC2A4;&#xCF00;&#xCE58; &#xB41C; &#xC0C8;&#xB85C;&#xC6B4; &#xBD84;&#xC11D; &#xC2E4;&#xD5D8;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xAC00;&#xB2A5;&#xC131;&#xC744; &#xC5FD;&#xB2C8;&#xB2E4;.

&#xB77C;&#xC774;&#xBE0C; &#xC138;&#xD3EC; &#xC6D0;&#xD615;&#xC9C8; &#xB9C9;&#xC5D0;&#xC11C; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xC0C1;&#xD638; &#xC791;&#xC6A9;&#xC758; &#xC2DC;&#xAC04;&#xC801; &#xD574;&#xC0C1;&#xB3C4;.

Recientemente, hemos ideado un m&#xE9;todo para cuantificar las interacciones entre una prote&#xED;na de membrana (&#x26;quot;carnada&#x26;quot;) y una prote&#xED;na marcada con fluor&#xF3;foro (&#x26;quot;presa&#x26;quot;) directamente en la membrana plasm&#xE1;tica de c&#xE9;lulas vivas (Schwarzenbacher et al. Nature Methods 5:1053-1060 2008 ). La idea es que las c&#xE9;lulas de semilla en las superficies que contienen micro-estampados anticuerpos contra el dominio exoplasmic del cebo, y monitorear la co-patr&#xF3;n de la presa fluorescente a trav&#xE9;s de microscop&#xED;a de fluorescencia. En este caso, se caracteriz&#xF3; la evoluci&#xF3;n en el tiempo de cebo y la formaci&#xF3;n de presas micropattern a la siembra de las c&#xE9;lulas en el micro-biochip. Los patrones se formaron inmediatamente despu&#xE9;s del contacto de las c&#xE9;lulas con la superficie. Las c&#xE9;lulas fueron capaces de migrar a la superficie del chip sin afectar el contraste micropattern, que se mantuvo constante durante horas. En las c&#xE9;lulas individuales, contraste cebo puede estar sujeto a fluctuaciones, lo que indica que el cebo puede ser liberado desde y recapturados en las micropatrones. Se concluye que los estudios de interacci&#xF3;n se puede realizar en cualquier punto de tiempo que oscila desde 5 minutos a varias horas despu&#xE9;s de la siembra. Seguimiento de las interacciones con el tiempo se abre la posibilidad de nuevos ensayos, que son brevemente esbozadas en la secci&#xF3;n de discusi&#xF3;n.

La resoluci&#xF3;n temporal de las interacciones prote&#xED;na-prote&#xED;na en la membrana plasm&#xE1;tica de las c&#xE9;lulas en vivo

&#x6211;&#x4EEC;&#x7684;&#x7406;&#x89E3;&#x590D;&#x6742;&#x751F;&#x7269;&#x7CFB;&#x7EDF;&#x57FA;&#x4E8E;&#x5E76;&#x884C;&#x5316;&#x7684;&#x68C0;&#x6D4B;&#x548C;&#x5B9A;&#x91CF;&#x5316;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x7684;&#x9AD8;&#x8D28;&#x91CF;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x7EC4;&#x5B66;&#x5DE5;&#x5177;&#x3002;&#x5F53;&#x524D;&#x7B5B;&#x9009;&#x5E73;&#x53F0;&#xFF0C;&#x4F46;&#x662F;&#xFF0C;&#x4F9D;&#x8D56;&#x4E8E;&#x6D4B;&#x91CF;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x800C;&#x662F;&#x4EBA;&#x5DE5;&#x7CFB;&#x7EDF;&#xFF0C;&#x5448;&#x73B0;&#x7ED3;&#x679C;&#x96BE;&#x8D4B;&#x4E88;&#x7684;&#x4F53;&#x5185;&#x7684;&#x60C5;&#x51B5;&#x4E2D;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x5728;&#x6B64;&#x5904;&#x63CF;&#x8FF0;&#x7684;&#x8BBE;&#x8BA1;&#x548C;&#x5EFA;&#x8BBE;&#x4E00;&#x4E2A;&#x7CFB;&#x7EDF;&#xFF0C;&#x4EE5;&#x67E5;&#x660E;&#x548C;&#x91CF;&#x5316;&#x8367;&#x5149;&#x6807;&#x8BB0;&#x7684;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28; (&quot;&#x730E;&#x7269;&quot;) &#x548C;&#x5728;&#x6D3B;&#x7EC6;&#x80DE;&#x4E2D;&#x7684;&#x819C;&#x86CB;&#x767D; (&quot;&#x8BF1;&#x9975;&quot;&#xFF09; &#x4E4B;&#x95F4;&#x7684;&#x4EA4;&#x4E92;&#x7684;&#x8BE6;&#x7EC6;&#x7684;&#x534F;&#x8BAE;&#x3002;&#x5355;&#x5143;&#x683C;&#x662F; micropatterned &#x8868;&#x9762;&#x6297;&#x4F53;&#x7684;&#x8BF1;&#x9975; exoplasmic &#x57DF;&#x5B98;&#x80FD;&#x4E0A;&#x9540;&#x91D1;&#x7684;&#x3002;&#x8BF1;&#x9975;&#x6355;&#x98DF;&#x7684;&#x4EA4;&#x4E92;&#x662F;&#x901A;&#x8FC7;&#x91CD;&#x65B0;&#x5206;&#x914D;&#x7684;&#x8367;&#x5149;&#x730E;&#x7269;&#x7684;&#x6D4B;&#x5B9A;&#x3002;&#x8BE5;&#x65B9;&#x6CD5;&#x7684;&#x7279;&#x70B9;&#x662F;&#x9AD8;&#x7075;&#x654F;&#x5EA6;&#x4E0B;&#x6C34;&#x5E73;&#x7684;&#x5355;&#x5206;&#x5B50;&#x68C0;&#x6D4B;&#x5F31;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x548C;&#x9AD8;&#x541E;&#x5410;&#x91CF;&#xFF0C;&#x4F7F;&#x5B83;&#x4F5C;&#x4E3A;&#x4E00;&#x79CD;&#x7B5B;&#x67E5;&#x5DE5;&#x5177;&#x9002;&#x7528;&#x80FD;&#x529B;&#x3002;&#x6982;&#x5FF5;&#x8BC1;&#x660E;&#x88AB;&#x8BC1;&#x660E; CD4&#xFF0C;&#x4E3B;&#x8981;&#x7684; hiv &#x611F;&#x67D3;&#x6291;&#x5236; T &#x7EC6;&#x80DE;&#x4FE1;&#x53F7;&#x3001; &#x4E2D;&#x548C;&#x8354;&#x679D;&#xFF0C;&#x57FA;&#x672C;&#x4E3A;&#x65E9;&#x671F; T &#x7EC6;&#x80DE;&#x4FE1;&#x53F7;&#x8F6C;&#x5BFC;&#x86CB;&#x767D;&#x916A;&#x6C28;&#x9178;&#x6FC0;&#x9176;&#x4E4B;&#x95F4;&#x7684;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x3002;

&#x5728;&#x901A;&#x8FC7;&#x91CF;&#x5316;&#x6D3B;&#x7EC6;&#x80DE;&#x819C;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;-&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x68C0;&#x6D4B;&#x7684;&#x730E;&#x7269;&#x9975; micropatterning &#x540E;&#x7684;&#x518D;&#x5206;&#x914D;&#x3002;

Our understanding of complex biological systems is based on high-quality proteomics tools for the parallelized detection and quantification of protein interactions. Current screening platforms, however, rely on measuring protein interactions in rather artificial systems, rendering the results difficult to confer on the in vivo situation. We describe here a detailed protocol for the design and the construction of a system to detect and quantify interactions between a fluorophore-labeled protein ("prey") and a membrane protein ("bait") in living cells. Cells are plated on micropatterned surfaces functionalized with antibodies to the bait exoplasmic domain. Bait-prey interactions are assayed via the redistribution of the fluorescent prey. The method is characterized by high sensitivity down to the level of single molecules, the capability to detect weak interactions, and high throughput, making it applicable as a screening tool. The proof-of-concept is demonstrated for the interaction between CD4, a major coreceptor in T-cell signaling, and Lck, a protein tyrosine kinase essential for early T-cell signaling.

