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High Sensitivity 5-hydroxymethylcytosine Detection in Balb/C Brain Tissue

DNA hydroxymethylation is a long known modification of DNA, but has recently become a focus in epigenetic research.   Mammalian DNA is enzymatically ...

New England BioLabs

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&#x7528;&#x6237;&#x53CB;&#x597D; DNA &#x5DE5;&#x7A0B;&#x548C;&#x5C3F;&#x5627;&#x5576;&#x5207;&#x9664;&#x7684;&#x514B;&#x9686;&#x65B9;&#x6CD5;&#x3002;

Here we report a PCR-based DNA engineering technique for seamless assembly of recombinant molecules from multiple components. We create cloning vector and target molecules flanked with compatible single-stranded (ss) extensions. The vector contains a cassette with two inversely oriented nicking endonuclease sites separated by restriction endonuclease site(s). The spacer sequences between the nicking and restriction sites are tailored to create ss extensions of custom sequence. The vector is then linearized by digestion with nicking and restriction endonucleases. To generate target molecules, a single deoxyuridine (dU) residue is placed 6-10 nt away from the 5'-end of each PCR primer. 5' of dU the primer sequence is compatible either with an ss extension on the vector or with the ss extension of the next-in-line PCR product. After amplification, the dU is excised from the PCR products with the USER enzyme leaving PCR products flanked by 3' ss extensions. When mixed together, the linearized vector and PCR products directionally assemble into a recombinant molecule through complementary ss extensions. By varying the design of the PCR primers, the protocol is easily adapted to perform one or more simultaneous DNA manipulations such as directional cloning, site-specific mutagenesis, sequence insertion or deletion and sequence assembly.

USER friendly DNA engineering and cloning method by uracil excision.

Nous rapportons ici une technique bas&#xE9;e sur la PCR ADN d&#x26;#39;ing&#xE9;nierie pour l&#x26;#39;assemblage sans soudure de mol&#xE9;cules recombinantes &#xE0; partir de composants multiples. Nous cr&#xE9;ons vecteur de clonage et les mol&#xE9;cules cibles compatibles flanqu&#xE9;s de simple brin (ss) extensions. Le vecteur contient une cassette avec deux inversement orient&#xE9;es sites d&#x26;#39;endonucl&#xE9;ase de entaille s&#xE9;par&#xE9;es par le site d&#x26;#39;endonucl&#xE9;ase de restriction (s). Les s&#xE9;quences d&#x26;#39;espacement entre l&#x26;#39;entaille et des sites de restriction sont adapt&#xE9;s pour cr&#xE9;er des extensions art de s&#xE9;quence personnalis&#xE9;e. Le vecteur est ensuite lin&#xE9;aris&#xE9; par digestion avec des endonucl&#xE9;ases de restriction et d&#x26;#39;entailler. Pour g&#xE9;n&#xE9;rer des mol&#xE9;cules cibles, une seule d&#xE9;soxyuridine (dU) r&#xE9;sidu est plac&#xE9; 6-10 nt &#xE9;loign&#xE9;e de l&#x26;#39;extr&#xE9;mit&#xE9; 5 &#x26;#39;de chaque amorce de PCR. 5 &#x26;#39;de la s&#xE9;quence d&#x26;#39;amorce dU est compatible soit avec une extension ss sur le vecteur ou avec l&#x26;#39;extension ss du produit de la prochaine ligne de PCR. Apr&#xE8;s amplification, l&#x26;#39;UA est excis&#xE9;e &#xE0; partir des produits de PCR avec l&#x26;#39;enzyme UTILISATEUR laissant pas de produits de PCR flanqu&#xE9;es par des extensions ss 3 &#x26;#39;. Lorsque m&#xE9;lang&#xE9;s, le vecteur lin&#xE9;aris&#xE9; et des produits de PCR directionnelle assembler en une mol&#xE9;cule recombinante gr&#xE2;ce &#xE0; des extensions compl&#xE9;mentaires ss. En faisant varier la conception des amorces de PCR, le protocole est facilement adapt&#xE9; pour effectuer une ou plusieurs manipulations de l&#x26;#39;ADN simultan&#xE9;es telles que le clonage directionnel, mutagen&#xE8;se dirig&#xE9;e, l&#x26;#39;insertion ou la suppression de s&#xE9;quence et la s&#xE9;quence d&#x26;#39;assemblage.

Ing&#xE9;nierie ADN Convivial et m&#xE9;thode de clonage par excision Uracile

Hier berichten wir eine PCR-gegr&uuml;ndete DNA Technik Technik f&uuml;r nahtlose Montage von rekombinanten Molek&uuml;le aus mehreren Komponenten. Wir erstellen Klonen Vektor- und Ziel-Molek&uuml;le flankiert mit kompatiblen einzelstr&auml;ngige (ss)-Erweiterungen. Der Vektor enth&auml;lt eine Kassette mit zwei umgekehrt orientierte nicking Endonuklease Standorten durch Beschr&auml;nkung Endonuclease Website(s) getrennt. Die Spacer-Sequenzen zwischen den Standorten nicking und Beschr&auml;nkung sind zugeschnitten, um ss-Erweiterungen benutzerdefinierte Sequenz zu erstellen. Der Vektor wird dann durch Verdauung mit nicking und Beschr&auml;nkung Endonucleases linearisiert. Um Zielmolek&uuml;le zu generieren, wird ein einzelnes Deoxyuridine (dU)-R&uuml;ckstand 6-10 nt vom 5&#39;-Ende jeder PCR-Primer platziert. 5&#39; der dU die Grundierung-Sequenz ist kompatibel mit einer ss-Erweiterung auf den Vektor oder mit der ss-Erweiterung der weiter-in-Line-PCR-Produktes. Nach Verst&auml;rkung, die dU von der PCR-Produkte mit dem Benutzer-Enzym, das Verlassen der PCR-Produkte, flankiert von 3 herausgeschnitten ist &#39; ss Erweiterungen. Wenn Sie zusammen gemischt, montieren der linearisierten Vektor und PCR-Produkte Richtungen in ein rekombinantes Molek&uuml;l durch erg&auml;nzende ss-Erweiterungen. Das Design der PCR Z&uuml;ndkapseln variieren, ist das Protokoll leicht angepasst werden, um eine oder mehrere gleichzeitige DNA Manipulationen wie Richtungsklonen, Ortsspezifische Mutagenese, Sequenz einf&uuml;gen oder l&ouml;schen und Sequenzassemblierung durchzuf&uuml;hren.

Benutzer freundlich DNA engineering und Klonen Methode von Uracil Exzision.

Qui riportiamo un DNA PCR-based ingegneria tecnica per montaggio senza soluzione di continuit&agrave; di molecole ricombinanti da pi&ugrave; componenti. Creiamo la clonazione molecole di vettore e destinazione affiancate con le estensioni compatibili single-stranded (ss). Il vettore contiene una cassetta con due siti di endonucleasi nicking inversamente orientato separati da siti di endonucleasi di restrizione. Le sequenze di distanziatore tra i siti di intaccare e restrizione su misura per creare estensioni ss della sequenza personalizzata. Il vettore &egrave; quindi linearizzato da digestione con endonucleasi e di intaccare. Per generare le molecole bersaglio, un residuo di deossiuridina singolo (dU) &egrave; posto 6-10 nt lontano dalla 5&#39;-estremit&agrave; di ciascun primer PCR. 5&#39; di dU la sequenza primer &egrave; compatibile con un&#39;estensione di ss sul vettore o con l&#39;estensione ss del prodotto PCR avanti-in-linea. Dopo l&#39;amplificazione, il dU &egrave; esaltato i prodotti di PCR con l&#39;enzima di utente lasciando i prodotti di PCR affiancati da 3&#39; ss estensioni. Quando mescolati insieme, il vettore linearizzato e prodotti di PCR direzionalmente assemblare in una molecola ricombinante attraverso estensioni ss complementari. Variando il disegno dei primer PCR, il protocollo si adatta facilmente per eseguire uno o pi&ugrave; simultanei manipolazioni del DNA come clonazione direzionale, mutagenesi sito-specifica, sequenza inserimento o eliminazione e assemblaggio di sequenza.

UTENTE amichevole DNA ingegneria e clonazione metodo di escissione di uracile.

