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Selective Labelling of Cell-surface Proteins using CyDye DIGE Fluor Minimal Dyes

Surface  proteins are central to the cell's ability to react to its environment and to interact with neighboring cells. They are known to be inducers of ...

GE Healthcare Bio-Sciences AB

&#x7CD6;&#x80FA;&#x805A;&#x7CD6;&#x3001; &#x786B;&#x9178;&#x4E59;&#x9170;&#x809D;&#x7D20; (HS) &#x7ED1;&#x5B9A;&#x86CB;&#x767D;&#x8C03;&#x8282;&#x4FE1;&#x53F7;&#x4E8B;&#x4EF6;&#x7684;&#x80DA;&#x80CE;&#x3002;&#x6240;&#x6709;&#x5DF2;&#x786E;&#x5B9A;&#x7684;&#x86CB;&#x767D;&#x7ED3;&#x5408; HS &#x6297;&#x539F;&#x51B3;&#x5B9A;&#x7C07;&#x5305;&#x542B; l iduronic &#x9178; (IdoA)&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x7684;&#x62A5;&#x544A;&#x6709;&#x9488;&#x5BF9;&#x6027;&#x5730;&#x7684;&#x4E2D;&#x65AD;&#x5C0F;&#x9F20; d-&#x8461;&#x8404;&#x7CD6;&#x919B;&#x9170;&#x57FA; C5-&#x5DEE;&#x5411;&#x5F02;&#x6784;&#x9176;&#x57FA;&#x56E0;&#x7684;&#x7ED3;&#x679C;&#x7F3A;&#x4E4F; IdoA &#x7ED3;&#x6784;&#x7684;&#x6539;&#x53D8; HS &#x4E2D;&#x3002;&#x76F8;&#x5E94;&#x7684;&#x8868;&#x578B;&#x662F;&#x81F4;&#x547D;&#x7684;&#x4E0E;&#x80BE;&#x53D1;&#x80B2;&#x4E0D;&#x5168;&#x3001; &#x80BA;&#x7F3A;&#x9677;&#x548C;&#x9AA8;&#x9ABC;&#x7578;&#x5F62;&#x3002;&#x610F;&#x5916;&#x7684;&#x662F;&#xFF0C;&#x4E3B;&#x8981;&#x5668;&#x5B98;&#x7CFB;&#x7EDF;&#xFF0C;&#x5305;&#x62EC;&#x8111;&#x3001; &#x809D;&#x3001; &#x6D88;&#x5316;&#x9053;&#x3001; &#x76AE;&#x80A4;&#x548C;&#x5FC3;&#xFF0C;&#x8868;&#x9762;&#x4F3C;&#x4E4E;&#x6B63;&#x5E38;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x53D1;&#x73B0;&#x5C3D;&#x7BA1;&#x6709;&#x4E0D;&#x540C;&#x7684;&#x8981;&#x6C42;&#xFF0C;&#x4E3A; 2-O-&#x786B;&#x9178;&#x916F;&#x5316;&#xFF0C;IdoA &#x5355;&#x4F4D;&#x662F;&#x6B63;&#x5E38;&#x80BE;&#x3001; &#x80BA;&#x3001; &#x9AA8;&#x9ABC;&#x53D1;&#x80B2;&#x7684;&#x5FC5;&#x8981;&#x6761;&#x4EF6;&#x3002;&#x76F8;&#x6BD4;&#x4E4B;&#x4E0B;&#xFF0C;&#x5DF2;&#x77E5;&#x663E;&#x7136;&#x4F24;&#x52BF;&#x4E25;&#x91CD;&#x4F9D;&#x8D56;&#x4E8E;&#x786B;&#x9178;&#x4E59;&#x9170;&#x809D;&#x7D20;&#x65E9;&#x671F;&#x53D1;&#x5C55;&#x5927;&#x4E8B;&#x5C06;&#x6B63;&#x5E38;&#x7EE7;&#x7EED;&#x751A;&#x81F3;&#x5728;&#x6CA1;&#x6709; IdoA&#x3002;

&#x6709;&#x9488;&#x5BF9;&#x6027;&#x5730;&#x7684;&#x4E2D;&#x65AD;&#x5C0F;&#x9F20;&#x8461;&#x8404;&#x7CD6;&#x919B;&#x9170;&#x57FA; C5-&#x5DEE;&#x5411;&#x5F02;&#x6784;&#x9176;&#x57FA;&#x56E0;&#x7684;&#x7ED3;&#x679C;&#x5728;&#x7F3A;&#x4E4F; L iduronic &#x9178;&#x786B;&#x9178;&#x4E59;&#x9170;&#x809D;&#x7D20;&#x548C;&#x65B0;&#x751F;&#x513F;&#x7684;&#x6740;&#x4F24;&#x529B;&#x3002;

The glycosaminoglycan, heparan sulfate (HS), binds proteins to modulate signaling events in embryogenesis. All identified protein-binding HS epitopes contain l-iduronic acid (IdoA). We report that targeted disruption of the murine d-glucuronyl C5-epimerase gene results in a structurally altered HS lacking IdoA. The corresponding phenotype is lethal, with renal agenesis, lung defects, and skeletal malformations. Unexpectedly, major organ systems, including the brain, liver, gastrointestinal tract, skin, and heart, appeared normal. We find that IdoA units are essential for normal kidney, lung, and skeletal development, albeit with different requirement for 2-O-sulfation. By contrast, major early developmental events known to critically depend on heparan sulfate apparently proceed normally even in the absence of IdoA.

Targeted disruption of a murine glucuronyl C5-epimerase gene results in heparan sulfate lacking L-iduronic acid and in neonatal lethality.