Detection of protein-protein interactions in the live cell plasma membrane by quantifying prey redistribution upon bait micropatterning.

Notre compr&#xE9;hension des syst&#xE8;mes biologiques complexes est bas&#xE9;e sur des outils prot&#xE9;omiques de haute qualit&#xE9; pour la d&#xE9;tection et la quantification des parall&#xE9;lis&#xE9; les interactions entre prot&#xE9;ines. Plates-formes de d&#xE9;pistage actuelles, toutefois, compter sur mesure les interactions entre prot&#xE9;ines dans des syst&#xE8;mes artificiels, plut&#xF4;t, ce qui rend les r&#xE9;sultats difficiles &#xE0; conf&#xE9;rer &#xE0; la situation in vivo. Nous d&#xE9;crivons ici un protocole d&#xE9;taill&#xE9; pour la conception et la construction d&#x26;#39;un syst&#xE8;me pour d&#xE9;tecter et quantifier les interactions entre une prot&#xE9;ine fluorophore marqu&#xE9; (&#xAB;proie&#xBB;) et une prot&#xE9;ine de la membrane (&#xAB;app&#xE2;t&#xBB;) dans les cellules vivantes. Les cellules sont &#xE9;tal&#xE9;es sur des surfaces fonctionnalis&#xE9;es micro&#xE9;lectrodes avec des anticorps &#xE0; domaine app&#xE2;ts exoplasmique. Bait-proies interactions sont analys&#xE9;s par le biais de la redistribution de la proie fluorescente. Le proc&#xE9;d&#xE9; est caract&#xE9;ris&#xE9; par une sensibilit&#xE9; &#xE9;lev&#xE9;e jusqu&#x26;#39;&#xE0; l&#x26;#39;&#xE9;chelle de la mol&#xE9;cule, la capacit&#xE9; de d&#xE9;tecter les interactions faibles, et un d&#xE9;bit &#xE9;lev&#xE9;, ce qui rend applicable comme outil de d&#xE9;pistage. La preuve de concept est d&#xE9;montr&#xE9;e pour l&#x26;#39;interaction entre les cellules CD4, un cor&#xE9;cepteur majeur dans la signalisation cellulaire T-, et LCK, une prot&#xE9;ine tyrosine kinase essentielle pour les premiers T-cellules de signalisation.

D&#xE9;tection des interactions prot&#xE9;ine-prot&#xE9;ine dans la membrane plasmique de cellules vivantes en quantifiant redistribution Prey Sur micromodelage Bait

Unser Verst&auml;ndnis von komplexen biologischen Systemen basiert auf qualitativ hochwertigen Proteomics Werkzeuge f&uuml;r die parallelisierte Detektion und Quantifizierung von Protein-Interaktionen. Aktuelle Screening-Plattformen beruhen jedoch auf Messung von Protein-Interaktionen in eher k&uuml;nstlichen Systemen, Rendern der Ergebnisse schwierig, &uuml;ber die in-vivo Situation zu &uuml;bertragen. Wir beschreiben hier ein ausf&uuml;hrliches Protokoll f&uuml;r den Entwurf und den Bau eines Systems zu erkennen und zu quantifizieren Interaktionen zwischen einem Fluorophore beschriftet-Protein (&quot;Beute&quot;) und einem Membranprotein (&quot;K&ouml;der&quot;) in lebenden Zellen. Zellen sind auf Micropatterned Oberfl&auml;chen, die Antik&ouml;rper gegen die K&ouml;der Exoplasmic Dom&auml;ne funktionalisierten beschichtet. K&ouml;der-Beute-Interaktionen sind &uuml;ber die Neuverteilung der fluoreszierenden Beute normalisiert. Die Methode zeichnet sich durch hohe Empfindlichkeit bis auf die Ebene einzelner Molek&uuml;le, die F&auml;higkeit zum Erkennen von schwachen Wechselwirkungen und hohen Durchsatz, so dass es als ein Screening-Tool anwendbar. Die Proof-of-Concept zeigt sich f&uuml;r die Interaktion zwischen CD4, eine gro&szlig;e Coreceptor in T-Zelle signalisieren, und Lck, eine Proteintyrosinkinase notwendig f&uuml;r fr&uuml;hen T-Zell-Signalisierung.

Nachweis von Protein-Protein Interaktionen in der live Zellenplasmamembrane von Beute Umverteilung auf K&ouml;der Micropatterning zu quantifizieren.

La nostra comprensione dei sistemi biologici complessi &egrave; basato su strumenti di proteomica di alta qualit&agrave; per il rilevamento parallelizzata e quantificazione delle interazioni della proteina. Attuali piattaforme di screening, tuttavia, si basano su misura le interazioni della proteina nei sistemi piuttosto artificiali, rendendo i risultati difficili da conferire sulla situazione in vivo. Descriviamo qui un protocollo dettagliato per la progettazione e la costruzione di un sistema per rilevare e quantificare le interazioni tra una proteina fluoroforo (&quot;preda&quot;) e una proteina di membrana (&quot;esca&quot;) in cellule viventi. Le cellule sono placcate su superfici micropatterned funzionalizzate con anticorpi al dominio bait exoplasmic. Esca-preda interazioni sono analizzate tramite la ridistribuzione della preda fluorescente. Il metodo &egrave; caratterizzato da elevata sensibilit&agrave; fino a livello di singole molecole, la capacit&agrave; di rilevare le interazioni deboli e produttivit&agrave; elevata, rendendo applicabile come uno strumento di screening. Il proof-of-concept &egrave; dimostrata per l&#39;interazione tra CD4, un importante coreceptor nella segnalazione delle cellule T e Lck, una chinasi della tirosina della proteina essenziale per la segnalazione precoce T-cellulare.

Rilevamento delle interazioni della proteina-proteina nella membrana del plasma cellulare diretta da quantificando preda ridistribuzione su esca micropatterning.