&#x3053;&#x3053;&#x3067;&#x306F;&#x3001;&#x8907;&#x6570;&#x306E;&#x30B3;&#x30F3;&#x30DD;&#x30FC;&#x30CD;&#x30F3;&#x30C8;&#x304B;&#x3089;&#x306E;&#x7D44;&#x63DB;&#x3048;&#x5206;&#x5B50;&#x306E;&#x30B7;&#x30FC;&#x30E0;&#x30EC;&#x30B9;&#x306A;&#x7D44;&#x307F;&#x7ACB;&#x3066;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306E;PCR&#x30D9;&#x30FC;&#x30B9;&#x306E;DNA&#x5DE5;&#x5B66;&#x7684;&#x624B;&#x6CD5;&#x3092;&#x5831;&#x544A;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x6211;&#x3005;&#x306F;&#x4E92;&#x63DB;&#x6027;&#x306E;&#x3042;&#x308B;&#x4E00;&#x672C;&#x9396;&#xFF08;ss&#xFF09;&#x306E;&#x62E1;&#x5F35;&#x5B50;&#x3092;&#x6301;&#x3064;&#x96A3;&#x63A5;&#x3057;&#x305F;&#x30AF;&#x30ED;&#x30FC;&#x30CB;&#x30F3;&#x30B0;&#x30D9;&#x30AF;&#x30BF;&#x30FC;&#x3068;&#x6A19;&#x7684;&#x5206;&#x5B50;&#x3092;&#x4F5C;&#x6210;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x30D9;&#x30AF;&#x30BF;&#x30FC;&#x306F;&#x3001;&#x5236;&#x9650;&#x30A8;&#x30F3;&#x30C9;&#x30CC;&#x30AF;&#x30EC;&#x30A2;&#x30FC;&#x30BC;&#x90E8;&#x4F4D;&#xFF08;S&#xFF09;&#x3067;&#x533A;&#x5207;&#x3089;&#x308C;&#x305F;2&#x3064;&#x306E;&#x9006;&#x5411;&#x304D;&#x30CB;&#x30C3;&#x30AD;&#x30F3;&#x30B0;&#xB7;&#x30A8;&#x30F3;&#x30C9;&#x30CC;&#x30AF;&#x30EC;&#x30A2;&#x30FC;&#x30BC;&#x90E8;&#x4F4D;&#x3092;&#x6709;&#x3059;&#x308B;&#x30AB;&#x30BB;&#x30C3;&#x30C8;&#x304C;&#x5165;&#x3063;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x30CB;&#x30C3;&#x30AD;&#x30F3;&#x30B0;&#x304A;&#x3088;&#x3073;&#x5236;&#x9650;&#x90E8;&#x4F4D;&#x306E;&#x9593;&#x306B;&#x30B9;&#x30DA;&#x30FC;&#x30B5;&#x30FC;&#x914D;&#x5217;&#x306F;&#x3001;&#x30AB;&#x30B9;&#x30BF;&#x30E0;&#x30B7;&#x30FC;&#x30B1;&#x30F3;&#x30B9;&#x306E;SS&#x306E;&#x62E1;&#x5F35;&#x6A5F;&#x80FD;&#x3092;&#x4F5C;&#x6210;&#x3059;&#x308B;&#x3088;&#x3046;&#x306B;&#x8ABF;&#x6574;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x30D9;&#x30AF;&#x30BF;&#x30FC;&#x3092;&#x30CB;&#x30C3;&#x30AD;&#x30F3;&#x30B0;&#x3001;&#x5236;&#x9650;&#x30A8;&#x30F3;&#x30C9;&#x30CC;&#x30AF;&#x30EC;&#x30A2;&#x30FC;&#x30BC;&#x3067;&#x6D88;&#x5316;&#x3057;&#x3066;&#x7DDA;&#x72B6;&#x5316;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x6A19;&#x7684;&#x5206;&#x5B50;&#x3092;&#x751F;&#x6210;&#x3059;&#x308B;&#x306B;&#x306F;&#x3001;&#x5358;&#x4E00;&#x306E;&#x30C7;&#x30AA;&#x30AD;&#x30B7;&#x30A6;&#x30EA;&#x30B8;&#x30F3;&#xFF08;DU&#xFF09;&#x3001;&#x6B8B;&#x6E23;&#x3092;&#x5404;PCR&#x30D7;&#x30E9;&#x30A4;&#x30DE;&#x30FC;&#x306E;5 &#x26;#39;&#x672B;&#x7AEF;&#x304B;&#x3089;6&#x6708;10&#x65E5;NT&#x3092;&#x96E2;&#x308C;&#x3066;&#x914D;&#x7F6E;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3059;&#x3002; 5 &#x26;#39;DU&#x306E;&#x30D7;&#x30E9;&#x30A4;&#x30DE;&#x30FC;&#x914D;&#x5217;&#x306E;&#x3044;&#x305A;&#x308C;&#x304B;&#x306E;&#x30D9;&#x30AF;&#x30BF;&#x30FC;&#x4E0A;&#x306E;SS&#x306E;&#x62E1;&#x5F35;&#x5B50;&#x3092;&#x6301;&#x3064;&#x307E;&#x305F;&#x306F;&#x6B21;&#x306E;&#x884C;&#x306E;PCR&#x7523;&#x7269;&#x306E;SS&#x306E;&#x62E1;&#x5F35;&#x3068;&#x4E92;&#x63DB;&#x6027;&#x304C;&#x3042;&#x308A;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x5897;&#x5E45;&#x5F8C;&#x3001;&#x52A3;&#x5316;&#x30A6;&#x30E9;&#x30F3;&#x306F;&#x3001;3 &#x26;#39;&#x3001;SS&#x306E;&#x62E1;&#x5F35;&#x5B50;&#x306B;&#x631F;&#x307E;&#x308C;&#x305F;PCR&#x7523;&#x7269;&#x3092;&#x6B8B;&#x3057;USER&#x9175;&#x7D20;&#x3067;PCR&#x7523;&#x7269;&#x304B;&#x3089;&#x5207;&#x308A;&#x51FA;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x4E00;&#x7DD2;&#x306B;&#x6DF7;&#x5408;&#x3057;&#x305F;&#x3068;&#x304D;&#x306B;&#x3001;&#x7DDA;&#x72B6;&#x5316;&#x30D9;&#x30AF;&#x30BF;&#x30FC;&#x3068;PCR&#x7523;&#x7269;&#x306F;&#x3001;&#x4E00;&#x65B9;&#x5411;&#x306B;&#x76F8;&#x88DC;&#x7684;&#x306A;SS&#x306E;&#x62E1;&#x5F35;&#x5B50;&#x3092;&#x4ECB;&#x3057;&#x3066;&#x7D44;&#x63DB;&#x3048;&#x5206;&#x5B50;&#x306B;&#x7D44;&#x307F;&#x7ACB;&#x3066;&#x308B;&#x3002; PCR&#x30D7;&#x30E9;&#x30A4;&#x30DE;&#x30FC;&#x306E;&#x8A2D;&#x8A08;&#x3092;&#x5909;&#x3048;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x3001;&#x30D7;&#x30ED;&#x30C8;&#x30B3;&#x30EB;&#x306F;&#x5BB9;&#x6613;&#x306B;&#x305D;&#x306E;&#x3088;&#x3046;&#x306A;&#x30C7;&#x30A3;&#x30EC;&#x30AF;&#x30B7;&#x30E7;&#x30CA;&#x30EB;&#x30AF;&#x30ED;&#x30FC;&#x30CB;&#x30F3;&#x30B0;&#x3001;&#x90E8;&#x4F4D;&#x7279;&#x7570;&#x7684;&#x5909;&#x7570;&#x8A98;&#x767A;&#x3001;&#x914D;&#x5217;&#x306E;&#x633F;&#x5165;&#x307E;&#x305F;&#x306F;&#x6B20;&#x5931;&#x3001;&#x30B7;&#x30FC;&#x30B1;&#x30F3;&#x30B9;&#x30A2;&#x30BB;&#x30F3;&#x30D6;&#x30EA;&#x3068;&#x3057;&#x3066;1&#x3064;&#x4EE5;&#x4E0A;&#x306E;&#x540C;&#x6642;DNA&#x64CD;&#x4F5C;&#x3092;&#x5B9F;&#x884C;&#x3059;&#x308B;&#x3088;&#x3046;&#x306B;&#x69CB;&#x6210;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x3002;

&#x30A6;&#x30E9;&#x30B7;&#x30EB;&#x5207;&#x9664;&#x306B;&#x3088;&#x308B;&#x30E6;&#x30FC;&#x30B6;&#x30FC;&#x30D5;&#x30EC;&#x30F3;&#x30C9;&#x30EA;&#x30FC;&#x306A;DNA&#x5DE5;&#x5B66;&#x3084;&#x30AF;&#x30ED;&#x30FC;&#x30CB;&#x30F3;&#x30B0;&#x65B9;&#x6CD5;

&#xC5EC;&#xAE30; &#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294; PCR&#xC5D0; &#xAE30;&#xCD08;&#xB97C; &#xB454; DNA &#xC7AC;&#xC870;&#xD569; &#xBD84;&#xC790; &#xC5EC;&#xB7EC; &#xAD6C;&#xC131; &#xC694;&#xC18C;&#xC5D0;&#xC11C;&#xC758; &#xC6D0;&#xD65C;&#xD55C; &#xC5B4;&#xC148;&#xBE14;&#xB9AC;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xAE30;&#xC220; &#xACF5;&#xD559; &#xBCF4;&#xACE0;&#xC11C;. &#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294; &#xD638;&#xD658; &#xB2E8;&#xC77C; &#xAC00;&#xB2E5; (ss) &#xD655;&#xC7A5;&#xBA85;&#xC774; &#xD615;&#xBC8C; &#xD074;&#xB85C;&#xB2DD; &#xBCA1;&#xD130; &#xBC0F; &#xB300;&#xC0C1; &#xBD84;&#xC790;&#xB97C; &#xB9CC;&#xB4ED;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xBCA1;&#xD130; &#xAE08;&#xC9C0; endonuclease &#xC0AC;&#xC774;&#xD2B8; &#xAD6C;&#xBD84; &#xB450; &#xBC18;&#xBE44;&#xB840; &#xC9C0;&#xD5A5;&#xC801;&#xC778;&#xB41C; nicking endonuclease &#xC0AC;&#xC774;&#xD2B8;&#xC640; &#xCE74;&#xC138;&#xD2B8;&#xB97C; &#xD3EC;&#xD568; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. Nicking &#xC81C;&#xD55C; &#xC0AC;&#xC774;&#xD2B8; &#xC0AC;&#xC774;&#xC758; &#xACF5;&#xBC31; &#xC2DC;&#xD000;&#xC2A4; &#xC0AC;&#xC6A9;&#xC790; &#xC815;&#xC758; &#xC2DC;&#xD000;&#xC2A4;&#xC758; ss &#xD655;&#xC7A5; &#xB9CC;&#xB4E4; &#xB9DE;&#xAC8C; &#xC870;&#xC815; &#xB429;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xBCA1;&#xD130; nicking &#xBC0F; &#xC81C;&#xD55C; endonucleases &#xC18C;&#xD654; &#xD558; &#xC5EC; &#xC120;&#xD615;&#xD654; &#xB2E4;&#xC74C; &#xC774;&#xB2E4;. &#xD45C;&#xC801; &#xBD84;&#xC790;&#xB97C; &#xC0DD;&#xC131; &#xD558;&#xB824;&#xBA74; &#xB2E8;&#xC77C; deoxyuridine (&#xB4A4;) &#xCC0C; &#xAEBC; &#xAE30; &#xAC01; PCR &#xB1CC;&#xAD00;&#xC758; 5&#39;-&#xB05D;&#xC5D0;&#xC11C; 6-10 nt &#xBC30;&#xCE58; &#xB429;&#xB2C8;&#xB2E4;. 5&#39; &#xB4A4; &#xB1CC;&#xAD00; &#xC2DC;&#xD000;&#xC2A4;&#xC758; &#xBCA1;&#xD130;&#xC5D0; ss &#xD655;&#xC7A5; &#xB610;&#xB294; &#xB2E4;&#xC74C; &#xC778;&#xB77C;&#xC778; PCR &#xC81C;&#xD488;&#xC758; ss &#xD655;&#xC7A5;&#xBA85;&#xC774; &#xD638;&#xD658; &#xB429;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC99D;&#xD3ED; &#xD6C4; &#xB4A4; PCR &#xC81C;&#xD488; 3&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xD615;&#xBC8C;&#xC744; &#xB5A0;&#xB098; &#xC0AC;&#xC6A9;&#xC790; &#xD6A8;&#xC18C;&#xC640; PCR &#xC81C;&#xD488;&#xC5D0;&#xC11C; excised&#xC785;&#xB2C8;&#xB2E4; &#39; ss &#xD655;&#xC7A5;. &#xD568;&#xAED8; &#xD63C;&#xD569; &#xD558;&#xB294; &#xACBD;&#xC6B0; &#xC120;&#xD615;&#xD654; &#xBCA1;&#xD130;&#xC640; PCR &#xC81C;&#xD488;&#xC73C;&#xB85C; &#xC870;&#xB9BD;&#xC5D0; &#xBCF4;&#xC644;&#xC801;&#xC778; ss &#xD655;&#xC7A5;&#xC744; &#xD1B5;&#xD574; &#xC7AC;&#xC870;&#xD569; &#xBD84;&#xC790;. PCR &#xB1CC;&#xAD00; &#xB514;&#xC790;&#xC778;&#xC744; &#xBCC0;&#xACBD; &#xD558; &#xC5EC; &#xD504;&#xB85C;&#xD1A0;&#xCF5C;&#xC740; &#xC27D;&#xAC8C; &#xC801;&#xC751; &#xBC29;&#xD5A5; &#xBCF5;&#xC81C;, &#xC0AC;&#xC774;&#xD2B8;&#xBCC4; mutagenesis, &#xC2DC;&#xD000;&#xC2A4; &#xC0BD;&#xC785; &#xB610;&#xB294; &#xC0AD;&#xC81C; &#xBC0F; &#xC2DC;&#xD000;&#xC2A4; &#xC5B4;&#xC148;&#xBE14;&#xB9AC; &#xAC19;&#xC740; &#xD558;&#xB098; &#xB610;&#xB294; &#xADF8; &#xC774;&#xC0C1;&#xC758; &#xB3D9;&#xC2DC; DNA &#xC870;&#xC791;&#xC744; &#xC218;&#xD589; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;.