Les glycosaminoglycanes, h&eacute;parane sulfate (HS), lie prot&eacute;ines pour moduler la signalisation d&#39;&eacute;v&eacute;nements dans l&#39;embryogen&egrave;se. Tous les &eacute;pitopes de HS-la liaison aux prot&eacute;ines identifi&eacute;es contiennent de l&#39;acide l-iduronic (IdoA). Les auteurs rapportent qu&#39;une interruption cibl&eacute;e du g&egrave;ne murin d-glucuronyl C5-&eacute;pim&eacute;rase entra&icirc;ne un HS structurellement modifi&eacute; manque IdoA. Le ph&eacute;notype correspondant est l&eacute;tal, ag&eacute;n&eacute;sie r&eacute;nale, anomalies pulmonaires et des malformations squelettiques. Contre toute attente, syst&egrave;mes d&#39;organes principaux, y compris le cerveau, foie, tube digestif, peau et coeur, semblait normales. Nous constatons que les unit&eacute;s IdoA sont essentielles pour le d&eacute;veloppement du squelette, le poumon et le rein normal mais avec diff&eacute;rentes exigences pour 2-O-sulfatation. En revanche, les grandes manifestations du d&eacute;veloppement pr&eacute;coces cens&eacute;es d&eacute;pendre critique l&#39;h&eacute;parane sulfate apparemment proc&eacute;der normalement m&ecirc;me en l&#39;absence de IdoA.

Interruption cibl&eacute;e d&#39;un g&egrave;ne murin glucuronyl C5-&eacute;pim&eacute;rase traduit l&#39;h&eacute;parane sulfate, d&eacute;pourvus de l&#39;acide L-iduronic et l&eacute;talit&eacute; n&eacute;onatale.

Disruption eines murinen Glucuronyl C5-Epimerase-Gens f&#xFC;hrt zu Heparansulfat fehlt L-Idurons&#xE4;ure und neonatalen Letalit&#xE4;t.

Glicosaminoglicano, eparan solfato (HS), lega le proteine per modulare la segnalazione eventi in embriogenesi. Tutte identificati proteine-associazione HS epitopi contengono acido l-iduronico (IdoA). Segnaliamo che perturbazioni mirate del gene murino d-glucoronil C5-epimarasi si traduce in un HS strutturalmente alterati privi IdoA. Il fenotipo corrispondente &egrave; letale, con agenesia renale, polmone difetti e malformazioni scheletriche. Inaspettatamente, sistemi di organi importanti, compreso il cervello, fegato, tratto gastrointestinale, pelle e cuore, apparvero normali. Troviamo che sono essenziali per lo sviluppo scheletrico, Rene normale e polmone IdoA unit&agrave; seppur con differenti requisiti per 2-O-solfatazione. Al contrario, grandi eventi dello sviluppo precoce conosciuti criticamente dipendere eparan solfato apparentemente procedono normalmente anche in assenza di IdoA.

Distruzione mirata di un gene murino glucoronil C5-epimarasi risultati in eparan solfato privo di acido L-iduronico e mortalit&agrave; neonatale.

&#x30B0;&#x30EA;&#x30B3;&#x30B5;&#x30DF;&#x30CE;&#x30B0;&#x30EA;&#x30AB;&#x30F3; &#x30D8;&#x30D1;&#x30E9;&#x30F3;&#x786B;&#x9178; (HS) &#x306F;&#x80DA;&#x767A;&#x751F;&#x306B;&#x304A;&#x3051;&#x308B;&#x30B7;&#x30B0;&#x30CA;&#x30EB;&#x4F1D;&#x9054;&#x4E8B;&#x8C61;&#x3092;&#x8ABF;&#x7BC0;&#x3059;&#x308B;&#x86CB;&#x767D;&#x8CEA;&#x3092;&#x30D0;&#x30A4;&#x30F3;&#x30C9;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3059;&#x3079;&#x3066;&#x306E;&#x8B58;&#x5225;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x86CB;&#x767D;&#x8CEA;&#x306E;&#x7D50;&#x5408;&#x306E; HS &#x306E;&#x30A8;&#x30D4;&#x30C8;&#x30FC;&#x30D7;&#x306B;&#x306F; l &#x30A4;&#x30BA;&#x30ED;&#x30F3;&#x9178; (IdoA) &#x304C;&#x542B;&#x307E;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x30DE;&#x30A6;&#x30B9; d &#x30B0;&#x30EB;&#x30AF;&#x30ED;&#x30CB;&#x30EB;&#x30D2;&#x30C9;&#x30ED;&#x30E9;&#x30FC;&#x30BC; C5-&#x30A8;&#x30D4;&#x30E1;&#x30E9;&#x30FC;&#x30BC;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x306E;&#x30BF;&#x30FC;&#x30B2;&#x30C3;&#x30C8;&#x3092;&#x7D5E;&#x3063;&#x305F;&#x4E2D;&#x65AD; IdoA &#x6B20;&#x3051;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x69CB;&#x9020;&#x7684;&#x306B;&#x5909;&#x3048;&#x3089;&#x308C;&#x305F; HS &#x3067;&#x7D50;&#x679C;&#x3092;&#x5831;&#x544A;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x5BFE;&#x5FDC;&#x3059;&#x308B;&#x8868;&#x73FE;&#x578B;&#x306F;&#x814E;&#x7121;&#x5F62;&#x6210;&#x3001;&#x80BA;&#x6B20;&#x9665;&#x3001;&#x9AA8;&#x683C;&#x5947;&#x5F62;&#x306B;&#x81F4;&#x547D;&#x7684;&#x3067;&#x3042;&#x308A;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x7A81;&#x7136;&#x3001;&#x8133;&#x3001;&#x809D;&#x81D3;&#x3001;&#x6D88;&#x5316;&#x7BA1;&#x3001;&#x76AE;&#x819A;&#x3084;&#x5FC3;&#x81D3;&#x3092;&#x542B;&#x3080;&#x4E3B;&#x8981;&#x81D3;&#x5668;&#x30B7;&#x30B9;&#x30C6;&#x30E0;&#x306F;&#x901A;&#x5E38;&#x767B;&#x5834;&#x3002;IdoA &#x30E6;&#x30CB;&#x30C3;&#x30C8;&#x306F; 2 O &#x3042;&#x305F;&#x3089;&#x3057;&#x306E;&#x7570;&#x306A;&#x308B;&#x8981;&#x4EF6;&#x3092;&#x3044;&#x3048;&#x306B;&#x6B63;&#x5E38;&#x306A;&#x814E;&#x81D3;&#x3001;&#x80BA;&#x304A;&#x3088;&#x3073;&#x9AA8;&#x683C;&#x958B;&#x767A;&#x306B;&#x4E0D;&#x53EF;&#x6B20;&#x3067;&#x3042;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x898B;&#x3064;&#x3051;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x5BFE;&#x7167;&#x7684;&#x306B;&#x3001;&#x6279;&#x5224;&#x7684;&#x306B;&#x3069;&#x3046;&#x3084;&#x3089;&#x30D8;&#x30D1;&#x30E9;&#x30F3;&#x786B;&#x9178;&#x3092;&#x4F9D;&#x5B58;&#x3059;&#x308B;&#x77E5;&#x3089;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x4E3B;&#x8981;&#x306A;&#x521D;&#x671F;&#x767A;&#x9054;&#x3059;&#x308B;&#x30A4;&#x30D9;&#x30F3;&#x30C8;&#x306F;&#x3001;&#x901A;&#x5E38; IdoA &#x306E;&#x4E0D;&#x5728;&#x3067;&#x3082;&#x9032;&#x307F;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