&#x8907;&#x96D1;&#x306A;&#x751F;&#x7269;&#x7CFB;&#x306E;&#x6211;&#x3005;&#x306E;&#x7406;&#x89E3;&#x306F;&#x3001;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x306E;&#x4E26;&#x5217;&#x5316;&#x691C;&#x51FA;&#x304A;&#x3088;&#x3073;&#x5B9A;&#x91CF;&#x5316;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x9AD8;&#x54C1;&#x8CEA;&#x306A;&#x30D7;&#x30ED;&#x30C6;&#x30AA;&#x30DF;&#x30AF;&#x30B9;&#x30C4;&#x30FC;&#x30EB;&#x306B;&#x57FA;&#x3065;&#x3044;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x73FE;&#x5728;&#x306E;&#x30B9;&#x30AF;&#x30EA;&#x30FC;&#x30CB;&#x30F3;&#x30B0;&#xB7;&#x30D7;&#x30E9;&#x30C3;&#x30C8;&#x30D5;&#x30A9;&#x30FC;&#x30E0;&#x306F;&#x3001;&#x3057;&#x304B;&#x3057;&#x3001;in vivo&#x306E;&#x72B6;&#x6CC1;&#x3067;&#x306E;&#x5354;&#x8B70;&#x304C;&#x56F0;&#x96E3;&#x306A;&#x7D50;&#x679C;&#x3092;&#x30EC;&#x30F3;&#x30C0;&#x30EA;&#x30F3;&#x30B0;&#x3067;&#x306F;&#x306A;&#x304F;&#x3001;&#x4EBA;&#x5DE5;&#x7684;&#x306A;&#x30B7;&#x30B9;&#x30C6;&#x30E0;&#x3067;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x9593;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x306E;&#x6E2C;&#x5B9A;&#x306B;&#x4F9D;&#x5B58;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3053;&#x3053;&#x3067;&#x306F;&#x30C7;&#x30B6;&#x30A4;&#x30F3;&#x3068;&#x86CD;&#x5149;&#x6A19;&#x8B58;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#xFF08; &#x26;quot;&#x7372;&#x7269;&#x26;quot;&#xFF09;&#x3068;&#x3001;&#x751F;&#x304D;&#x305F;&#x7D30;&#x80DE;&#x306E;&#x819C;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#xFF08; &#x26;quot;&#x990C;&#x26;quot;&#xFF09;&#x3068;&#x306E;&#x9593;&#x306E;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x3092;&#x691C;&#x51FA;&#x3057;&#x3001;&#x5B9A;&#x91CF;&#x5316;&#x3059;&#x308B;&#x30B7;&#x30B9;&#x30C6;&#x30E0;&#x3092;&#x69CB;&#x7BC9;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x8A73;&#x7D30;&#x306A;&#x30D7;&#x30ED;&#x30C8;&#x30B3;&#x30EB;&#x3092;&#x8A18;&#x8FF0;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x7D30;&#x80DE;&#x306F;&#x990C;exoplasmic&#x30C9;&#x30E1;&#x30A4;&#x30F3;&#x306B;&#x5BFE;&#x3059;&#x308B;&#x6297;&#x4F53;&#x3067;&#x5B98;&#x80FD;&#x30DE;&#x30A4;&#x30AF;&#x30ED;&#x30D1;&#x30BF;&#x30FC;&#x30F3;&#x8868;&#x9762;&#x4E0A;&#x306B;&#x30E1;&#x30C3;&#x30AD;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x990C; - &#x6355;&#x98DF;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x306F;&#x3001;&#x86CD;&#x5149;&#x7372;&#x7269;&#x306E;&#x5206;&#x914D;&#x306B;&#x3088;&#x308A;&#x5206;&#x6790;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x65B9;&#x6CD5;&#x306F;&#x3001;&#x30B9;&#x30AF;&#x30EA;&#x30FC;&#x30CB;&#x30F3;&#x30B0;&#x30C4;&#x30FC;&#x30EB;&#x3068;&#x3057;&#x3066;&#x305D;&#x308C;&#x304C;&#x9069;&#x7528;&#x3055;&#x308C;&#x306A;&#x304C;&#x3089;&#x3001;&#x5358;&#x4E00;&#x5206;&#x5B50;&#x306E;&#x30EC;&#x30D9;&#x30EB;&#x3001;&#x5F31;&#x3044;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x3092;&#x691C;&#x51FA;&#x3059;&#x308B;&#x6A5F;&#x80FD;&#x3001;&#x9AD8;&#x30B9;&#x30EB;&#x30FC;&#x30D7;&#x30C3;&#x30C8;&#x306B;&#x81F3;&#x308B;&#x307E;&#x3067;&#x9AD8;&#x611F;&#x5EA6;&#x304C;&#x7279;&#x5FB4;&#x3067;&#x3042;&#x308B;&#x3002;&#x6982;&#x5FF5;&#x5B9F;&#x8A3C;&#x306F;&#x3001;CD4 T&#x7D30;&#x80DE;&#x306E;&#x30B7;&#x30B0;&#x30CA;&#x30EB;&#x4F1D;&#x9054;&#x306E;&#x4E3B;&#x8981;&#x306A;&#x30B3;&#x30EC;&#x30BB;&#x30D7;&#x30BF;&#x30FC;&#x3001;&#x304A;&#x3088;&#x3073;Lck&#x304C;&#x3001;&#x521D;&#x671F;&#x306E;T&#x7D30;&#x80DE;&#x306E;&#x30B7;&#x30B0;&#x30CA;&#x30EB;&#x4F1D;&#x9054;&#x306B;&#x5FC5;&#x9808;&#x306E;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x30C1;&#x30ED;&#x30B7;&#x30F3;&#x30AD;&#x30CA;&#x30FC;&#x30BC;&#x3068;&#x306E;&#x9593;&#x306E;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x3092;&#x5B9F;&#x8A3C;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

&#x30D9;&#x30A4;&#x30C8;&#x30D1;&#x30BF;&#x30FC;&#x30CB;&#x30F3;&#x30B0;&#x6642;&#x306B;&#x306F;&#x7372;&#x7269;&#x306E;&#x518D;&#x914D;&#x5E03;&#x3092;&#x5B9A;&#x91CF;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x306B;&#x3088;&#x308A;&#x751F;&#x7D30;&#x80DE;&#x5F62;&#x8CEA;&#x819C;&#x4E2D;&#x306E;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA; - &#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x306E;&#x691C;&#x51FA;

&#xBCF5;&#xC7A1; &#xD55C; &#xC0DD;&#xBB3C; &#xD559;&#xC801; &#xC2DC;&#xC2A4;&#xD15C;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC6B0;&#xB9AC;&#xC758; &#xC774;&#xD574; &#xBCD1;&#xB82C;&#xD654; &#xD0D0;&#xC9C0; &#xBC0F; &#xC815;&#xB7C9;&#xD654; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xC0C1;&#xD638; &#xC791;&#xC6A9;&#xC758; &#xB192;&#xC740; &#xD488;&#xC9C8; proteomics &#xB3C4;&#xAD6C;&#xB97C; &#xAE30;&#xBC18;&#xC73C;&#xB85C; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xADF8;&#xB7EC;&#xB098; &#xD604;&#xC7AC; &#xC0C1;&#xC601; &#xD50C;&#xB7AB;&#xD3FC;, &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xC0C1;&#xD638; &#xC791;&#xC6A9; &#xACB0;&#xACFC; &#xC0DD;&#xCCB4; &#xC870;&#xAC74; &#xC0C1;&#xD669;&#xC5D0; &#xBD80;&#xC5EC; &#xD558;&#xAE30; &#xC5B4;&#xB824;&#xC6B4; &#xB80C;&#xB354;&#xB9C1; &#xC624;&#xD788;&#xB824; &#xC778;&#xACF5; &#xC2DC;&#xC2A4;&#xD15C;&#xC5D0; &#xCE21;&#xC815;&#xC5D0; &#xC758;&#xC874;. &#xC5EC;&#xAE30; &#xB514;&#xC790;&#xC778;&#xACFC; &#xAC10;&#xC9C0; &#xD558; &#xC5EC; fluorophore &#xB77C;&#xB294; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; (&quot;&#xBA39;&#xC774;&quot;)&#xC640;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC0B4;&#xC544;&#xC788;&#xB294; &#xC138;&#xD3EC; &#xB9C9; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; (&quot;&#xBBF8;&#xB07C;&quot;) &#xAC04;&#xC758; &#xC0C1;&#xD638; &#xC791;&#xC6A9;&#xC744; &#xACC4;&#xB7C9; &#xC2DC;&#xC2A4;&#xD15C;&#xC758; &#xAC74;&#xC124;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC0C1;&#xC138;&#xD55C; &#xD504;&#xB85C;&#xD1A0;&#xCF5C;&#xC744; &#xC124;&#xBA85; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC140; &#xBBF8;&#xB07C; exoplasmic &#xB3C4;&#xBA54;&#xC778;&#xC5D0; &#xD56D; &#xCCB4;&#xC640; functionalized micropatterned &#xD45C;&#xBA74;&#xC5D0; &#xB3C4;&#xAE08; &#xB429;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xBBF8;&#xB07C; &#xBA39;&#xC774; &#xC0C1;&#xD638; &#xC791;&#xC6A9; &#xD615;&#xAD11; &#xBA39;&#xC774;&#xC758; &#xC7AC;&#xBD84;&#xBC30;&#xB97C; &#xD1B5;&#xD574; &#xBD84;&#xC11D; &#xB429;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xBA54;&#xC11C;&#xB4DC;&#xB294; &#xC57D;&#xD55C; &#xC0C1;&#xD638; &#xC791;&#xC6A9; &#xBC0F; &#xD574;&#xB2F9; &#xC2EC;&#xC0AC; &#xB3C4;&#xAD6C;&#xB85C; &#xB9CC;&#xB4DC;&#xB294; &#xB192;&#xC740; &#xCC98;&#xB9AC;&#xB7C9;&#xC744; &#xAC10;&#xC9C0; &#xD558;&#xB294; &#xAE30;&#xB2A5;&#xC774; &#xB2E8;&#xC77C; &#xBD84;&#xC790;&#xC758; &#xC218;&#xC900; &#xB192;&#xC740; &#xAC10;&#xB3C4; &#xC758;&#xD574; &#xD2B9;&#xC9D5;&#xC785;&#xB2C8;&#xB2E4;. CD4, T-&#xC138;&#xD3EC; &#xC2E0;&#xD638;&#xC5D0; &#xC8FC;&#xC694; coreceptor Lck, &#xCD08;&#xAE30; T &#xC138;&#xD3EC; &#xC2DC;&#xADF8;&#xB110;&#xB9C1;&#xC744; &#xC704;&#xD55C; &#xD544;&#xC218;&#xC801;&#xC778; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xD2F0;&#xB85C;&#xC2E0; &#xD0A4; &#xAC04;&#xC758; &#xC0C1;&#xD638; &#xC791;&#xC6A9;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xAC1C;&#xB150; &#xC99D;&#xBA85;&#xC744; &#xBCF4;&#xC5EC; &#xC90D;&#xB2C8;&#xB2E4;.