&#xC0AC;&#xC6A9;&#xC790; &#xCE5C;&#xD654;&#xC801;&#xC778; DNA &#xC5D4;&#xC9C0;&#xB2C8;&#xC5B4;&#xB9C1; &#xBC0F; uracil &#xC808;&#xB2E8; &#xD558; &#xC5EC; &#xBA54;&#xC11C;&#xB4DC;&#xB97C; &#xBCF5;&#xC81C; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;.

Aqu&#xED; se presenta una t&#xE9;cnica de ADN basada en PCR de ingenier&#xED;a para el montaje sin fisuras de las mol&#xE9;culas recombinantes a partir de varios componentes. Creamos vector de clonaci&#xF3;n y mol&#xE9;culas diana flanqueado con compatibles de cadena sencilla (ss) extensiones. El vector contiene un cassette con dos sitios de endonucleasa inversamente orientadas mellar separados por sitio de restricci&#xF3;n de endonucleasa (s). Las secuencias de espaciadores entre el muescas y los sitios de restricci&#xF3;n est&#xE1;n dise&#xF1;ados para crear extensiones de SS de secuencia personalizada. El vector se linealiz&#xF3; por digesti&#xF3;n con endonucleasas de restricci&#xF3;n y mellar. Para generar mol&#xE9;culas diana, una sola desoxiuridina (dU) residuo se coloca 6-10 nt lejos del extremo 5 &#x26;#39;de cada cebador de PCR. 5 &#x26;#39;de la secuencia del cebador dU es compatible ya sea con una extensi&#xF3;n SS en el vector o con la extensi&#xF3;n ss del producto siguiente en la l&#xED;nea de PCR. Despu&#xE9;s de la amplificaci&#xF3;n, el dU se escindi&#xF3; de los productos de PCR con la enzima USUARIO dejando los productos de PCR flanqueado por 3 &#x26;#39;extensiones ss. Cuando se mezclan, el vector linealizado y productos de PCR direccionalmente ensamblan en una mol&#xE9;cula recombinante a trav&#xE9;s de extensiones complementarias ss. Al variar el dise&#xF1;o de los cebadores de PCR, el protocolo se adapta f&#xE1;cilmente para realizar una o m&#xE1;s manipulaciones de ADN simult&#xE1;neas como la clonaci&#xF3;n direccional, la mutag&#xE9;nesis espec&#xED;fica de sitio, inserci&#xF3;n o deleci&#xF3;n de secuencia y la secuencia de montaje.

USUARIO Ingenier&#xED;a ADN amable y m&#xE9;todo de clonaci&#xF3;n por escisi&#xF3;n Uracilo

Filarial parasites (e.g., Brugia malayi, Onchocerca volvulus, and Wuchereria bancrofti) are causative agents of lymphatic filariasis and onchocerciasis, which are among the most disabling of neglected tropical diseases. There is an urgent need to develop macro-filaricidal drugs, as current anti-filarial chemotherapy (e.g., diethylcarbamazine [DEC], ivermectin and albendazole) can interrupt transmission predominantly by killing microfilariae (mf) larvae, but is less effective on adult worms, which can live for decades in the human host. All medically relevant human filarial parasites appear to contain an obligate endosymbiotic bacterium, Wolbachia. This alpha-proteobacterial mutualist has been recognized as a potential target for filarial nematode life cycle intervention, as antibiotic treatments of filarial worms harboring Wolbachia result in the loss of worm fertility and viability upon antibiotic treatments both in vitro and in vivo. Human trials have confirmed this approach, although the length of treatments, high doses required and medical counter-indications for young children and pregnant women warrant the identification of additional anti-Wolbachia drugs.

The heme biosynthetic pathway of the obligate Wolbachia endosymbiont of Brugia malayi as a potential anti-filarial drug target.

&#x4E1D;&#x866B;&#x75C5;&#x5BC4;&#x751F;&#x866B; &#xFF08;&#x5982;&#x9A6C;&#x6765;&#x3001; &#x76D8;&#x5C3E;&#x4E1D;&#x866B;&#x548C; Wuchereria bancrofti) &#x662F;&#x6DCB;&#x5DF4;&#x4E1D;&#x866B;&#x75C5;&#x548C;&#x76D8;&#x5C3E;&#x4E1D;&#x866B;&#x75C5;&#xFF0C;&#x4E5F;&#x662F;&#x6700;&#x65E0;&#x80FD;&#x7684;&#x88AB;&#x5FFD;&#x89C6;&#x7684;&#x70ED;&#x5E26;&#x75C5;&#x7684;&#x75C5;&#x539F;&#x4F53;&#x3002;&#x6709;&#x8FEB;&#x5207;&#x9700;&#x8981;&#x53D1;&#x5C55;&#x4F5C;&#x4E3A;&#x5F53;&#x524D;&#x7684;&#x5B8F; filaricidal &#x836F;&#x7269;&#x3001; &#x6297;&#x4E1D;&#x866B;&#x75C5;&#x5316;&#x7597; &#xFF08;&#x4F8B;&#x5982;&#xFF0C;diethylcarbamazine [12 &#x6708;]&#x3001; &#x4F0A;&#x7EF4;&#x83CC;&#x7D20;&#x548C;&#x963F;&#x82EF;&#x8FBE;&#x5511;&#xFF09; &#x53EF;&#x4EE5;&#x963B;&#x65AD;&#x4F20;&#x64AD;&#x4E3B;&#x8981;&#x662F;&#x901A;&#x8FC7;&#x6740;&#x6B7B;&#x5E7C;&#x866B;&#x5FAE;&#x4E1D; (mf)&#xFF0C;&#x4F46;&#x5BF9;&#x6210;&#x4EBA;&#x7684;&#x8815;&#x866B;&#xFF0C;&#x53EF;&#x4EE5;&#x6D3B;&#x51E0;&#x5341;&#x5E74;&#x6765;&#x4EBA;&#x7C7B;&#x5BBF;&#x4E3B;&#x4E2D;&#x4E0D;&#x592A;&#x6709;&#x6548;&#x3002;&#x6240;&#x6709;&#x533B;&#x5B66;&#x4E0A;&#x6709;&#x5173;&#x4EBA;&#x7C7B;&#x4E1D;&#x866B;&#x75C5;&#x5BC4;&#x751F;&#x866B;&#x4F3C;&#x4E4E;&#x5305;&#x542B;&#x9884;&#x7559; endosymbiotic &#x7EC6;&#x83CC;&#xFF0C;&#x514B;&#x6C0F;&#x3002;&#x672C;&#x963F;&#x5C14;&#x6CD5; proteobacterial &#x4E92;&#x60E0;&#x88AB;&#x89C6;&#x4E3A;&#x4E1D;&#x866B;&#x75C5;&#x7EBF;&#x866B;&#x5BFF;&#x547D;&#x5468;&#x671F;&#x5E72;&#x9884;&#x7684;&#x6F5C;&#x5728;&#x76EE;&#x6807;&#x4F5C;&#x4E3A;&#x6297;&#x751F;&#x7D20;&#x6CBB;&#x7597;&#x4E1D;&#x866B;&#x75C5;&#x8815;&#x866B;&#x7A9D;&#x85CF;&#x514B;&#x6C0F;&#x635F;&#x5931;&#x548C;&#x9020;&#x6210;&#x7684;&#x8815;&#x866B;&#x751F;&#x80B2;&#x7387;&#x5728;&#x4F53;&#x5916;&#x548C;&#x4F53;&#x5185;&#x7684;&#x6297;&#x751F;&#x7D20;&#x6CBB;&#x7597;&#x540E;&#x7684;&#x751F;&#x5B58;&#x80FD;&#x529B;&#x3002;&#x4EBA;&#x4F53;&#x8BD5;&#x9A8C;&#x8BC1;&#x5B9E;&#x4E86;&#x8FD9;&#x4E00;&#x529E;&#x6CD5;&#xFF0C;&#x867D;&#x7136;&#x957F;&#x5EA6;&#x7684;&#x6CBB;&#x7597;&#xFF0C;&#x9AD8;&#x5242;&#x91CF;&#x5FC5;&#x9700;&#x548C;&#x533B;&#x7597;&#x8C03;&#x6362;&#x4E3A;&#x5E74;&#x5E7C;&#x7684;&#x513F;&#x7AE5;&#x548C;&#x5B55;&#x5987;&#x9700;&#x8981;&#x989D;&#x5916;&#x7684;&#x6297;&#x514B;&#x6C0F;&#x6BD2;&#x54C1;&#x9274;&#x5B9A;&#x3002;