&#x30DE;&#x30A6;&#x30B9; &#x30B0;&#x30EB;&#x30AF;&#x30ED;&#x30CB;&#x30EB;&#x30D2;&#x30C9;&#x30ED;&#x30E9;&#x30FC;&#x30BC; C5-&#x30A8;&#x30D4;&#x30E1;&#x30E9;&#x30FC;&#x30BC;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x306E;&#x30BF;&#x30FC;&#x30B2;&#x30C3;&#x30C8;&#x3092;&#x7D5E;&#x3063;&#x305F;&#x4E2D;&#x65AD; L &#x30A4;&#x30BA;&#x30ED;&#x30F3;&#x9178;&#x6B20;&#x3051;&#x3066;&#x30D8;&#x30D1;&#x30E9;&#x30F3;&#x786B;&#x9178;&#x3068;&#x65B0;&#x751F;&#x5150;&#x81F4;&#x6B7B;&#x7D50;&#x679C;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

Glycosaminoglycan, heparan &#xD669;&#xC0B0; (HS), embryogenesis &#xC2E0;&#xD638; &#xC774;&#xBCA4;&#xD2B8;&#xB97C; &#xC870;&#xC808; &#xD558;&#xB294; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC5D0; &#xBC14;&#xC778;&#xB529;&#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xBAA8;&#xB4E0; &#xD655;&#xC778; &#xB41C; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xBC14;&#xC778;&#xB529; HS epitopes l iduronic &#xC0B0; (IdoA) &#xD3EC;&#xD568;. &#xC6B0;&#xB9AC; &#xB300;&#xC0C1;&#xB41C; &#xC911;&#xB2E8; murine d-glucuronyl C5 epimerase &#xC720;&#xC804;&#xC790;&#xC758; &#xAD6C;&#xC870;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xBCC0;&#xACBD; &#xB41C; HS IdoA &#xBD80;&#xC871;&#xC5D0; &#xACB0;&#xACFC; &#xBCF4;&#xACE0;. &#xD574;&#xB2F9; &#xD615; &#xC2E0;&#xC7A5; agenesis &#xD3D0; &#xACB0;&#xD568;&#xACFC; &#xACE8;&#xACA9; &#xAE30;&#xD615;&#xC73C;&#xB85C; &#xCE58;&#xBA85;&#xC801;&#xC778;&#xC785;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC608;&#xAE30;&#xCE58; &#xC54A;&#xAC8C;, &#xB1CC;, &#xAC04;, &#xC704; &#xC7A5;&#xAD00;, &#xD53C;&#xBD80;, &#xADF8;&#xB9AC;&#xACE0; &#xC2EC;&#xC7A5;&#xB97C; &#xD3EC;&#xD568; &#xD558; &#xC5EC; &#xC8FC;&#xC694; &#xAE30;&#xAD00; &#xC2DC;&#xC2A4;&#xD15C; &#xC815;&#xC0C1; &#xB4F1;&#xC7A5;. &#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294; IdoA &#xB2E8;&#xC704;&#xB294; 2 O sulfation&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC11C;&#xB85C; &#xB2E4;&#xB978; &#xC694;&#xAD6C;&#xC640; &#xC774;&#xAE30;&#xB294; &#xD558;&#xC9C0;&#xB9CC; &#xC815;&#xC0C1; &#xC2E0;&#xC7A5;, &#xD3D0;, &#xADF8;&#xB9AC;&#xACE0; &#xACE8;&#xACA9; &#xAC1C;&#xBC1C;&#xC5D0; &#xD544;&#xC218;&#xC801;&#xC778; &#xCC3E;&#xC73C;&#xC2ED;&#xC2DC;&#xC624;. &#xB300;&#xC870;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C;, &#xBD84;&#xBA85;&#xD788; heparan &#xD669;&#xC0B0; &#xC5FC;&#xC5D0; &#xB530;&#xB77C; &#xBE44;&#xD310;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xC54C;&#xB824;&#xC9C4; &#xC8FC;&#xC694; &#xCD08;&#xAE30; &#xBC1C;&#xB2EC; &#xC774;&#xBCA4;&#xD2B8; Idoa&#xC758; &#xBD80;&#xC7AC;&#xC5D0;&#xB3C4; &#xC815;&#xC0C1;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xC9C4;&#xD589; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;.