&#xBBF8;&#xB07C; micropatterning &#xB530;&#xB77C; &#xBA39;&#xC774; &#xC7AC;&#xBC30;&#xD3EC;&#xB97C; &#xCE21;&#xC815; &#xD558; &#xC5EC; &#xC0B4;&#xC544;&#xC788;&#xB294; &#xC138;&#xD3EC; &#xC6D0;&#xD615;&#xC9C8; &#xB9C9;&#xC5D0; &#xC788;&#xB294; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xC0C1;&#xD638; &#xC791;&#xC6A9;&#xC758; &#xAC80;&#xCD9C;.

Nuestra comprensi&#xF3;n de los complejos sistemas biol&#xF3;gicos se basa en herramientas de alta calidad prote&#xF3;mica para la detecci&#xF3;n y cuantificaci&#xF3;n paralelizado de las interacciones prote&#xED;na. Plataformas actuales de detecci&#xF3;n, sin embargo, se basan en la medici&#xF3;n de las interacciones de prote&#xED;nas en los sistemas artificiales en lugar, haciendo que los resultados son dif&#xED;ciles de atribuir a la situaci&#xF3;n in vivo. Se describe aqu&#xED; un protocolo detallado para el dise&#xF1;o y la construcci&#xF3;n de un sistema para detectar y cuantificar las interacciones entre una prote&#xED;na marcada con fluor&#xF3;foro (&#x26;quot;presa&#x26;quot;) y una prote&#xED;na de membrana (&#x26;quot;carnada&#x26;quot;) en las c&#xE9;lulas vivas. Las c&#xE9;lulas se cultivaron sobre superficies micropatterned funcionalizados con anticuerpos contra el dominio cebo exoplasmic. Bait-presa se analizan las interacciones a trav&#xE9;s de la redistribuci&#xF3;n de la presa fluorescente. El m&#xE9;todo se caracteriza por una alta sensibilidad al nivel de mol&#xE9;culas individuales, la capacidad de detectar interacciones d&#xE9;biles, y un alto rendimiento, por lo que es aplicable como una herramienta de detecci&#xF3;n. La prueba de concepto se demuestra la interacci&#xF3;n entre los linfocitos CD4, un correceptores importante en la se&#xF1;alizaci&#xF3;n de las c&#xE9;lulas T, y LCK, una prote&#xED;na tirosina quinasa esencial para primeros de c&#xE9;lulas T de se&#xF1;alizaci&#xF3;n.

La detecci&#xF3;n de interacciones prote&#xED;na-prote&#xED;na en la membrana de c&#xE9;lulas plasm&#xE1;ticas en vivo mediante la cuantificaci&#xF3;n de la redistribuci&#xF3;n presa en micropatterning Bait