&#x8840;&#x7EA2;&#x7D20;&#x751F;&#x7269;&#x5408;&#x6210;&#x9014;&#x5F84;&#x7684;&#x9884;&#x7559;&#x7684;&#x514B;&#x6C0F; endosymbiont &#x7684;&#x9A6C;&#x6765;&#x4F5C;&#x4E3A;&#x6297;&#x4E1D;&#x866B;&#x836F;&#x7269;&#x7684;&#x6F5C;&#x5728;&#x76EE;&#x6807;&#x3002;

Filaires (par exemple, Brugia malayi, Onchocerca volvulus, Wuchereria bancrofti et) sont des agents pathog&#xE8;nes de la filariose lymphatique et l&#x26;#39;onchocercose, qui sont parmi les plus invalidantes des maladies tropicales n&#xE9;glig&#xE9;es. Il ya un besoin urgent de d&#xE9;velopper des macro-filaricide m&#xE9;dicaments, comme courant anti-filarienne la chimioth&#xE9;rapie (par exemple, la di&#xE9;thylcarbamazine [DEC], l&#x26;#39;ivermectine et l&#x26;#39;albendazole) peut interrompre la transmission principalement en tuant les microfilaires (mf) larves, mais est moins efficace sur les vers adultes, qui peut vivre pendant des d&#xE9;cennies dans l&#x26;#39;h&#xF4;te humain. Tous les m&#xE9;dicalement pertinents relatifs filaires semblent contenir une bact&#xE9;rie endosymbiotique obligatoire, Wolbachia. Cette mutualiste alpha-prot&#xE9;obact&#xE9;ries a &#xE9;t&#xE9; reconnue comme une cible potentielle pour l&#x26;#39;intervention des n&#xE9;matodes filaires cycle de vie, comme des traitements antibiotiques de filaires h&#xE9;bergeant r&#xE9;sultat Wolbachia dans la perte de la fertilit&#xE9; et la viabilit&#xE9; ver sur les traitements antibiotiques &#xE0; la fois in vitro et in vivo. Essais chez l&#x26;#39;homme ont confirm&#xE9; cette approche, bien que la longueur des traitements, des doses &#xE9;lev&#xE9;es requises et les contre-indications m&#xE9;dicales pour les jeunes enfants et les femmes enceintes justifier l&#x26;#39;identification d&#x26;#39;autres m&#xE9;dicaments anti-Wolbachia.

La voie de biosynth&#xE8;se de l&#x26;#39;h&#xE8;me Obligate endosymbiote Wolbachia de Brugia malayi comme une cible th&#xE9;rapeutique anti-filarienne potentiel

Filarial Parasiten (z.B. Brugia Malayi, Onchocerca Volvulus und Wuchereria Bancrofti) sind Erreger der Elephantiasis und Onchozerkose, die zu den meisten Deaktivieren von vernachl&auml;ssigten Tropenkrankheiten. Es ist dringend notwendig f&uuml;r die Entwicklung von Makro-Filaricidal Arzneimittel, als aktuelle Anti-filarial Chemotherapie (z. B. Diethylcarbamazine [Dez], Ivermectin und Albendazol) k&ouml;nnen &uuml;berwiegend &Uuml;bertragung unterbrechen, durch das T&ouml;ten von Larven Mikrofilarien (mf), aber ist weniger effektiv auf die Erwachsenen W&uuml;rmer, die jahrzehntelang im menschlichen Wirt leben k&ouml;nnen. Alle medizinisch relevante menschliche filarial Parasiten scheinen ein obligat Endosymbiotic Bakterium Wolbachia enthalten. Diese Alpha-Proteobacterial mutualistisch wurde als m&ouml;gliches Angriffsziel filarial Fadenwurm-Lebenszyklus Intervention, als Antibiotika filarial W&uuml;rmer beherbergen Wolbachia Ergebnis zum Verlust der Wurm Fruchtbarkeit und Lebensf&auml;higkeit auf Antibiotika in vitro und in-vivo erkannt. Menschliche Studien haben diesen Ansatz best&auml;tigt, obwohl die L&auml;nge der Behandlungen, hohe erforderliche und medizinische Gegenanzeigen f&uuml;r kleine Kinder Dosen und schwangere Frauen die Identifizierung von zus&auml;tzlichen Anti-Wolbachia Drogen garantieren.

Es der H&auml;m biosynthetischen Weg die obligat Wolbachia Endosymbionten von Brugia Malayi als m&ouml;gliches Angriffsziel Anti-filarial Droge.

Parassiti filarial (ad es., Brugia malayi, l&#39;Onchocerca volvulus e Wuchereria bancrofti) sono agenti eziologici di Filariosi linfatica e l&#39;oncocercosi, che sono tra le pi&ugrave; invalidanti di malattie tropicali trascurate. C&#39;&egrave; un bisogno urgente di sviluppare farmaci macro-filaricidal, come corrente anti-filarial chemioterapia (ad es., diethylcarbamazine [DEC], ivermectina e albendazolo) pu&ograve; interrompere la trasmissione prevalentemente uccidendo le larve microfilarie (mf), ma &egrave; meno efficacia sui vermi adulti, che possono vivere per decenni nell&#39;ospite umano. Tutti clinicamente rilevanti parassiti filarial umani sembrano contenere un batterio obligate endosimbiosi, Wolbachia. Questa alfa-proteobacterial mutualistico &egrave; stato riconosciuto come un obiettivo potenziale per intervento filarial nematode ciclo di vita, come trattamenti antibiotici di vermi filarial harboring Wolbachia risultato nella perdita del verme fertilit&agrave; e vitalit&agrave; dopo trattamenti antibiotici sia in vitro che in vivo. Studi sull&#39;uomo hanno confermato questo approccio, anche se la lunghezza dei trattamenti, alte dosi controindicazioni mediche e richiesti per i bambini e donne incinte garantiscono l&#39;identificazione dei farmaci anti-Wolbachia supplementari.

Il pathway biosintetico dell&#39;eme dell&#39;endosimbionte Wolbachia obligate di malayi Brugia come un potenziale bersaglio di farmaci anti-filarial.