Murine glucuronyl C5 epimerase &#xC720;&#xC804;&#xC790;&#xC758; &#xD0C0;&#xAC9F;&#xB41C; &#xC911;&#xB2E8; &#xACB0;&#xACFC; heparan &#xD669;&#xC0B0; L-iduronic &#xC0B0; &#xBD80;&#xC871; &#xBC0F; &#xC2E0;&#xC0DD;&#xC544; &#xCE58; &#xC0AC; &#xC728;.

Los glicosaminoglicanos, hepar&aacute;n sulfato (HS), une a prote&iacute;nas para modular la se&ntilde;alizaci&oacute;n de eventos en la embriog&eacute;nesis. Todos identificados epitopos de HS-Uni&oacute;n a prote&iacute;nas contienen &aacute;cido l-idur&oacute;nico (IdoA). Divulgamos que interrupci&oacute;n espec&iacute;fica del gen murino d-glucuronil C5-Epimerasa da lugar a un cap&iacute;tulo estructuralmente alterado falta IdoA. El fenotipo correspondiente es letal, con agenesia renal, defectos del pulm&oacute;n y malformaciones esquel&eacute;ticas. Inesperadamente, los sistemas de &oacute;rganos principales, incluyendo el cerebro, tracto gastrointestinal, piel, h&iacute;gado y coraz&oacute;n, aparec&iacute;an normales. Encontramos que IdoA unidades son esenciales para el normal del ri&ntilde;&oacute;n, pulm&oacute;n y desarrollo esquel&eacute;tico, aunque con diverso requisito de 2-O-sulfataci&oacute;n. Por el contrario, grandes acontecimientos del desarrollo tempranos sabidos que dependen cr&iacute;ticamente de hepar&aacute;n sulfato al parecer proceden normalmente incluso en la ausencia de IdoA.

Interrupci&oacute;n espec&iacute;fica de un gen murino glucuronil C5-Epimerasa resulta en hepar&aacute;n sulfato carecer de &aacute;cido L-idur&oacute;nico y en la mortalidad neonatal.

&#x8461;&#x8404;&#x7CD6;&#x919B;&#x9170;&#x57FA; C5-&#x5DEE;&#x5411;&#x5F02;&#x6784;&#x9176;&#x50AC;&#x5316; d-&#x8461;&#x8404;&#x7CD6;&#x919B;&#x9178;&#x8F6C;&#x4E3A;&#x4E59;&#x9170;&#x809D;&#x7D20;&#x786B;&#x9178;&#x751F;&#x7269;&#x5408;&#x6210; l-iduronic &#x9178;&#x5355;&#x4F4D;&#x3002;&#x5E95;&#x7269;&#x8BC6;&#x522B;&#x53D6;&#x51B3;&#x4E8E;&#x4E59;&#x9170;&#x809D;&#x7D20;&#x786B;&#x9178;&#x524D;&#x4F53;&#x591A;&#x7CD6;&#x7684; N-&#x53D6;&#x4EE3;&#x57FA;&#x6A21;&#x5F0F;&#x548C;&#x8981;&#x6C42;&#x5E74;&#x5E95;&#x51CF;&#x5C11;&#x975E;&#x8981; N &#x786B;&#x9178;&#x90BB;&#x6C28;&#x57FA;&#x8461;&#x8404;&#x7CD6;&#x76D0;&#x9178;&#x76D0;&#x6B8B;&#x7559;&#x3002;&#x5DEE;&#x5411;&#x5F02;&#x6784;&#x5316;&#x7684;&#x9002;&#x5F53; N &#x786B;&#x9178;&#x886C;&#x5E95;&#x662F;&#x81EA;&#x7531;&#x53EF;&#x9006;&#x4E2D;&#x53EF;&#x6EB6;&#x6027;&#x7684;&#x7CFB;&#x7EDF;&#xFF0C;&#x4E0E;&#x5E73;&#x8861;&#x503E;&#x5411;&#x4E8E;&#x4FDD;&#x7559; d &#x808C;&#x8089;&#x914D;&#x7F6E; (&#x676D;&#x7EB3;-&#x661F;&#x8C61;&#xFF0C;A.&#x3001; &#x6797;&#x9053;&#xFF0C;&#x7F8E;&#x56FD;&#x548C;&#x674E;&#xFF0C;J.P.&#x8D1D;&#x514B; &#xFF08;2000 &#x5E74;&#xFF09;&#x3002;J.347&#xFF0C;69-75)&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x7814;&#x7A76;&#x7684;&#x5DEE;&#x5411;&#x5F02;&#x6784;&#x9176;&#x53CD;&#x5E94;&#x7684;&#x53EF;&#x9006;&#x6027;&#x5728;&#x8702;&#x7A9D;&#x7CFB;&#x7EDF;&#x4E2D;&#xFF0C;&#x5B75;&#x5316;&#x4EBA;&#x80DA;&#x80BE; 293 &#x7EC6;&#x80DE;&#x4E0E; d-&#x534A;&#x4E73;&#x7CD6; [5-H (3)]&#x3002;&#x6807;&#x7B7E;&#x4E59;&#x9170;&#x809D;&#x7D20;&#x786B;&#x9178;&#x524D;&#x4F53;&#x591A;&#x7CD6;&#x4E0E;&#x8461;&#x8404;&#x7CD6;&#x919B;&#x9178;&#x5355;&#x4F4D;&#x7EB3;&#x5165;&#xFF0C;&#x5E76;&#x4E22;&#x5931;&#x540E;&#x968F;&#x540E; C5-&#x5DEE;&#x5411;&#x5F02;&#x6784;&#x5316; iduronic &#x9178;&#x4E86;&#x3002;&#x4E0D;&#x8FC7;&#xFF0C;&#x83B7;&#x5F97;&#x7684; deaminative &#x5288;&#x88C2;&#x7684;&#x6210;&#x719F;&#x4E59;&#x9170;&#x809D;&#x7D20;&#x786B;&#x9178;&#x94FE;&#x7684;&#x4F4E;&#x805A;&#x7CD6;&#x5206;&#x6790;&#x8868;&#x660E;&#x6240;&#x6709;&#x8461;&#x8404;&#x7CD6;&#x919B;&#x9178;&#x5355;&#x4F4D;&#x4FDD;&#x7559;&#x5176; C5-H (3) &#x6807;&#x7B7E;&#xFF0C;&#x65E0;&#x8BBA;&#x662F;&#x5426;&#x53D1;&#x751F;&#x6613;&#x6216;&#x6297;&#x6027;&#x5DEE;&#x5411;&#x5F02;&#x6784;&#x9176;&#x7684;&#x5E8F;&#x5217;&#x3002;(3) &#x6240;&#x6709; H &#x6807;&#x7B7E;&#x7684;&#x6700;&#x7EC8;&#x4EA7;&#x54C1;&#x5728;&#x53EF;&#x6EB6;&#x6027;&#x7CFB;&#x7EDF;&#x4E2D;&#xFF0C;&#x663E;&#x7136;&#x662F;&#x56E0;&#x4E3A;&#x963B;&#x6B62;&#x6FB3;&#x786B;&#x9178;&#x7FA4;&#x4F53;&#x90FD;&#x62B5;&#x5236;&#x5DEE;&#x5411;&#x5F02;&#x6784;&#x9176;&#x4E0E;&#x5B75;&#x5316;&#x3002;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x7ED3;&#x679C;&#x8868;&#x660E;&#x8461;&#x8404;&#x7CD6;&#x919B;&#x9178; C5-&#x5DEE;&#x5411;&#x5F02;&#x6784;&#x5316;&#x662F;&#x6709;&#x6548;&#x5730;&#x4E0D;&#x53EF;&#x9006;&#x8F6C;&#x7684;&#x4F53;&#x5185;&#x7684;&#x751F;&#x7269;&#x5408;&#x6210;&#x673A;&#x5236;&#x4E25;&#x683C;&#x7EC4;&#x7EC7;&#x8FA9;&#x79F0;&#x3002;