&#x76EE;&#x7684;&#xFF1A; &#x8840;&#x7BA1;&#x5185;&#x76AE;&#x751F;&#x957F;&#x56E0;&#x5B50; (VEGF)-&#x53D1;&#x8D77;&#x8840;&#x7BA1;&#x751F;&#x6210;&#x9700;&#x8981;&#x534F;&#x8C03;&#x5C3F;&#x6FC0;&#x9176;&#x578B;&#x7EA4;&#x6EB6;&#x9176;&#x539F;&#x6FC0;&#x6D3B;&#x5242;/&#x5C3F;&#x6FC0;&#x9176;&#x53D7;&#x4F53; (uPA/uPAR&#xFF09; &#x7CFB;&#x7EDF;&#x548C;&#x8C03;&#x8282;&#x7EC6;&#x80DE;&#x8FC1;&#x79FB;&#x63D0;&#x4F9B;&#x7684;&#x6574;&#x5408;&#x7D20;&#x77E9;&#x9635;&#x4E92;&#x52A8;&#x63D0;&#x4F9B;&#x7684;&#x7EC6;&#x80DE;&#x5916;&#x57FA;&#x8D28;&#x86CB;&#x767D;&#x6C34;&#x89E3;&#x964D;&#x89E3;&#x3002;&#x5728;&#x8FD9;&#x9879;&#x7814;&#x7A76;&#x4E2D;&#x6211;&#x4EEC;&#x8C03;&#x67E5;&#x57FA;&#x7840; uPAR &#x4F9D;&#x8D56;&#x8C03;&#x5236;&#x7684; VEGF &#x8BF1;&#x5BFC;&#x7684;&#x5185;&#x76AE;&#x7EC6;&#x80DE;&#x8FC1;&#x79FB;&#x7684;&#x673A;&#x5236;&#x3002;&#x65B9;&#x6CD5;&#x548C; ResultsWe &#x7528;&#x4E8E;&#x6D41;&#x5F0F;&#x7EC6;&#x80DE;&#x672F;&#x91CF;&#x5316;&#x6574;&#x5408;&#x7D20;&#x5728;&#x7EC6;&#x80DE;&#x8868;&#x9762;&#x3002;&#x4EBA;&#x7C7B;&#x548C;&#x5C0F;&#x9F20;&#x8840;&#x7BA1;&#x5185;&#x76AE;&#x7EC6;&#x80DE;&#x7684;&#x523A;&#x6FC0;&#x5BFC;&#x81F4;&#x7684; &alpha;5&beta;1 &#x6574;&#x5408;&#x7D20;&#x5185;&#x5316;&#x3002;Micropatterning &#x548C;&#x514D;&#x75AB;&#x7EC6;&#x80DE;&#x5316;&#x5B66;&#x900F;&#x9732; co-clustering uPAR &#x548C; &alpha;5&beta;1 &#x6574;&#x5408;&#x7D20;&#x548C;&#x68C0;&#x7D22;&#x901A;&#x8FC7;&#x6D82;&#x8986;&#x7F51;&#x683C;&#x86CB;&#x767D;&#x5C0F;&#x6CE1;&#x3002;&#x8FD9;&#x4E5F;&#x53D6;&#x51B3;&#x4E8E;&#x53D7;&#x4F53;&#x7684;&#x4F4E;&#x5BC6;&#x5EA6;&#x8102;&#x86CB;&#x767D;&#x53D7;&#x4F53; (&#x4F4E;&#x5BC6;&#x5EA6;&#x8102;&#x86CB;&#x767D;-R) &#x5BB6;&#x5EAD;&#x3002;&#x901A;&#x8FC7;&#x6D88;&#x9664; uPAR &#x4ECE;&#x8840;&#x7BA1;&#x5185;&#x76AE;&#x7EC6;&#x80DE;&#x8868;&#x9762;&#x6216;&#x963B;&#x6B62; uPAR/&#x6574;&#x5408;&#x7D20;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x7684;&#x6291;&#x5236;&#x80BD;&#x5177;&#x6709;&#x6291;&#x5236;&#x4F5C;&#x7528; VEGF &#x8BF1;&#x5BFC;&#x6574;&#x5408;&#x7D20;&#x518D;&#x5206;&#x914D;&#x3002;&#x5728;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x6761;&#x4EF6;&#x4E0B;&#xFF0C;&#x4F53;&#x5916;&#x548C;&#x4F53;&#x5185;&#x53D7;&#x635F;&#x6D04;&#x6E38;&#x8840;&#x7BA1;&#x5185;&#x76AE;&#x7EC6;&#x80DE; VEGF &#x523A;&#x6FC0;&#x540E;&#x7684;&#x53CD;&#x5E94;&#x3002;&#x7ED3;&#x8BBA;&#xFF1A; &#x89C2;&#x5BDF;&#x8868;&#x660E;&#xFF0C;uPAR &#x662F;&#x901A;&#x8FC7;&#x54EA;&#x4E9B; VEGF &#x63A7;&#x4EF6;&#x5185;&#x76AE;&#x7EC6;&#x80DE;&#x8FC1;&#x79FB;&#x7684;&#x7F51;&#x7EDC;&#x7684;&#x91CD;&#x8981;&#x7EC4;&#x6210;&#x90E8;&#x5206;&#x3002;UPAR &#x662F;&#x4E24;&#x4E2A;&#xFF0C;&#x91CD;&#x70B9;&#x7A81;&#x51FA;&#x7684;&#x86CB;&#x767D;&#x6C34;&#x89E3;&#x6D3B;&#x52A8;&#x524D;&#x6CBF;&#x548C;&#x6574;&#x5408;&#x7D20;&#x7684;&#x91CD;&#x65B0;&#x5206;&#x914D;&#x5FC5;&#x987B;&#x901A;&#x8FC7;&#x8BE5;&#x6D41;&#x5165; VEGF &#x8BF1;&#x5BFC;&#x4FE1;&#x53F7;&#x7684;&#x74F6;&#x9888;&#x3002;

&#x5C3F; VEGF &#x8BF1;&#x5BFC;&#x8840;&#x7BA1;&#x5185;&#x76AE;&#x7EC6;&#x80DE;&#x8FC1;&#x79FB; REQUIRES &#x6FC0;&#x9176;&#x53D7;&#x4F53; &#xFF08;uPAR&#xFF09;-&#x4F9D;&#x8D56;&#x6574;&#x5408;&#x7D20;&#x518D;&#x5206;&#x914D;&#x3002;

AIMS: Vascular endothelial growth factor (VEGF)-initiated angiogenesis requires coordinated proteolytic degradation of extracellular matrix provided by the urokinase plasminogen activator/urokinase receptor (uPA/uPAR) system and regulation of cell-migration provided by integrin-matrix interaction. In this study we investigated the mechanisms underlying the uPAR-dependent modulation of VEGF-induced endothelial migration.Methods and ResultsWe used flow cytometry to quantify integrins at the cell surface. Stimulation of human and murine endothelial cells with VEGF resulted in internalization of Î±5Î²1-integrins. Micropatterning and immuno-cytochemistry revealed co-clustering of uPAR and Î±5Î²1-integrins and retrieval via clathrin-coated vesicles. It was also contingent on receptors of the low density lipoprotein receptor (LDL-R) family. VEGF-induced integrin redistribution was inhibited by elimination of uPAR from the endothelial cell surface or by inhibitory peptides that block the uPAR/integrin interaction. Under these conditions the migratory response of endothelial cells upon VEGF stimulation was impaired both, in vitro and in vivo. CONCLUSIONS: The observations indicate that uPAR is an essential component of the network through which VEGF controls endothelial cell migration. UPAR is a bottleneck through which the VEGF-induced signal must be funnelled for both, focused proteolytic activity at the leading edge and for redistribution of integrins.

VEGF-INDUCED ENDOTHELIAL CELL MIGRATION REQUIRES UROKINASE RECEPTOR (uPAR)-DEPENDENT INTEGRIN REDISTRIBUTION.

OBJECTIFS: vascular endothelial growth factor (VEGF) &#xE0; l&#x26;#39;initiative angiogen&#xE8;se n&#xE9;cessite coordonn&#xE9; la d&#xE9;gradation prot&#xE9;olytique de la matrice extracellulaire fournie par le urokinase plasminogen activator / r&#xE9;cepteur urokinase (uPA / uPAR) du syst&#xE8;me et la r&#xE9;glementation de la cellule de migration fourni par l&#x26;#39;int&#xE9;grine-matrice d&#x26;#39;interaction. Dans cette &#xE9;tude, nous avons &#xE9;tudi&#xE9; les m&#xE9;canismes qui sous-tendent la modulation uPAR-d&#xE9;pendante du VEGF-induites migration.Methods endoth&#xE9;liales et ResultsWe cytom&#xE9;trie en flux permet de quantifier les int&#xE9;grines &#xE0; la surface cellulaire. Stimulation de l&#x26;#39;homme et les cellules endoth&#xE9;liales murines avec VEGF conduit &#xE0; l&#x26;#39;internalisation des &#x3B1;5&#x3B2;1 int&#xE9;grines. Micromodelage et immuno-cytochimie r&#xE9;v&#xE9;l&#xE9; co-classification de uPAR et &#x3B1;5&#x3B2;1 int&#xE9;grines et la r&#xE9;cup&#xE9;ration par l&#x26;#39;interm&#xE9;diaire des v&#xE9;sicules recouvertes de clathrine. Il &#xE9;tait &#xE9;galement subordonn&#xE9;e &#xE0; des r&#xE9;cepteurs du r&#xE9;cepteur des lipoprot&#xE9;ines de basse densit&#xE9; (LDL-R) de la famille. Induite par le VEGF int&#xE9;grine redistribution est inhib&#xE9;e par l&#x26;#39;&#xE9;limination de l&#x26;#39;uPAR de la surface de cellules endoth&#xE9;liales ou par les peptides inhibiteurs qui emp&#xEA;chent l&#x26;#39;interaction uPAR / int&#xE9;grine. Dans ces conditions, la r&#xE9;ponse migratoire des cellules endoth&#xE9;liales lors de la stimulation du VEGF a &#xE9;t&#xE9; compromise &#xE0; la fois in vitro et in vivo. CONCLUSIONS: Les observations indiquent que uPAR est un &#xE9;l&#xE9;ment essentiel du r&#xE9;seau &#xE0; travers lequel le VEGF contr&#xF4;le la migration des cellules endoth&#xE9;liales. UPAR est un goulot d&#x26;#39;&#xE9;tranglement &#xE0; travers lequel le signal induite par le VEGF doit &#xEA;tre achemin&#xE9; pour les deux, l&#x26;#39;activit&#xE9; prot&#xE9;olytique cibl&#xE9;e &#xE0; la pointe et pour la redistribution des int&#xE9;grines.