&#x30D5;&#x30A3;&#x30E9;&#x30EA;&#x30A2;&#x5BC4;&#x751F;&#x866B;&#xFF08;&#x4F8B;&#x3048;&#x3070;&#x3001;&#x30DE;&#x30EC;&#x30FC;&#x7CF8;&#x72B6;&#x866B;&#x3001;&#x56DE;&#x65CB;&#x7CF8;&#x72B6;&#x866B;&#x3001;&#x3068;&#x30D0;&#x30F3;&#x30AF;&#x30ED;&#x30D5;&#x30C8;&#x7CF8;&#x72B6;&#x866B;&#xFF09;&#x304C;&#x9867;&#x307F;&#x3089;&#x308C;&#x306A;&#x3044;&#x71B1;&#x5E2F;&#x75C5;&#x306E;&#x7121;&#x52B9;&#x6700;&#x3082;&#x306E;&#x4E00;&#x3064;&#x3067;&#x3042;&#x308B;&#x30EA;&#x30F3;&#x30D1;&#x7CFB;&#x30D5;&#x30A3;&#x30E9;&#x30EA;&#x30A2;&#x75C7;&#x3068;&#x30AA;&#x30F3;&#x30B3;&#x30BB;&#x30EB;&#x30AB;&#x75C7;&#x306E;&#x539F;&#x56E0;&#x7269;&#x8CEA;&#x3067;&#x3042;&#x308B;&#x3002;&#x73FE;&#x5728;&#x306E;&#x6297;&#x30D5;&#x30A3;&#x30E9;&#x30EA;&#x30A2;&#x5316;&#x5B66;&#x7642;&#x6CD5;&#x3068;&#x3057;&#x3066;&#x3001;&#x30DE;&#x30AF;&#x30ED;filaricidal&#x85AC;&#x3092;&#x958B;&#x767A;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x7DCA;&#x6025;&#x306B;&#x5FC5;&#x8981;&#x304C;&#x3042;&#x308B;&#xFF08;&#x4F8B;&#x3048;&#x3070;&#x3001;&#x30B8;&#x30A8;&#x30C1;&#x30EB;&#x30AB;&#x30EB;&#x30D0;&#x30DE;&#x30B8;&#x30F3;[DEC]&#x3001;&#x30A4;&#x30D9;&#x30EB;&#x30E1;&#x30AF;&#x30C1;&#x30F3;&#x3068;&#x30A2;&#x30EB;&#x30D9;&#x30F3;&#x30C0;&#x30BE;&#x30FC;&#x30EB;&#xFF09;&#x306F;&#x30DF;&#x30AF;&#x30ED;&#x30D5;&#x30A3;&#x30E9;&#x30EA;&#x30A2;&#xFF08;MF&#xFF09;&#x306E;&#x5E7C;&#x866B;&#x3092;&#x6BBA;&#x3059;&#x3053;&#x3068;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x3001;&#x4E3B;&#x306B;&#x4F1D;&#x9001;&#x3092;&#x4E2D;&#x65AD;&#x3059;&#x308B;&#x304C;&#x3001;&#x6210;&#x866B;&#x306B;&#x306F;&#x3042;&#x307E;&#x308A;&#x52B9;&#x679C;&#x7684;&#x3067;&#x3042;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x3067;&#x304D;&#x3001;&#x3053;&#x308C;&#x306F;&#x3001;&#x30D2;&#x30C8;&#x5BBF;&#x4E3B;&#x306B;&#x4F55;&#x5341;&#x5E74;&#x3082;&#x751F;&#x304D;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x3067;&#x304D;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3059;&#x3079;&#x3066;&#x306E;&#x533B;&#x5B66;&#x7684;&#x306B;&#x95A2;&#x9023;&#x3059;&#x308B;&#x4EBA;&#x9593;&#x306E;&#x30D5;&#x30A3;&#x30E9;&#x30EA;&#x30A2;&#x5BC4;&#x751F;&#x866B;&#x306F;&#x5ACC;&#x6C17;&#x5171;&#x751F;&#x7D30;&#x83CC;&#x30DC;&#x30EB;&#x30D0;&#x30AD;&#x30A2;&#x3092;&#x542B;&#x3080;&#x3088;&#x3046;&#x306B;&#x8868;&#x793A;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3053;&#x306E;&#x3B1;-&#x30D7;&#x30ED;&#x30C6;&#x30AA;&#x30D0;&#x30AF;&#x30C6;&#x30EA;&#x30A2;&#x76F8;&#x4E92;&#x4E3B;&#x7FA9;&#x306F;&#x3001;in vitro&#x304A;&#x3088;&#x3073;in vivo&#x306E;&#x4E21;&#x65B9;&#x306E;&#x6297;&#x751F;&#x7269;&#x8CEA;&#x6CBB;&#x7642;&#x6642;&#x306B;&#x30EF;&#x30FC;&#x30E0;&#x306E;&#x80A5;&#x6C83;&#x5EA6;&#x3068;&#x751F;&#x5B58;&#x7387;&#x306E;&#x4F4E;&#x4E0B;&#x306B;&#x30DC;&#x30EB;&#x30D0;&#x30AD;&#x30A2;&#x306E;&#x7D50;&#x679C;&#x3092;&#x4FDD;&#x6709;&#x3059;&#x308B;&#x30D5;&#x30A3;&#x30E9;&#x30EA;&#x30A2;&#x30EF;&#x30FC;&#x30E0;&#x306E;&#x6297;&#x751F;&#x7269;&#x8CEA;&#x306E;&#x6CBB;&#x7642;&#x6CD5;&#x3068;&#x3057;&#x3066;&#x3001;&#x30D5;&#x30A3;&#x30E9;&#x30EA;&#x30A2;&#x7DDA;&#x866B;&#x306E;&#x30E9;&#x30A4;&#x30D5;&#x30B5;&#x30A4;&#x30AF;&#x30EB;&#x306E;&#x4ECB;&#x5165;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x6F5C;&#x5728;&#x7684;&#x306A;&#x30BF;&#x30FC;&#x30B2;&#x30C3;&#x30C8;&#x3068;&#x3057;&#x3066;&#x8A8D;&#x8B58;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x6CBB;&#x7642;&#x306E;&#x9577;&#x3055;&#x3001;&#x9AD8;&#x7528;&#x91CF;&#x304C;&#x5FC5;&#x8981;&#x306A;&#x3082;&#x306E;&#x306E;&#x3001;&#x4EBA;&#x9593;&#x306E;&#x81E8;&#x5E8A;&#x8A66;&#x9A13;&#x306F;&#x3001;&#x3053;&#x306E;&#x30A2;&#x30D7;&#x30ED;&#x30FC;&#x30C1;&#x3092;&#x78BA;&#x8A8D;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x3068;&#x5E7C;&#x3044;&#x5B50;&#x3069;&#x3082;&#x3084;&#x598A;&#x5A20;&#x4E2D;&#x306E;&#x5973;&#x6027;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x533B;&#x7642;&#x30AB;&#x30A6;&#x30F3;&#x30BF;&#x8868;&#x793A;&#x306F;&#x3001;&#x8FFD;&#x52A0;&#x306E;&#x6297;&#x30DC;&#x30EB;&#x30D0;&#x30AD;&#x30A2;&#x85AC;&#x306E;&#x8B58;&#x5225;&#x3092;&#x4FDD;&#x8A3C;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

&#x6F5C;&#x5728;&#x7684;&#x306A;&#x6297;&#x30D5;&#x30A3;&#x30E9;&#x30EA;&#x30A2;&#x85AC;&#x7269;&#x6A19;&#x7684;&#x3068;&#x3057;&#x3066;&#x306E;&#x30DE;&#x30EC;&#x30FC;&#x7CF8;&#x72B6;&#x866B;&#x306E;&#x5ACC;&#x6C17;&#x30DC;&#x30EB;&#x30D0;&#x30AD;&#x30A2;&#x7D30;&#x80DE;&#x5185;&#x5171;&#x751F;&#x306E;&#x30D8;&#x30E0;&#x751F;&#x5408;&#x6210;&#x7D4C;&#x8DEF;

Filarial &#xAE30;&#xC0DD;&#xCDA9; (&#xC608;&#xB97C; &#xB4E4;&#xC5B4;, Brugia malayi, Onchocerca&#xB3C4; volvulus &#xBC0F; &#xC0AC; &#xC0C1;&#xCDA9;)&#xC740; &#xB9BC;&#xD504; filariasis&#xC640; &#xC0C1;&#xCDA9;, &#xAC00;&#xC7A5; &#xBB34;&#xB2A5; &#xC18C;&#xD640;&#xD788; &#xC5F4; &#xB300; &#xC9C8;&#xBCD1; &#xC911;&#xC758; &#xC6D0;&#xC778;&#xC774; &#xB418;&#xB294; &#xC5D0;&#xC774;&#xC804;&#xD2B8;. &#xD604;&#xC7AC; &#xB9E4;&#xD06C;&#xB85C; filaricidal &#xC57D;&#xBB3C; &#xAC1C;&#xBC1C; &#xAE34;&#xAE09; &#xD55C; &#xD544;&#xC694;&#xAC00; &#xC548;&#xD2F0; filarial &#xD654;&#xD559; &#xC694;&#xBC95; (&#xC608;&#xB97C; &#xB4E4;&#xC5B4;,: diethylcarbamazine [12 &#xC6D4;], &#xAE30; &#xC0DD;&#xC120; &#xCDA9; &#xC57D; &#xBC0F; albendazole) microfilariae (mf) &#xC560;&#xBC8C;&#xB808;&#xB97C; &#xC8FD; &#xC5EC; &#xC8FC;&#xB85C; &#xC804;&#xC1A1;&#xC744; &#xC911;&#xB2E8;&#xD560; &#xC218; &#xC788;&#xC9C0;&#xB9CC; &#xC778;&#xAC04;&#xC758; &#xD638;&#xC2A4;&#xD2B8;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC218;&#xC2ED; &#xB144; &#xB3D9;&#xC548; &#xC0B4; &#xC218; &#xC788;&#xB294; &#xC131;&#xC778; &#xBC8C;&#xB808;&#xC5D0; &#xB35C; &#xD6A8;&#xACFC;&#xC801; &#xC774;&#xB2E4;. &#xBAA8;&#xB4E0; &#xC758;&#xD559; &#xAD00;&#xB828; &#xC778;&#xAC04; filarial &#xAE30;&#xC0DD;&#xCDA9;&#xC744; &#xC758;&#xBB34; endosymbiotic &#xBC15;&#xD14C;&#xB9AC;&#xC544; Wolbachia &#xD3EC;&#xD568; &#xB098;&#xD0C0;&#xB0A9;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC774; &#xC54C;&#xD30C;-proteobacterial mutualist filarial &#xC120; &#xCDA9; &#xB958; &#xB77C;&#xC774;&#xD504; &#xC0AC;&#xC774;&#xD074;&#xC758; &#xAC1C;&#xC785;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC7A0;&#xC7AC;&#xC801;&#xC778; &#xB300;&#xC0C1;&#xC73C;&#xB85C; filarial &#xC6DC; &#xC6DC; &#xC0B0;&#xACFC; &#xC0DD;&#xCCB4; &#xC678; &#xBC0F; &#xC0DD;&#xCCB4; &#xC870;&#xAC74; &#xD56D;&#xC0DD;&#xC81C; &#xCE58;&#xB8CC; &#xC2DC; &#xC0DD;&#xC874; &#xB2A5;&#xB825;&#xC758; &#xC190;&#xC2E4;&#xC5D0;&#xC11C; Wolbachia &#xACB0;&#xACFC; &#xC740;&#xB2C9;&#xC758; &#xD56D;&#xC0DD;&#xC81C; &#xCE58;&#xB8CC;&#xB85C; &#xC778;&#xC815;&#xC744; &#xBC1B;&#xACE0; &#xC788;&#xB2E4;. &#xC778;&#xCCB4; &#xC2E4;&#xD5D8; &#xBE44;&#xB85D; &#xB192;&#xC740; &#xCE58;&#xB8CC;&#xC758; &#xAE38;&#xC774; &#xC138;&#xC774; &#xD558; &#xC790;&#xB140;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xD544;&#xC218; &#xBC0F; &#xC758;&#xB8CC; counter-indications &#xBCF5;&#xC6A9; &#xD558; &#xACE0; &#xC784;&#xC2E0; &#xBCF4;&#xC99D; &#xCD94;&#xAC00; &#xC548;&#xD2F0; Wolbachia &#xC57D;&#xBB3C;&#xC758; &#xC2DD;&#xBCC4;&#xC774;&#xC774; &#xBC29;&#xBC95;&#xC744; &#xD655;&#xC778; &#xD588;&#xB2E4;.

&#xC7A0;&#xC7AC;&#xC801;&#xC778; &#xC548;&#xD2F0; filarial &#xC57D;&#xD488; &#xB300;&#xC0C1;&#xC73C;&#xB85C; Brugia malayi&#xC758; &#xC758;&#xBB34; Wolbachia endosymbiont&#xC758; heme &#xC0DD; &#xD569;&#xC131; &#xD1B5;&#xB85C;.