&#x8461;&#x8404;&#x7CD6;&#x919B;&#x9170;&#x4E0D;&#x53EF;&#x9006;&#x8F6C;&#x57FA; C5-&#x5DEE;&#x5411;&#x5F02;&#x6784;&#x5316;&#x786B;&#x9178;&#x4E59;&#x9170;&#x809D;&#x7D20;&#x7684;&#x751F;&#x7269;&#x5408;&#x6210;&#x3002;

Glucuronyl C5-epimerase catalyzes the conversion of d-glucuronic acid to l-iduronic acid units in heparan sulfate biosynthesis. Substrate recognition depends on the N-substituent pattern of the heparan sulfate precursor polysaccharide and requires the adjacent glucosamine residue toward the non-reducing end to be N-sulfated. Epimerization of an appropriately N-sulfated substrate is freely reversible in a soluble system, with equilibrium favoring retention of d-gluco configuration (Hagner-McWhirter, A., Lindahl, U., and Li, J.-P. (2000) Biochem. J. 347, 69-75). We studied the reversibility of the epimerase reaction in a cellular system, by incubating human embryonic kidney 293 cells with d-[5-(3)H]galactose. The label was incorporated with glucuronic acid units into the heparan sulfate precursor polysaccharide and was lost upon subsequent C5-epimerization to iduronic acid. However, analysis of oligosaccharides obtained by deaminative cleavage of the mature heparan sulfate chains indicated that all glucuronic acid units retained their C5-(3)H label, irrespective of whether they had occurred in sequences susceptible or resistant to the epimerase. All (3)H-labels of the final products resisted incubation with epimerase in a soluble system, apparently due to blocking O-sulfate groups. These results indicate that glucuronic acid C5-epimerization is effectively irreversible in vivo and argue for a stringent organization of the biosynthetic machinery.

Irreversible glucuronyl C5-epimerization in the biosynthesis of heparan sulfate.

Glucuronyl C5-&eacute;pim&eacute;rase catalyse la conversion de l&#39;acide d-glucuronique aux unit&eacute;s d&#39;acide l-iduronic dans la biosynth&egrave;se de sulfate d&#39;h&eacute;parane. Reconnaissance du substrat d&eacute;pend du calendrier N-substituant du polysaccharide h&eacute;parane sulfate pr&eacute;curseur et exige le r&eacute;sidu glucosamine adjacentes vers l&#39;extr&eacute;mit&eacute; non r&eacute;ductrice pour &ecirc;tre N-sulfat&eacute;e. &Eacute;pim&eacute;risation d&#39;un substrat ad&eacute;quatement sulfat&eacute;e N est librement r&eacute;versible dans un syst&egrave;me soluble, d&#39;&eacute;quilibre favorisant la r&eacute;tention de configuration d-gluco (Hagner-Molina, A., Lefebvre, U. et Li, j.-P. Biochem (2000). J. 347, 69-75). Nous avons &eacute;tudi&eacute; la r&eacute;versibilit&eacute; de la r&eacute;action de l&#39;&eacute;pim&eacute;rase dans un syst&egrave;me cellulaire, en incubant les cellules r&eacute;nales embryonnaires humaines 293 avec d-[5-(3) H] galactose. L&#39;&eacute;tiquette a &eacute;t&eacute; incorpor&eacute; le polysaccharide de pr&eacute;curseur h&eacute;parane sulfate avec unit&eacute;s d&#39;acide glucuronique et disparaissait apr&egrave;s &eacute;pim&eacute;risation C5 subs&eacute;quente &agrave; l&#39;acide iduronique. Toutefois, l&#39;analyse des oligosaccharides obtenus par clivage d&eacute;aminative des cha&icirc;nes matures h&eacute;parane sulfate a indiqu&eacute; que toutes les unit&eacute;s acide glucuronique conserv&eacute; leur C5 - &eacute;tiquette (3) H, ind&eacute;pendamment de savoir si elles avaient eu lieu dans les s&eacute;quences sensibles ou r&eacute;sistantes &agrave; l&#39;&eacute;pim&eacute;rase. Toutes les &eacute;tiquettes de H (3) des produits finaux ont r&eacute;sist&eacute; &agrave; l&#39;incubation avec &eacute;pim&eacute;rase dans un syst&egrave;me soluble, apparemment &agrave; cause de blocage des groupes O-sulfate. Ces r&eacute;sultats indiquent que l&#39;acide glucuronique &eacute;pim&eacute;risation C5 est effectivement irr&eacute;versible in vivo et plaident pour une organisation rigoureuse de la machinerie biosynth&eacute;tique.