Induite par le VEGF migration des cellules endoth&#xE9;liales EXIGE r&#xE9;cepteur de l&#x26;#39;urokinase (uPAR) DEPENDANT REDISTRIBUTION INTEGRINE

Ziele: Vascular endothelial Growth Factor (VEGF)-initiierte Angiogenese erfordert koordinierte proteolytischen Abbau der extrazellul&auml;ren Matrix der Urokinase Plasminogen Aktivator/Urokinase-Rezeptor (uPA/uPAR) System und Regulierung der Zellmigration bereitgestellt durch Integrin-Matrix-Interaktionen. In dieser Studie untersuchten wir die Mechanismen der uPAR-abh&auml;ngige Modulation der VEGF-induzierten endothelialen Migration.Methoden und ResultsWe verwendet, Durchflusszytometrie, um Integrine auf der Zelloberfl&auml;che zu quantifizieren. Stimulation des menschlichen und murinen Endothelzellen mit VEGF f&uuml;hrte Internalisierung der &alpha;5&beta;1-Integrine. Micropatterning und Immuno-Cytochemistry offenbart co-clustering uPAR und &alpha;5&beta;1-Integrine und Abruf &uuml;ber Clathrin-coated Vesikel. Es war auch abh&auml;ngig von Rezeptoren aus der Familie der low-Density Lipoprotein (LDL-R)-Rezeptor. VEGF-induzierte Integrin Umverteilung war gehemmt, durch Beseitigung von uPAR von der endothelial Zellenoberfl&auml;che oder hemmenden Peptide, die die uPAR/Integrin-Interaktion zu blockieren. Unter diesen Bedingungen war die wandernde Reaktion der Endothelzellen auf VEGF Anregung, in vitro und in-vivo beeintr&auml;chtigt. Schlussfolgerungen: Die Beobachtungen weisen darauf hin, dass diese uPAR ein wesentlicher Bestandteil des Netzes ist durch die VEGF Steuerelemente endothelial-Migration Zellen. UPAR ist ein Engpass, durch den das VEGF-induzierte Signal f&uuml;r beide, fokussierte proteolytische Aktivit&auml;t an der Spitze und Umverteilung der Integrine kommen werden muss.

VEGF-induzierte ENDOTHELIAL Zelle MIGRATION erfordert UROKINASE REZEPTORS (uPAR)-abh&auml;ngige INTEGRIN-UMVERTEILUNG.

OBIETTIVI: Vascular endothelial growth factor (VEGF)-avviato l&#39;angiogenesi richiede coordinato degradazione proteolitica della matrice extracellulare fornito dal sistema dei recettori (uPA/uPAR) urochinasi/attivatore del plasminogeno urochinasi e regolazione della migrazione cellulare fornito dall&#39;interazione integrina-matrix. In questo studio abbiamo indagato i meccanismi alla base della modulazione uPAR-dipendente della migrazione endoteliale indotta da VEGF.Metodi e ResultsWe utilizzati mediante citometria a flusso per quantificare le integrine alla superficie delle cellule. Stimolazione delle cellule endoteliali umane e murine con VEGF ha portato nella interiorizzazione di &alpha;5&beta;1-integrine. Micropatterning e immunocitochimica ha rivelato co-clustering di uPAR e &alpha;5&beta;1-integrine e recupero tramite vescicole rivestite di Clatrina. &Egrave; stato anche contingente sui recettori della famiglia del recettore (LDL-R) lipoproteine a bassa densit&agrave;. Ridistribuzione di integrina indotta da VEGF &egrave; stata inibita dalla eliminazione di uPAR dalla superficie delle cellule endoteliali o di peptidi inibitori che bloccano l&#39;interazione uPAR/integrina. In queste condizioni la risposta migratoria delle cellule endoteliali dopo stimolazione con VEGF &egrave; stata alterata, sia in vitro e in vivo. CONCLUSIONI: Le osservazioni indicano che uPAR &egrave; una componente essenziale della rete attraverso cui VEGF controlli endothelial cell migrazione. UPAR &egrave; un collo di bottiglia attraverso il quale il segnale VEGF-indotta deve essere distribuito per entrambi, attivit&agrave; proteolitica focalizzata all&#39;avanguardia e per la ridistribuzione delle integrine.

VEGF-INDUCED ENDOTHELIAL migrazione esige UROCHINASI RECETTORE delle cellule (uPAR)-dipendente dell&#39;INTEGRINA ridistribuzione.