Filarial par&#xE1;sitos (por ejemplo, Brugia malayi, Onchocerca volvulus y Wuchereria bancrofti) son agentes causales de la filariasis linf&#xE1;tica y la oncocercosis, que est&#xE1;n entre la mayor&#xED;a de la desactivaci&#xF3;n de las enfermedades tropicales desatendidas. Hay una necesidad urgente de desarrollar macro-filaricidal las drogas, como corriente de lucha contra la filaria la quimioterapia (por ejemplo, la dietilcarbamazina [diciembre], la ivermectina y albendazol) puede interrumpir la transmisi&#xF3;n predominantemente por matar microfilarias (mf) las larvas, pero es menos eficaz sobre los gusanos adultos, que puede vivir durante d&#xE9;cadas en el hu&#xE9;sped humano. Todos los relevancia m&#xE9;dica filarial par&#xE1;sitos humanos parecen contener una bacteria endosimbi&#xF3;tica obligada, Wolbachia. Esta mutualista alfa-proteobacterial ha sido reconocido como un objetivo potencial para la intervenci&#xF3;n del ciclo nematodo filarial la vida, como los tratamientos con antibi&#xF3;ticos de filarias que albergan Wolbachia en consecuencia la p&#xE9;rdida de la fertilidad y la viabilidad del gusano en los tratamientos con antibi&#xF3;ticos, tanto in vitro como in vivo. Estudios en humanos han confirmado este enfoque, aunque la duraci&#xF3;n de los tratamientos, las altas dosis requerida y contraindicaciones m&#xE9;dicas para los ni&#xF1;os peque&#xF1;os y mujeres embarazadas garantiza la identificaci&#xF3;n de nuevos f&#xE1;rmacos anti-Wolbachia.

La ruta biosint&#xE9;tica del hemo de la endosimbionte Wolbachia obligado de Brugia malayi como una diana terap&#xE9;utica potencial contra la filaria

5-&#x7532;&#x57FA;&#x80DE;&#x5627;&#x5576;&#xFF0C;&#x5B83;&#x53C2;&#x52A0;&#x4E86;&#x5728;&#x5F00;&#x53D1;&#x548C;&#x75BE;&#x75C5;&#x7684;&#x53D1;&#x5C55;&#x8FC7;&#x7A0B;&#x7684;&#x57FA;&#x56E0;&#x8F6C;&#x5F55;&#x6291;&#x5236;&#x9176;&#x4FEE;&#x6539;&#xFF0C;&#x80DE;&#x5627;&#x5576;&#x6B8B;&#x7559;&#x7684;&#x810A;&#x690E;&#x52A8;&#x7269;&#x7684;&#x57FA;&#x56E0;&#x7EC4;&#x4E2D;&#x3002;5-&#x7532;&#x57FA;&#x80DE;&#x5627;&#x5576;&#x53EF;&#x8FDB;&#x4E00;&#x6B65;&#x9176;&#x4FEE;&#x6539;&#x4E3A; 5 hydroxymethylcytosine &#x7531; TET &#x5BB6;&#x65CF;&#x7684;&#x53CC;&#x52A0;&#x6C27;&#x9176;&#x7532;&#x57FA;&#x80DE;&#x5627;&#x5576;&#x3002;5-&#x7532;&#x57FA;&#x80DE;&#x5627;&#x5576;&#x4E0E; 5 hydroxymethylcytosine &#x5206;&#x6790;&#x8499;&#x7F9E;&#xFF0C;&#x56E0;&#x4E3A;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x4FEE;&#x6539;&#x662F;&#x7531;&#x4F20;&#x7EDF;&#x7684;&#x6D4B;&#x5E8F;&#x65B9;&#x6CD5;&#x751A;&#x81F3;&#x5F53;&#x8F85;&#x4E4B;&#x4EE5;&#x4E9A;&#x786B;&#x9178;&#x8F6C;&#x6362;&#x65F6;&#x65E0;&#x6CD5;&#x533A;&#x5206;&#x3002;&#x5728;&#x8FD9;&#x91CC;&#x6211;&#x4EEC;&#x6F14;&#x793A;&#x4E00;&#x4E2A;&#x7B80;&#x5355;&#x7684;&#x9176;&#x65B9;&#x6CD5;&#x6D89;&#x53CA;&#x5230;&#x514B;&#x9686;&#x3001; &#x9274;&#x5B9A;&#x53CA;&#x5B9A;&#x91CF;&#x5316; 5 hydroxymethylcytosine &#x4E2D;&#x5404;&#x79CD; CCGG &#x57FA;&#x56E0;&#x5728;&#x5C0F;&#x9F20;&#x548C;&#x4EBA;&#x7C7B;&#x7684;&#x57FA;&#x56E0;&#x7EC4;&#x5185;&#x3002;5 Hydroxymethylcytosine &#x662F;&#x666E;&#x904D;&#x5B58;&#x5728;&#x7684;&#x4EBA;&#x7C7B;&#x548C;&#x5C0F;&#x9F20;&#x5927;&#x8111;&#x548C;&#x5FC3;&#x810F;&#x5728;&#x51E0;&#x4E2A;&#x533A;&#x57DF;&#x7684;&#x57FA;&#x56E0;&#x7EC4; Dna&#x3002;&#x4F53;&#x5916;&#x57F9;&#x517B;&#x7684;&#x7EC6;&#x80DE; NIH3T3 &#x548C; HeLa &#x5F88;&#x4F4E;&#x6216;&#x65E0;&#x6CD5;&#x68C0;&#x6D4B;&#x6570;&#x91CF;&#x7684; 5 hydroxymethylcytosine &#x5C55;&#x51FA;&#x68C0;&#x67E5;&#x57FA;&#x56E0;&#x4F4D;&#x70B9;&#x3002;&#x6709;&#x8DA3;&#x7684;&#x662F;&#xFF0C;5 hydroxymethylcytosine &#x7EA7;&#x522B;&#x5728;&#x5C0F;&#x9F20;&#x80DA;&#x80CE;&#x5E72;&#x7EC6;&#x80DE;&#x4E2D;&#x7684; DNA &#x9996;&#x5148;&#x589E;&#x52A0;&#x7136;&#x540E;&#x6162;&#x6162;&#x4E0B;&#x964D;&#x540E;&#x5B9A;&#x5411;&#x8BF1;&#x5BFC;&#x5206;&#x5316;&#x4E3A;&#x80DA;&#x4F53;&#xFF0C;&#x800C;&#x968F;&#x7740;&#x65F6;&#x95F4;&#x7684;&#x63A8;&#x79FB;&#x9010;&#x6E10;&#x589E;&#x52A0;&#x7684; 5-&#x7532;&#x57FA;&#x80DE;&#x5627;&#x5576;&#x7EA7;&#x522B;&#x3002;&#x6700;&#x540E;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x7528;&#x5B9A;&#x91CF; PCR &#x65B9;&#x6CD5;&#xFF0C;&#x5EFA;&#x7ACB; VANGL1 &#x548C; EGFR &#x57FA;&#x56E0;&#x4F53;&#x7532;&#x57FA;&#x5316;&#x4EBA;&#x4F53;&#x7EC4;&#x7EC7; DNA &#x6837;&#x54C1;&#x4E2D;&#x7684;&#x4E00;&#x90E8;&#x5206;&#x786E;&#x5B9E;&#x662F;&#x7F9F;&#x7532;&#x57FA;&#x5316;&#x3002;

&#x7EC4;&#x7EC7;&#x7279;&#x5F02;&#x6027;&#x5206;&#x5E03;&#x548C;&#x52A8;&#x6001;&#x53D8;&#x5316;&#x7684; 5 hydroxymethylcytosine &#x54FA;&#x4E73;&#x52A8;&#x7269;&#x57FA;&#x56E0;&#x7EC4;&#x4E2D;&#x3002;

Cytosine residues in the vertebrate genome are enzymatically modified to 5-methylcytosine, which participates in transcriptional repression of genes during development and disease progression. 5-Methylcytosine can be further enzymatically modified to 5-hydroxymethylcytosine by the TET family of methylcytosine dioxygenases. Analysis of 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine is confounded, as these modifications are indistinguishable by traditional sequencing methods even when supplemented by bisulfite conversion. Here we demonstrate a simple enzymatic approach that involves cloning, identification, and quantification of 5-hydroxymethylcytosine in various CCGG loci within murine and human genomes. 5-Hydroxymethylcytosine was prevalent in human and murine brain and heart genomic DNAs at several regions. The cultured cell lines NIH3T3 and HeLa both displayed very low or undetectable amounts of 5-hydroxymethylcytosine at the examined loci. Interestingly, 5-hydroxymethylcytosine levels in mouse embryonic stem cell DNA first increased then slowly decreased upon differentiation to embryoid bodies, whereas 5-methylcytosine levels increased gradually over time. Finally, using a quantitative PCR approach, we established that a portion of VANGL1 and EGFR gene body methylation in human tissue DNA samples is indeed hydroxymethylation.

Tissue-specific distribution and dynamic changes of 5-hydroxymethylcytosine in mammalian genomes.