Irr&eacute;versible glucuronyl &eacute;pim&eacute;risation C5 dans la biosynth&egrave;se de l&#39;h&eacute;parane sulfate.

Irreversible Glucuronyl C5-Epimerisierung bei der Biosynthese von Heparansulfat.

Glucoronil C5-epimarasi catalizza la conversione dell&#39;acido d-glucuronico alle unit&agrave; di acido l-iduronico nella biosintesi di eparan solfato. Riconoscimento del substrato dipende il modello N-sostituente il polisaccaride precursore di eparan solfato e richiede il residuo di glucosamina adiacenti verso l&#39;estremit&agrave; non riducenti ad essere N-solfato. Epimerization di un substrato opportunamente N-solfato &egrave; liberamente reversibile in un sistema solubile, con equilibrio, favorendo la ritenzione di configurazione d-gluco (Hagner-McWhirter, A., Lindahl, U. e Li, J.-P. Biochem (2000). J. 347, 69-75). Abbiamo studiato la reversibilit&agrave; della reazione epimarasi in un sistema cellulare, incubando le cellule renali embrionali umane 293 con [5-(3) H] d-galattosio. L&#39;etichetta fu incorporata con unit&agrave; di acido glucuronico il polisaccaride precursore di eparan solfato e perse su successive C5-epimerization acido iduronico. Tuttavia, analisi degli oligosaccaridi ottenuti dalla fenditura deaminative delle catene mature eparan solfato indicano che tutte le unit&agrave; di acido glucuronico mantenuto loro C5 - etichetta (3) H, indipendentemente dal fatto se si fosse avvenuta in sequenze sensibili o resistenti all&#39;epimarasi. Tutte le etichette di H (3) dei prodotti finali hanno resistito incubazione con epimarasi in un sistema solubile, apparentemente a causa di gruppi solfato O di blocco. Questi risultati indicano che l&#39;acido glucuronico C5-epimerization &egrave; efficacemente irreversibile in vivo e sostengono per un&#39;organizzazione rigorosa del macchinario biosintetico.

Irreversibile glucoronil C5-epimerization nella biosintesi di eparan solfato.