AIMS&#xFF1A;&#x8840;&#x7BA1;&#x5185;&#x76AE;&#x5897;&#x6B96;&#x56E0;&#x5B50;&#xFF08;VEGF&#xFF09;&#x304C;&#x958B;&#x59CB;&#x3057;&#x305F;&#x8840;&#x7BA1;&#x65B0;&#x751F;&#x306F;&#x3001;&#x30A4;&#x30F3;&#x30C6;&#x30B0;&#x30EA;&#x30F3; - &#x30DE;&#x30C8;&#x30EA;&#x30C3;&#x30AF;&#x30B9;&#x306E;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x63D0;&#x4F9B;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x30A6;&#x30ED;&#x30AD;&#x30CA;&#x30FC;&#x30BC;&#x30D7;&#x30E9;&#x30B9;&#x30DF;&#x30CE;&#x30FC;&#x30B2;&#x30F3;&#x6D3B;&#x6027;&#x5316;&#x56E0;&#x5B50;/&#x30A6;&#x30ED;&#x30AD;&#x30CA;&#x30FC;&#x30BC;&#x53D7;&#x5BB9;&#x4F53;&#x56E0;&#x5B50;&#xFF08;uPA / uPAR&#x306E;&#xFF09;&#x30B7;&#x30B9;&#x30C6;&#x30E0;&#x3068;&#x7D30;&#x80DE;&#x904A;&#x8D70;&#x306E;&#x8ABF;&#x7BC0;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x63D0;&#x4F9B;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x7D30;&#x80DE;&#x5916;&#x30DE;&#x30C8;&#x30EA;&#x30C3;&#x30AF;&#x30B9;&#x306E;&#x8ABF;&#x6574;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x5206;&#x89E3;&#x3092;&#x5FC5;&#x8981;&#x3068;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x672C;&#x7814;&#x7A76;&#x3067;&#x306F;&#x3001;&#x7D30;&#x80DE;&#x8868;&#x9762;&#x306B;&#x30A4;&#x30F3;&#x30C6;&#x30B0;&#x30EA;&#x30F3;&#x3092;&#x5B9A;&#x91CF;&#x5316;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306B;VEGF&#x8A98;&#x5C0E;&#x6027;&#x8840;&#x7BA1;&#x5185;&#x76AE;migration.Methods&#x3068;ResultsWe&#x4F7F;&#x7528;&#x3055;&#x308C;&#x308B;&#x30D5;&#x200B;&#x200B;&#x30ED;&#x30FC;&#x30B5;&#x30A4;&#x30C8;&#x30E1;&#x30C8;&#x30EA;&#x30FC;&#x306E;uPAR&#x306E;&#x4F9D;&#x5B58;&#x5909;&#x8ABF;&#x306E;&#x30E1;&#x30AB;&#x30CB;&#x30BA;&#x30E0;&#x3092;&#x691C;&#x8A0E;&#x3057;&#x305F;&#x3002; VEGF&#x306B;&#x3088;&#x308B;&#x30D2;&#x30C8;&#x304A;&#x3088;&#x3073;&#x30DE;&#x30A6;&#x30B9;&#x5185;&#x76AE;&#x7D30;&#x80DE;&#x306E;&#x523A;&#x6FC0;&#x306F;&#x3001;&#x3B1;5&#x3B2;1&#x30A4;&#x30F3;&#x30C6;&#x30B0;&#x30EA;&#x30F3;&#x306E;&#x5185;&#x90E8;&#x3092;&#x3082;&#x305F;&#x3089;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x30D1;&#x30BF;&#x30FC;&#x30CB;&#x30F3;&#x30B0;&#x304A;&#x3088;&#x3073;&#x514D;&#x75AB;&#x7D30;&#x80DE;&#x5316;&#x5B66;&#x3067;&#x306F;&#x3001;uPAR&#x306E;&#x3068;&#x3B1;5&#x3B2;1&#x30A4;&#x30F3;&#x30C6;&#x30B0;&#x30EA;&#x30F3;&#x306E;&#x5171;&#x30AF;&#x30E9;&#x30B9;&#x30BF;&#x30EA;&#x30F3;&#x30B0;&#x3068;&#x30AF;&#x30E9;&#x30B9;&#x30EA;&#x30F3;&#x88AB;&#x8986;&#x5C0F;&#x80DE;&#x3092;&#x4ECB;&#x3057;&#x305F;&#x691C;&#x7D22;&#x3092;&#x660E;&#x3089;&#x304B;&#x306B;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x307E;&#x305F;&#x3001;&#x4F4E;&#x5BC6;&#x5EA6;&#x30EA;&#x30DD;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x53D7;&#x5BB9;&#x4F53;&#xFF08;LDL-R&#xFF09;&#x30D5;&#x30A1;&#x30DF;&#x30EA;&#x30FC;&#x306E;&#x53D7;&#x5BB9;&#x4F53;&#x3078;&#x306E;&#x5076;&#x767A;&#x7684;&#x3067;&#x3042;&#x3063;&#x305F;&#x3002; VEGF&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x8A98;&#x5C0E;&#x3055;&#x308C;&#x308B;&#x30A4;&#x30F3;&#x30C6;&#x30B0;&#x30EA;&#x30F3;&#x518D;&#x5206;&#x914D;&#x306F;&#x3001;&#x5185;&#x76AE;&#x7D30;&#x80DE;&#x8868;&#x9762;&#x304B;&#x3089;uPAR&#x306E;&#x9664;&#x53BB;&#x307E;&#x305F;&#x306F;uPAR&#x306E;/&#x30A4;&#x30F3;&#x30C6;&#x30B0;&#x30EA;&#x30F3;&#x306E;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x3092;&#x30D6;&#x30ED;&#x30C3;&#x30AF;&#x3059;&#x308B;&#x963B;&#x5BB3;&#x30DA;&#x30D7;&#x30C1;&#x30C9;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x963B;&#x5BB3;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x3002;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x6761;&#x4EF6;&#x4E0B;&#x3067;&#x306E;VEGF&#x523A;&#x6FC0;&#x306B;&#x3088;&#x308B;&#x8840;&#x7BA1;&#x5185;&#x76AE;&#x7D30;&#x80DE;&#x306E;&#x904A;&#x8D70;&#x5FDC;&#x7B54;&#x306F;&#x3001;in vitro&#x304A;&#x3088;&#x3073;in vivo&#x306E;&#x4E21;&#x65B9;&#x3067;&#x969C;&#x5BB3;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x305F;&#x3002;&#x7D50;&#x8AD6;&#xFF1A;&#x89B3;&#x6E2C;&#x306F;&#x3001;uPAR&#x306E;&#x306F;&#x3001;VEGF&#x306F;&#x3001;&#x5185;&#x76AE;&#x7D30;&#x80DE;&#x306E;&#x904A;&#x8D70;&#x3092;&#x5236;&#x5FA1;&#x3059;&#x308B;&#x3092;&#x4ECB;&#x3057;&#x3066;&#x30CD;&#x30C3;&#x30C8;&#x30EF;&#x30FC;&#x30AF;&#x306B;&#x4E0D;&#x53EF;&#x6B20;&#x306A;&#x30B3;&#x30F3;&#x30DD;&#x30FC;&#x30CD;&#x30F3;&#x30C8;&#x3067;&#x3042;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x793A;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x3002; uPAR&#x306F;VEGF&#x8A98;&#x5C0E;&#x4FE1;&#x53F7;&#x304C;&#x6700;&#x5148;&#x7AEF;&#x3067;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x5206;&#x89E3;&#x6D3B;&#x6027;&#x306B;&#x7126;&#x70B9;&#x3092;&#x5F53;&#x3066;&#x3001;&#x30A4;&#x30F3;&#x30C6;&#x30B0;&#x30EA;&#x30F3;&#x306E;&#x518D;&#x5206;&#x914D;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x3001;&#x4E21;&#x65B9;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x6CE8;&#x304E;&#x8FBC;&#x307E;&#x306A;&#x3051;&#x308C;&#x3070;&#x306A;&#x3089;&#x306A;&#x3044;&#x901A;&#x904E;&#x30DC;&#x30C8;&#x30EB;&#x30CD;&#x30C3;&#x30AF;&#x306B;&#x306A;&#x3063;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

VEGF&#x8A98;&#x5C0E;&#x6027;&#x5185;&#x76AE;&#x7D30;&#x80DE;&#x904A;&#x8D70;&#x306F;&#x3001;&#x30A6;&#x200B;&#x200B;&#x30ED;&#x30AD;&#x30CA;&#x30FC;&#x30BC;&#x53D7;&#x5BB9;&#x4F53;&#xFF08;uPAR&#xFF09;&#x4F9D;&#x5B58;&#x6027;&#x30A4;&#x30F3;&#x30C6;&#x30B0;&#x30EA;&#x30F3;&#x518D;&#x914D;&#x5E03;&#x304C;&#x5FC5;&#x8981;&#x3067;&#x3059;&#x3002;