R&#xE9;sidus cytosine dans le g&#xE9;nome des vert&#xE9;br&#xE9;s sont modifi&#xE9;s par voie enzymatique en 5-m&#xE9;thylcytosine, qui participe &#xE0; la r&#xE9;pression transcriptionnelle des g&#xE8;nes lors de la progression du d&#xE9;veloppement et de la maladie. La 5-m&#xE9;thylcytosine peut &#xEA;tre en outre modifi&#xE9;s par voie enzymatique &#xE0; 5-hydroxym&#xE9;thylcytosine par la famille des TET dioxyg&#xE9;nases m&#xE9;thylcytosine. Analyse de la 5-m&#xE9;thylcytosine et 5-hydroxym&#xE9;thylcytosine se confond, comme ces modifications ne se distinguent pas par des m&#xE9;thodes de s&#xE9;quen&#xE7;age traditionnelles m&#xEA;me lorsque compl&#xE9;t&#xE9;es par conversion au bisulfite. Ici, nous d&#xE9;montrons une approche enzymatique simple qui implique le clonage, l&#x26;#39;identification et la quantification de la 5-hydroxym&#xE9;thylcytosine dans loci CCSGE diverses au sein de g&#xE9;nomes murin et humain. 5-hydroxym&#xE9;thylcytosine &#xE9;tait r&#xE9;pandu dans le cerveau humain et murin et ADN g&#xE9;nomiques cardiaques &#xE0; plusieurs r&#xE9;gions. La culture de cellules NIH3T3 et HeLa lignes &#xE0; la fois affich&#xE9; des quantit&#xE9;s tr&#xE8;s faibles ou ind&#xE9;tectables de la 5-hydroxym&#xE9;thylcytosine au niveau des loci examin&#xE9;s. Fait int&#xE9;ressant, 5-hydroxym&#xE9;thylcytosine niveaux de la souris sur les cellules souches embryonnaires d&#x26;#39;ADN ont d&#x26;#39;abord augment&#xE9;, puis diminu&#xE9; lentement lors de la diff&#xE9;renciation de corps embryo&#xEF;des, tandis que 5-m&#xE9;thylcytosine niveaux a augment&#xE9; graduellement au fil du temps. Enfin, en utilisant une approche PCR quantitative, nous avons &#xE9;tabli qu&#x26;#39;une partie de VANGL1 et la m&#xE9;thylation du g&#xE8;ne EGFR dans le corps de l&#x26;#39;homme des &#xE9;chantillons d&#x26;#39;ADN des tissus est en effet hydroxym&#xE9;thylation.

Tissu-sp&#xE9;cifique de distribution et les changements dynamiques de la 5-hydroxym&#xE9;thylcytosine dans g&#xE9;nomes de mammif&#xE8;res

Cytosin R&uuml;ckst&auml;nde im vertebrate Genom werden enzymatisch zu 5-Methylcytosine, modifiziert die transkriptionelle Unterdr&uuml;ckung von Genen in Entwicklung und Fortschreiten der Krankheit beteiligt. 5-Methylcytosine kann weitere enzymatisch zu 5-Hydroxymethylcytosine von der Familie TET Methylcytosine Dioxygenases ge&auml;ndert werden. Analyse der 5-Methylcytosine und 5-Hydroxymethylcytosine wird durcheinander gebracht, da diese &Auml;nderungen von traditionellen Sequenzierung Methoden selbst wenn erg&auml;nzt durch Bisulfit-Konvertierung nicht zu unterscheiden sind. Hier zeigen wir einen einfachen enzymatischen Ansatz, bei der Klonierung, Identifizierung und Quantifizierung von 5-Hydroxymethylcytosine in verschiedenen CCGG-Loci im murinen und menschliche Genome. 5-Hydroxymethylcytosine wurde weit verbreitet in Menschen- und Murine Gehirn und Herz genomische DNA in mehreren Regionen. Die kultivierten Zelllinien NIH3T3 und HeLa beide sehr geringe oder nicht nachweisbar Mengen von 5-Hydroxymethylcytosine am untersuchten Loci angezeigt. Interessant ist, 5-Hydroxymethylcytosine Ebenen im embryonalen Stammzellen der Maus DNA zun&auml;chst erh&ouml;ht dann langsam sank auf Differenzierung Embryoid K&ouml;rper, w&auml;hrend 5-Methylcytosine allm&auml;hlich im Laufe der Zeit zugenommen. Schlie&szlig;lich festgestellt mit einen quantitativen PCR-Ansatz, wir, da&szlig; ein Teil der VANGL1 und EGFR-gen-K&ouml;rper-Methylierung in DNA-Proben von Humangewebe in der Tat Hydroxymethylation ist.

Gewebe-spezifischen Distribution und dynamischen &Auml;nderungen des 5-Hydroxymethylcytosine in den S&auml;ugetier-Genome.

Residui della citosina nel genoma vertebrato sono modificati enzimaticamente a 5-metilcitosina, che partecipa alla repressione trascrizionale dei geni durante lo sviluppo e la progressione della malattia. 5-Metilcitosina pu&ograve; essere ulteriormente enzimaticamente modificata a 5-idrossimetilcitosina dalla famiglia TET metilcitosina diossigenasi. Analisi di 5-metilcitosina e 5-idrossimetilcitosina sono confuso, queste modifiche sono indistinguibili dai metodi di sequenziamento tradizionale anche quando completate dalla conversione del bisolfuro. Qui mostriamo un semplice approccio enzimatico che coinvolge la clonazione, identificazione e quantificazione di 5-idrossimetilcitosina in vari loci CCGG all&#39;interno del genoma murino ed umano. 5-Idrossimetilcitosina era prevalente nell&#39;umano e murino del cervello e il cuore DNAs genomic in parecchie regioni. Le linee di coltura delle cellule NIH3T3 e HeLa entrambi visualizzati gli importi molto bassi o non rilevabili di 5-idrossimetilcitosina presso i loci esaminati. &Egrave; interessante notare, livelli 5-idrossimetilcitosina in mouse embryonic stem cell DNA prima aumentato allora diminuito lentamente sulla differenziazione di corpi embryoid, considerando che la 5-metilcitosina livelli aumentati gradualmente nel tempo. Infine, utilizzando un approccio PCR quantitativo, abbiamo stabilito che una porzione di metilazione VANGL1 ed EGFR corpo di gene in campioni di DNA di tessuto umano &egrave; davvero hydroxymethylation.

Distribuzione di tessuto-specifici e cambiamenti dinamici di 5-idrossimetilcitosina nei genomi dei mammiferi.

&#x810A;&#x690E;&#x52D5;&#x7269;&#x306E;&#x30B2;&#x30CE;&#x30E0;&#x4E2D;&#x306E;&#x30B7;&#x30C8;&#x30B7;&#x30F3;&#x6B8B;&#x57FA;&#x304C;&#x9175;&#x7D20;&#x306E;&#x958B;&#x767A;&#x3068;&#x75BE;&#x60A3;&#x306E;&#x9032;&#x884C;&#x4E2D;&#x306B;&#x3001;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x306E;&#x8EE2;&#x5199;&#x6291;&#x5236;&#x306B;&#x95A2;&#x4E0E;&#x3059;&#x308B;5  - &#x30E1;&#x30C1;&#x30EB;&#x30B7;&#x30C8;&#x30B7;&#x30F3;&#x306B;&#x5909;&#x66F4;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3059;&#x3002; 5  - &#x30E1;&#x30C1;&#x30EB;&#x30B7;&#x30C8;&#x30B7;&#x30F3;&#x306F;&#x3001;&#x3055;&#x3089;&#x306B;&#x9175;&#x7D20;&#x7684;&#x306B;&#x30E1;&#x30C1;&#x30EB;&#x30B8;&#x30AA;&#x30AD;&#x30B7;&#x30B2;&#x30CA;&#x30FC;&#x30BC;&#x306E;TET&#x5BB6;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;5-hydroxymethylcytosine&#x306B;&#x5909;&#x66F4;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x3067;&#x304D;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x5909;&#x66F4;&#x306F;&#x3001;&#x4E9C;&#x786B;&#x9178;&#x6C34;&#x7D20;&#x5869;&#x5909;&#x63DB;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x88DC;&#x5B8C;&#x3055;&#x3082;&#x5F93;&#x6765;&#x306E;&#x30B7;&#x30FC;&#x30B1;&#x30F3;&#x30B9;&#x6CD5;&#x306B;&#x3088;&#x308B;&#x533A;&#x5225;&#x304C;&#x3064;&#x304B;&#x306A;&#x3044;&#x3088;&#x3046;&#x306B;5  - &#x30E1;&#x30C1;&#x30EB;&#x30B7;&#x30C8;&#x30B7;&#x30F3;&#x3001;5  -  hydroxymethylcytosine&#x306E;&#x5206;&#x6790;&#x306F;&#x3001;&#x6DF7;&#x4E71;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3053;&#x3053;&#x3067;&#x306F;&#x3001;&#x30AF;&#x30ED;&#x30FC;&#x30F3;&#x4F5C;&#x6210;&#x3001;&#x8B58;&#x5225;&#x3001;&#x30DE;&#x30A6;&#x30B9;&#x3068;&#x30D2;&#x30C8;&#x306E;&#x30B2;&#x30CE;&#x30E0;&#x5185;&#x306E;&#x69D8;&#x3005;&#x306A;CCGG&#x5EA7;&#x306E;5-hydroxymethylcytosine&#x306E;&#x5B9A;&#x91CF;&#x5316;&#x3092;&#x542B;&#x3080;&#x5358;&#x7D14;&#x306A;&#x9175;&#x7D20;&#x306E;&#x30A2;&#x30D7;&#x30ED;&#x30FC;&#x30C1;&#x3092;&#x793A;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002; 5 Hydroxymethylcytosine&#x306F;&#x3001;&#x3044;&#x304F;&#x3064;&#x304B;&#x306E;&#x5730;&#x57DF;&#x3067;&#x306E;&#x30D2;&#x30C8;&#x304A;&#x3088;&#x3073;&#x30DE;&#x30A6;&#x30B9;&#x306E;&#x8133;&#x3084;&#x5FC3;&#x81D3;&#x306E;&#x30B2;&#x30CE;&#x30E0;DNA&#x3067;&#x6D41;&#x884C;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x305F;&#x3002;&#x57F9;&#x990A;&#x7D30;&#x80DE;&#x682A;NIH3T3&#x304A;&#x3088;&#x3073;HeLa&#x306E;&#x4E21;&#x65B9;&#x304C;&#x8ABF;&#x3079;&#x5EA7;&#x3067;5-hydroxymethylcytosine&#x306E;&#x975E;&#x5E38;&#x306B;&#x4F4E;&#x3044;&#x304B;&#x307E;&#x305F;&#x306F;&#x691C;&#x51FA;&#x4E0D;&#x53EF;&#x80FD;&#x306A;&#x91CF;&#x3092;&#x8868;&#x793A;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002; 5  - &#x30E1;&#x30C1;&#x30EB;&#x30B7;&#x30C8;&#x30B7;&#x30F3;&#x306E;&#x30EC;&#x30D9;&#x30EB;&#x304C;&#x6642;&#x9593;&#x306E;&#x7D4C;&#x904E;&#x3068;&#x3068;&#x3082;&#x306B;&#x5F90;&#x3005;&#x306B;&#x5897;&#x52A0;&#x3057;&#x305F;&#x4E00;&#x65B9;&#x3001;&#x8208;&#x5473;&#x6DF1;&#x3044;&#x3053;&#x3068;&#x306B;&#x3001;&#x30DE;&#x30A6;&#x30B9;&#x80DA;&#x6027;&#x5E79;&#x7D30;&#x80DE;&#x306E;DNA&#x306E;5 hydroxymethylcytosine&#x30EC;&#x30D9;&#x30EB;&#x306F;&#x3001;&#x6700;&#x521D;&#x306B;&#x80DA;&#x69D8;&#x4F53;&#x3078;&#x306E;&#x5206;&#x5316;&#x306B;&#x3086;&#x3063;&#x304F;&#x308A;&#x3068;&#x6E1B;&#x5C11;&#x3057;&#x3066;&#x5897;&#x52A0;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x6700;&#x5F8C;&#x306B;&#x3001;&#x5B9A;&#x91CF;&#x7684;PCR&#x30A2;&#x30D7;&#x30ED;&#x30FC;&#x30C1;&#x3092;&#x7528;&#x3044;&#x3066;&#x3001;&#x6211;&#x3005;&#x306F;&#x3001;&#x30D2;&#x30C8;&#x7D44;&#x7E54;&#x306E;DNA&#x30B5;&#x30F3;&#x30D7;&#x30EB;&#x4E2D;&#x306E;VANGL1&#x3068;EGFR&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x672C;&#x4F53;&#x306E;&#x30E1;&#x30C1;&#x30EB;&#x5316;&#x306E;&#x90E8;&#x5206;&#x306F;&#x78BA;&#x304B;&#x306B;&#x30D2;&#x30C9;&#x30ED;&#x30AD;&#x30B7;&#x30E1;&#x30C1;&#x30EB;&#x5316;&#x3067;&#x3042;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x78BA;&#x7ACB;&#x3057;&#x305F;&#x3002;