&#x30B0;&#x30EB;&#x30AF;&#x30ED;&#x30CB;&#x30EB;&#x30D2;&#x30C9;&#x30ED;&#x30E9;&#x30FC;&#x30BC; C5-&#x30A8;&#x30D4;&#x30E1;&#x30E9;&#x30FC;&#x30BC; &#x30B0;&#x30EB;&#x30AF;&#x30ED;&#x30F3;&#x9178;&#x306E;&#x5909;&#x63DB; l &#x30A4;&#x30BA;&#x30ED;&#x30F3;&#x9178;&#x30E6;&#x30CB;&#x30C3;&#x30C8;&#x306B;&#x304A;&#x3051;&#x308B;&#x30D8;&#x30D1;&#x30E9;&#x30F3;&#x786B;&#x9178;&#x306E;&#x751F;&#x5408;&#x6210;&#x3092;&#x89E6;&#x5A92;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x57FA;&#x8CEA;&#x8A8D;&#x8B58;&#x30D8;&#x30D1;&#x30E9;&#x30F3;&#x786B;&#x9178;&#x5869;&#x524D;&#x99C6;&#x4F53;&#x591A;&#x7CD6;&#x985E;&#x306E; N &#x7F6E;&#x63DB;&#x30D1;&#x30BF;&#x30FC;&#x30F3;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x7570;&#x306A;&#x308A;&#x307E;&#x3059;&#x3001;N &#x786B;&#x9178;&#x5316;&#x3059;&#x308B;&#x306B;&#x306F;&#x3001;&#x975E;&#x9084;&#x5143;&#x672B;&#x7AEF;&#x306B;&#x5411;&#x304B;&#x3063;&#x3066;&#x96A3;&#x63A5;&#x3059;&#x308B;&#x30B0;&#x30EB;&#x30B3;&#x30B5;&#x30DF;&#x30F3;&#x6B8B;&#x6E23;&#x304C;&#x5FC5;&#x8981;&#x3067;&#x3059;&#x3002;&#x9069;&#x5207;&#x306B; N &#x786B;&#x9178;&#x5316;&#x57FA;&#x677F;&#x306E;&#x30A8;&#x30D4;&#x30DE;&#x30FC;&#x5316;&#x3067;&#x3059; d &#x30D6;&#x30C9;&#x30A6;&#x7CD6;&#x69CB;&#x6210;&#x306E;&#x4FDD;&#x6301;&#x3092;&#x512A;&#x9047;&#x5E73;&#x8861;&#x3068;&#x53EF;&#x6EB6;&#x6027;&#x30B7;&#x30B9;&#x30C6;&#x30E0;&#x3067;&#x306F;&#x3001;&#x81EA;&#x7531;&#x306B;&#x53EF;&#x9006; &#xFF08;&#x30FB; &#x30CF;&#x30B0;&#x30CA;&#x30FC; McWhirter A.&#x3001;&#x30EA;&#x30F3;&#x30C0;&#x30FC;&#x30EB;&#x3001;&#x7C73;&#x56FD;&#x3001;&#x304A;&#x3088;&#x3073; Li&#x3001;j. p.(2000) Biochem.J. 347, 69-75)&#x3002;&#x6211;&#x3005; &#x30BB;&#x30EB;&#x30E9;&#x30FC; &#x30B7;&#x30B9;&#x30C6;&#x30E0;&#x3067;&#x306F;&#x3001;d-[5-(3) H] &#x30AC;&#x30E9;&#x30AF;&#x30C8;&#x30FC;&#x30B9;&#x3068;&#x30D2;&#x30C8;&#x80DA;&#x6027;&#x814E;&#x81D3; 293 &#x7D30;&#x80DE;&#x3092;&#x30A4;&#x30F3;&#x30AD;&#x30E5;&#x30D9;&#x30FC;&#x30C8; &#x30A8;&#x30D4;&#x30E1;&#x30E9;&#x30FC;&#x30BC;&#x53CD;&#x5FDC;&#x306E;&#x53EF;&#x9006;&#x6027;&#x3092;&#x691C;&#x8A0E;&#x3057;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x30E9;&#x30D9;&#x30EB;&#x306F;&#x30B0;&#x30EB;&#x30AF;&#x30ED;&#x30F3;&#x9178;&#x30E6;&#x30CB;&#x30C3;&#x30C8;&#x3068;&#x30D8;&#x30D1;&#x30E9;&#x30F3;&#x786B;&#x9178;&#x306E;&#x524D;&#x99C6;&#x4F53;&#x591A;&#x7CD6;&#x985E;&#x306B;&#x7D44;&#x307F;&#x8FBC;&#x307E;&#x308C;&#x305F;&#x3001;&#x5F8C;&#x7D9A;&#x306E; C5 &#x30A8;&#x30D4;&#x30DE;&#x30FC;&#x5316;&#x8981;&#x30A4;&#x30BA;&#x30ED;&#x30F3;&#x9178;&#x306B;&#x5931;&#x308F;&#x308C;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x3057;&#x304B;&#x3057;&#x3001;&#x6210;&#x719F;&#x3057;&#x305F;&#x30D8;&#x30D1;&#x30E9;&#x30F3;&#x786B;&#x9178;&#x9396;&#x306E; deaminative &#x958B;&#x88C2;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x5F97;&#x3089;&#x308C;&#x305F;&#x30AA;&#x30EA;&#x30B4;&#x7CD6;&#x306E;&#x5206;&#x6790;&#x3059;&#x3079;&#x3066;&#x30B0;&#x30EB;&#x30AF;&#x30ED;&#x30F3;&#x9178;&#x30E6;&#x30CB;&#x30C3;&#x30C8;&#x3001;C5 - &#x4FDD;&#x6301;&#x3053;&#x3068;&#x793A;&#x3055;&#x308C;&#x308B;&#x5F71;&#x97FF;&#x3092;&#x53D7;&#x3051;&#x3084;&#x3059;&#x3044;&#x304B;&#x3001;&#x30A8;&#x30D4;&#x30E1;&#x30E9;&#x30FC;&#x30BC;&#x306B;&#x8010;&#x6027;&#x306E;&#x30B7;&#x30FC;&#x30B1;&#x30F3;&#x30B9;&#x304C;&#x767A;&#x751F;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x305F;&#x304B;&#x306B;&#x95A2;&#x4FC2;&#x306A;&#x304F;&#x3001;(3) H &#x30E9;&#x30D9;&#x30EB;&#x3002;&#x6700;&#x7D42;&#x7684;&#x306A;&#x88FD;&#x54C1;&#x306E;&#x3059;&#x3079;&#x3066;&#x306E; (3) H-&#x30E9;&#x30D9;&#x30EB; &#x30A8;&#x30D4;&#x30E1;&#x30E9;&#x30FC;&#x30BC;&#x3068;&#x306E;&#x5B75;&#x5316;&#x306F;&#x3069;&#x3046;&#x3084;&#x3089; O &#x786B;&#x9178;&#x30B0;&#x30EB;&#x30FC;&#x30D7; &#x30D6;&#x30ED;&#x30C3;&#x30AF;&#x306B;&#x3088;&#x308B;&#x53EF;&#x6EB6;&#x6027;&#x30B7;&#x30B9;&#x30C6;&#x30E0;&#x3001;&#x62B5;&#x6297;&#x3057;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x30B0;&#x30EB;&#x30AF;&#x30ED;&#x30F3;&#x9178; C5 &#x30A8;&#x30D4;&#x30DE;&#x30FC;&#x5316;&#x52B9;&#x679C;&#x7684;&#x306B;&#x751F;&#x4F53;&#x5185;&#x306E;&#x53EF;&#x9006;&#x7684;&#x3067;&#x3042;&#x308A;&#x3001;&#x751F;&#x5408;&#x6210;&#x306E;&#x6A5F;&#x68B0;&#x306E;&#x53B3;&#x3057;&#x3044;&#x7D44;&#x7E54;&#x306B;&#x4E3B;&#x5F35;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x793A;&#x5506;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;

&#x30D8;&#x30D1;&#x30E9;&#x30F3;&#x786B;&#x9178;&#x306E;&#x751F;&#x5408;&#x6210;&#x306B;&#x304A;&#x3051;&#x308B;&#x4E0D;&#x53EF;&#x9006;&#x30B0;&#x30EB;&#x30AF;&#x30ED;&#x30CB;&#x30EB;&#x30D2;&#x30C9;&#x30ED;&#x30E9;&#x30FC;&#x30BC; C5 &#x30A8;&#x30D4;&#x30DE;&#x30FC;&#x5316;&#x3002;