&#xBAA9;&#xD45C;: &#xD608;&#xAD00; &#xB0B4; &#xD53C; &#xC131;&#xC7A5; &#xC778;&#xC790; (VEGF)-&#xC2DC;&#xC791; &#xB41C; &#xC2E0;&#xC0DD; urokinase plasminogen activator/urokinase &#xC218;&#xC6A9; &#xCCB4; (uPA/&#xC5C5;&#xB85C;&#xB4DC;) &#xC2DC;&#xC2A4;&#xD15C; &#xC140; &#xB9C8;&#xC774;&#xADF8;&#xB808;&#xC774;&#xC158; integrin &#xB9E4;&#xD2B8;&#xB9AD;&#xC2A4; &#xC0C1;&#xD638; &#xC791;&#xC6A9;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xC81C;&#xACF5;&#xC758; &#xADDC;&#xC815;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xC81C;&#xACF5; &#xB41C; &#xC138;&#xD3EC; &#xC678; &#xAE30;&#xC9C8; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xC800;&#xD558; &#xC870;&#xC815;&#xB41C; &#xD544;&#xC694;. &#xC774; &#xC5F0;&#xAD6C;&#xC5D0;&#xC11C; VEGF &#xC720;&#xB3C4; &#xB0B4; &#xD53C; &#xB9C8;&#xC774;&#xADF8;&#xB808;&#xC774;&#xC158;&#xC758; &#xC5C5;&#xB85C;&#xB4DC; &#xC885;&#xC18D; &#xBCC0;&#xC870;&#xB97C; &#xAE30;&#xBCF8; &#xBA54;&#xCEE4;&#xB2C8;&#xC998;&#xC744; &#xC870;&#xC0AC;.&#xBA54;&#xC11C;&#xB4DC; &#xBC0F; ResultsWe &#xC140; &#xD45C;&#xBA74;&#xC5D0;&#xC11C; integrins &#xACC4;&#xB7C9; cytometry &#xC0AC;&#xC6A9;. VEGF&#xC640; &#xC778;&#xAC04;&#xACFC; murine &#xB0B4; &#xD53C; &#xC138;&#xD3EC;&#xC758; &#xC790;&#xADF9; &alpha;5&beta;1 integrins&#xC758; &#xAD6D;&#xC81C;&#xD654; &#xADC0;&#xCC29;&#xB418; &#xC5C8; &#xB2E4;. Micropatterning &#xBC0F; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; cytochemistry &#xC5C5;&#xB85C;&#xB4DC; &#xBC0F; &alpha;5&beta;1 integrins clathrin-&#xC785;&#xD788;&#xB294; &#xC18C;&#xD3EC;&#xB97C; &#xD1B5;&#xD574; &#xAC80;&#xC0C9;&#xC758; co-clustering&#xC744; &#xACF5;&#xAC1C; &#xD588;&#xB2E4;. &#xB610;&#xD55C; &#xC800;&#xBC00;&#xB3C4; &#xC9C0; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xC218;&#xC6A9; &#xCCB4; (LDL-R) &#xAC00;&#xC871;&#xC758; &#xC218;&#xC6A9; &#xCCB4;&#xC5D0; &#xD30C;&#xACAC; &#xD588;&#xB2E4;. VEGF &#xC720;&#xB3C4; integrin &#xC7AC;&#xBC30;&#xD3EC; &#xC5C5;&#xB85C;&#xB4DC; &#xB0B4; &#xD53C; &#xC138;&#xD3EC; &#xD45C;&#xBA74;&#xC5D0;&#xC11C;&#xC758; &#xC81C;&#xAC70;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xB610;&#xB294; &#xC5C5;&#xB85C;&#xB4DC;/integrin &#xC0C1;&#xD638; &#xC791;&#xC6A9;&#xC744; &#xCC28;&#xB2E8; &#xD558;&#xB294; &#xAE08;&#xC9C0; &#xD3A9; &#xD2F0; &#xB4DC;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xC800;&#xD574; &#xB418;&#xC5C8;&#xB2E4;. &#xC774;&#xB7EC;&#xD55C; &#xC870;&#xAC74; &#xD558;&#xC5D0;&#xC11C; &#xCCA0;&#xC0C8; &#xC751;&#xB2F5; VEGF &#xC790;&#xADF9; &#xC2DC; &#xB0B4; &#xD53C; &#xC138;&#xD3EC;&#xC758; &#xC0DD;&#xCCB4; &#xC678; &#xBC0F; &#xC0DD;&#xCCB4; &#xC870;&#xAC74; &#xBAA8;&#xB450;, &#xC7A5;&#xC560;&#xB294;. &#xACB0;&#xB860;: &#xAD00;&#xCE21; &#xADF8; &#xC5C5;&#xB85C;&#xB4DC;&#xB294; VEGF&#xB97C; &#xD1B5;&#xD574; &#xCEE8;&#xD2B8;&#xB864; &#xB0B4; &#xD53C; &#xC138;&#xD3EC; &#xB9C8;&#xC774;&#xADF8;&#xB808;&#xC774;&#xC158; &#xB124;&#xD2B8;&#xC6CC;&#xD06C;&#xC758; &#xD544;&#xC218; &#xAD6C;&#xC131; &#xC694;&#xC18C;&#xB97C; &#xB098;&#xD0C0;&#xB0C5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC5C5;&#xB85C;&#xB4DC; &#xCD5C;&#xACE0;&#xC758; &#xAC00;&#xC7A5;&#xC790;&#xB9AC;&#xC5D0; &#xB450;, &#xCD08;&#xC810; &#xC744;&#xB41C; &#xC704;&#xD558;&#xC5EC; &#xD65C;&#xB3D9; &#xBC0F; &#xC7AC;&#xBC30;&#xD3EC; integrins&#xC758; VEGF &#xC720;&#xB3C4; &#xC2E0;&#xD638; funnelled &#xD574;&#xC57C; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4; &#xC788;&#xB294; &#xBCD1;&#xBAA9; &#xC774;&#xB2E4;.

VEGF &#xC720;&#xB3C4; &#xB41C; &#xB0B4; &#xD53C; &#xC138;&#xD3EC; &#xB9C8;&#xC774;&#xADF8;&#xB808;&#xC774;&#xC158; REQUIRES &#xC218;&#xC6A9; UROKINASE &#xCCB4; (&#xC5C5;&#xB85C;&#xB4DC;)-&#xC885;&#xC18D; INTEGRIN &#xC7AC;&#xBC30;&#xD3EC;.

OBJETIVOS: factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), iniciada por la angiog&#xE9;nesis requiere la degradaci&#xF3;n proteol&#xED;tica de la coordinaci&#xF3;n de la matriz extracelular proporcionada por el activador del plasmin&#xF3;geno urocinasa / receptor de uroquinasa (uPA / uPAR) del sistema y la regulaci&#xF3;n de la migraci&#xF3;n celular proporcionado por la integrina-matriz de interacci&#xF3;n. En este estudio se investigaron los mecanismos que subyacen a la modulaci&#xF3;n de uPAR-dependiente del VEGF inducida por migration.Methods endoteliales y ResultsWe citometr&#xED;a de flujo utilizada para cuantificar las integrinas en la superficie celular. La estimulaci&#xF3;n de c&#xE9;lulas endoteliales humanas y murinas con VEGF result&#xF3; en la internalizaci&#xF3;n de &#x3B1;5&#x3B2;1-integrinas. Micropatterning e inmuno-citoqu&#xED;mica revel&#xF3; co-agrupamiento de integrinas &#x3B1;5&#x3B2;1 y uPAR-y la recuperaci&#xF3;n a trav&#xE9;s de clathrin recubiertos con ves&#xED;culas. Fue tambi&#xE9;n depende de los receptores de los receptores de lipoprote&#xED;nas de baja densidad (LDL-R) de la familia. Inducida por VEGF integrina redistribuci&#xF3;n fue inhibida por la eliminaci&#xF3;n de uPAR de la superficie de las c&#xE9;lulas endoteliales o por p&#xE9;ptidos inhibidores que bloquean la interacci&#xF3;n uPAR / integrina. Bajo estas condiciones, la respuesta migratoria de las c&#xE9;lulas endoteliales a la estimulaci&#xF3;n de VEGF se ve&#xED;a afectada tanto in vitro como in vivo. CONCLUSIONES: Las observaciones indican que uPAR es un componente esencial de la red a trav&#xE9;s del cual el VEGF controla la migraci&#xF3;n de c&#xE9;lulas endoteliales. UPAR es un cuello de botella a trav&#xE9;s del cual debe ser la se&#xF1;al del VEGF inducida por canalizado tanto, la actividad proteol&#xED;tica centrado en el borde de ataque y para la redistribuci&#xF3;n de las integrinas.

Stefan Sunzenauer

Institute of Biophysics

Johannes Kepler Universitat Linz

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

Stefan Sunzenauer

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Johannes Kepler Universitat Linz

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

Institute of Biophysics