&#x54FA;&#x4E73;&#x52D5;&#x7269;&#x30B2;&#x30CE;&#x30E0;&#x306B;&#x304A;&#x3051;&#x308B;&#x7D44;&#x7E54;&#x7279;&#x7570;&#x7684;&#x5206;&#x5E03;&#x3068;5-hydroxymethylcytosine&#x306E;&#x52D5;&#x7684;&#x5909;&#x66F4;

&#xCC99;&#xCD94; &#xB3D9;&#xBB3C;&#xC758; &#xAC8C;&#xB188;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC2DC; &#xC794;&#xB958;&#xBB3C; enzymatically 5-methylcytosine, transcriptional &#xC5B5;&#xC555; &#xC720;&#xC804;&#xC790; &#xAC1C;&#xBC1C; &#xBC0F; &#xC9C8;&#xBCD1;&#xC758; &#xC9C4;&#xD589; &#xACFC;&#xC815;&#xC5D0; &#xCC38;&#xC5EC; &#xD558;&#xB3C4;&#xB85D; &#xC218;&#xC815; &#xB429;&#xB2C8;&#xB2E4;. 5 Methylcytosine &#xC218;&#xC815;&#xD560; &#xC218; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4; &#xB354; enzymatically 5 hydroxymethylcytosine methylcytosine dioxygenases TET &#xAC00;&#xC871;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574;. 5 Methylcytosine 5 hydroxymethylcytosine&#xC758; &#xBD84;&#xC11D;&#xC740; &#xD63C;&#xB3D9; &#xD588;&#xB2E4; &#xC774;&#xB7EC;&#xD55C; &#xC218;&#xC815; &#xD669;&#xC0B0; &#xBCC0;&#xD658;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xBCF4;&#xC644; &#xD558;&#xB294; &#xACBD;&#xC6B0;&#xC5D0; &#xAE30;&#xC874;&#xC758; &#xC2DC;&#xD000;&#xC2F1; &#xBC29;&#xBC95;&#xC73C;&#xB85C; &#xAD6C;&#xBCC4;&#xD560; &#xC218; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC5EC;&#xAE30; &#xC6B0;&#xB9AC;&#xAC00; &#xBCF5;&#xC81C; &#xAD00;&#xB828; &#xB41C; &#xAC04;&#xB2E8;&#xD55C; &#xD6A8;&#xC18C; &#xC811;&#xADFC; &#xC2E0;&#xBD84;&#xC99D;&#xACFC; murine &#xC778;&#xAC04; &#xAC8C;&#xB188; &#xB0B4;&#xC5D0;&#xC11C; &#xB2E4;&#xC591; &#xD55C; CCGG loci&#xC5D0; 5-hydroxymethylcytosine&#xC758; &#xC815;&#xB7C9;&#xD654;&#xB97C; &#xBCF4;&#xC5EC; &#xC90D;&#xB2C8;&#xB2E4;. 5 Hydroxymethylcytosine&#xC5D0; &#xC720;&#xD589; &#xD588;&#xB358; &#xC778;&#xAC04;&#xACFC; murine &#xB450;&#xB1CC;&#xC640; &#xC5EC;&#xB7EC; &#xC9C0;&#xC5ED;&#xC5D0;&#xC11C; &#xAC8C;&#xB188; DNAs &#xC2EC;&#xC7A5;. &#xAD50;&#xC591;&#xB41C; &#xC140; &#xB77C;&#xC778; NIH3T3 &#xBC0F; &#xD5EC;&#xB7EC; &#xAC80;&#xC0AC; loci &#xB9E4;&#xC6B0; &#xB0AE;&#xAC70;&#xB098; &#xBC1C;&#xACAC;&#xD560; &#xC218; &#xC5C6;&#xB294; &#xC591;&#xC758; 5 hydroxymethylcytosine &#xD45C;&#xC2DC; &#xB429;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xD765;&#xBBF8;&#xB86D;&#xAC8C;&#xB3C4;, 5 hydroxymethylcytosine &#xC218;&#xC900; &#xB9C8;&#xC6B0;&#xC2A4; &#xBC30;&#xC544; &#xC904;&#xAE30; &#xC138;&#xD3EC;&#xC5D0;&#xC11C; DNA &#xBA3C;&#xC800; &#xC99D;&#xAC00; &#xB2E4;&#xC74C; 5-methylcytosine &#xB808;&#xBCA8; &#xC2DC;&#xAC04;&#xC5D0; &#xB530;&#xB77C; &#xC810;&#xC9C4;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xC99D;&#xAC00; &#xD558;&#xB294; &#xBC18;&#xBA74; &#xCC28;&#xBCC4;&#xD654; embryoid &#xC2DC;&#xCCB4;&#xB97C; &#xB530;&#xB77C; &#xCC9C;&#xCC9C;&#xD788; &#xAC10;&#xC18C; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xB9C8;&#xC9C0;&#xB9C9;&#xC73C;&#xB85C;, &#xC6B0;&#xB9AC; &#xC778;&#xAC04;&#xC758; &#xC870;&#xC9C1; DNA &#xC0D8;&#xD50C;&#xC5D0;&#xC11C; vangl1&#xC640; EGFR &#xC720;&#xC804;&#xC790; &#xBAB8; &#xBA54; &#xD2F8;&#xC758; &#xC77C;&#xBD80;&#xB294; &#xC2E4;&#xC81C;&#xB85C; hydroxymethylation &#xC124;&#xB9BD; &#xC815;&#xB7C9;&#xC801; PCR &#xBC29;&#xBC95;&#xC744; &#xC0AC;&#xC6A9;.

&#xC870;&#xC9C1; &#xAD00;&#xB828; &#xC720;&#xD1B5; &#xBC0F; &#xD3EC;&#xC720;&#xB958; &#xAC8C;&#xB188;&#xC5D0; 5-hydroxymethylcytosine&#xC758; &#xC5ED;&#xB3D9;&#xC801;&#xC778; &#xBCC0;&#xD654;.

Residuos de citosina en el genoma de los vertebrados se modifica enzim&#xE1;ticamente a 5-metilcitosina, que participa en la represi&#xF3;n transcripcional de los genes durante la progresi&#xF3;n del desarrollo y la enfermedad. 5-metilcitosina puede ser a&#xFA;n m&#xE1;s enzim&#xE1;ticamente modificado para 5-hidroximetilcitosina por la familia de TET dioxigenasas methylcytosine. An&#xE1;lisis de la 5-metilcitosina y 5 hidroximetilcitosina-se confunde, ya que estas modificaciones no se pueden distinguir por m&#xE9;todos de secuenciaci&#xF3;n tradicionales, incluso cuando se complementa con la conversi&#xF3;n de bisulfito. Aqu&#xED; se demuestra un enfoque simple enzim&#xE1;tica relacionada con la clonaci&#xF3;n, la identificaci&#xF3;n y cuantificaci&#xF3;n de 5-hidroximetilcitosina en loci CCGG diferentes dentro de los genomas humano y murino. 5-hidroximetilcitosina era frecuente en el cerebro humano y murino y ADN gen&#xF3;mico del coraz&#xF3;n en varias regiones. El cultivo de c&#xE9;lulas HeLa y l&#xED;neas NIH3T3 tanto muestran cantidades muy bajas o indetectables de 5-hidroximetilcitosina en los loci estudiados. Curiosamente, los niveles de 5-hidroximetilcitosina en embriones de rat&#xF3;n de ADN de c&#xE9;lulas madre se increment&#xF3;, primero lentamente disminuci&#xF3;n de la diferenciaci&#xF3;n de cuerpos embrionarios, mientras que los niveles de 5-methylcytosine aument&#xF3; gradualmente con el tiempo. Finalmente, utilizando un enfoque cuantitativo de PCR, se estableci&#xF3; que una porci&#xF3;n de VANGL1 y gen EGFR metilaci&#xF3;n cuerpo en muestras de tejidos humanos de ADN es, en efecto hidroximetilaci&#xF3;n.

Romualdas Vaisvila

Applications and Product Development

New England BioLabs

High Sensitivity 5-hydroxymethylcytosine Detection in Balb/C Brain Tissue

Romualdas Vaisvila

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New England BioLabs

High Sensitivity 5-hydroxymethylcytosine Detection in Balb/C Brain Tissue

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