Glucuronyl C5 epimerase d glucuronic &#xC0B0; heparan &#xD669;&#xC0B0; &#xC5FC; &#xC0DD; &#xD569;&#xC131;&#xC5D0; l-iduronic acid &#xB2E8;&#xC704; &#xBCC0;&#xD658; catalyzes. &#xAE30;&#xD310; &#xC778;&#xC2DD;&#xACFC; heparan &#xD669;&#xC0B0; &#xC804;&#xC870; &#xB2E4; &#xB2F9; &#xB958;&#xC758; N-substituent &#xD328;&#xD134;&#xC5D0; &#xB530;&#xB77C; N sulfated &#xC218; &#xBE44;&#xB97C; &#xC904;&#xC774;&#xB294; &#xB05D; &#xBC29;&#xD5A5;&#xC73C;&#xB85C; &#xC778;&#xC811; &#xD55C; &#xAE00;&#xB8E8;&#xCF54;&#xC0AC;&#xBBFC; &#xC794;&#xB958;&#xBB3C;&#xC744; &#xC694;&#xAD6C; &#xD55C;&#xB2E4;. &#xC801;&#xC808; &#xD558; &#xAC8C; N sulfated &#xAE30;&#xD310;&#xC758; Epimerization d gluco &#xAD6C;&#xC131;&#xC758; &#xBCF4;&#xC874;&#xC744; &#xC120;&#xD638; &#xD558;&#xB294; &#xD3C9;&#xD615;&#xC73C;&#xB85C; &#xC218;&#xC6A9; &#xC131; &#xC2DC;&#xC2A4;&#xD15C;&#xC5D0; &#xC790;&#xC720;&#xB86D;&#xAC8C; &#xB4A4;&#xC9D1;&#xC744; &#xC218; &#xC788;&#xB2E4; (Hagner McWhirter &#xB300;&#xB2F5;, Lindahl, &#xBBF8;&#xAD6D;&#xC640; &#xB9AC;, &#xC81C;&#xC774;. Biochem (2000)&#xC785;&#xB2C8;&#xB2E4;. J. 347, 69-75)&#xC785;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294; &#xC778;&#xAC04; &#xBC30;&#xC544; &#xC2E0;&#xC7A5; 293 &#xC140; d-[5-(3) H] galactose &#xC7A0;&#xBCF5;&#xAE30;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xC140;&#xB8F0;&#xB7EC; &#xC2DC;&#xC2A4;&#xD15C;&#xC5D0;&#xC11C; epimerase &#xBC18;&#xC751;&#xC758; &#xBC18;&#xC804; &#xAE30;&#xB2A5;&#xC744; &#xACF5;&#xBD80; &#xD588;&#xB2E4;. &#xB808;&#xC774;&#xBE14;&#xACFC; glucuronic acid &#xB2E8;&#xC704;&#xC640; heparan &#xD669;&#xC0B0; &#xC804;&#xC870; &#xB2E4; &#xB2F9; &#xB958;&#xB85C; &#xD1B5;&#xD569; &#xB418;&#xC5C8;&#xB2E4; iduronic &#xC0B0; &#xD6C4;&#xC18D; C5-epimerization&#xC5D0; &#xB530;&#xB77C; &#xC190;&#xC2E4; &#xB418;&#xC5C8;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xADF8;&#xB7EC;&#xB098;, oligosaccharides &#xC131;&#xC219;&#xD55C; heparan &#xD669;&#xC0B0; &#xCCB4;&#xC778; deaminative &#xBD84;&#xC5F4; &#xD558; &#xC5EC; &#xC5BB;&#xC740; &#xBD84;&#xC11D; &#xD45C;&#xC2DC; &#xBAA8;&#xB4E0; glucuronic acid &#xB2E8;&#xC704; &#xCDE8;&#xC57D; &#xD558;&#xAC70;&#xB098; &#xC800;&#xD56D; &#xD558;&#xB294; epimerase &#xC2DC;&#xD000;&#xC2A4;&#xC5D0;&#xC11C; &#xBC1C;&#xC0DD; &#xD588;&#xB2E4; &#xC5EC;&#xBD80;&#xC5D0; &#xAD00;&#xACC4; &#xC5C6;&#xC774; &#xADF8;&#xB4E4;&#xC758; C5-(3) H &#xB808;&#xC774;&#xBE14;&#xC744; &#xC720;&#xC9C0; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xCD5C;&#xC885; &#xC81C;&#xD488;&#xC758; &#xBAA8;&#xB4E0; (3) H &#xB808;&#xC774;&#xBE14;&#xC744; O &#xD669;&#xC0B0; &#xADF8;&#xB8F9; &#xCC28;&#xB2E8; &#xB54C;&#xBB38;&#xC5D0; &#xBD84;&#xBA85;&#xD788; &#xC218;&#xC6A9; &#xC131; &#xC2DC;&#xC2A4;&#xD15C;&#xC5D0; epimerase&#xC640; &#xD568;&#xAED8; &#xBD80; &#xD654;&#xB97C; &#xC800;&#xD56D; &#xD588;&#xB2E4;. &#xC774; &#xACB0;&#xACFC; &#xB098;&#xD0C0;&#xB0B4;&#xACE0; glucuronic &#xC0B0; C5 epimerization vivo&#xC5D0;&#xC11C; &#xD6A8;&#xACFC;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xB418;&#xB3CC;&#xB9B4; &#xC218;&#xB294; &#xC0DD; &#xD569;&#xC131; &#xAE30;&#xACC4; &#xC5C4;&#xACA9;&#xD55C; &#xC870;&#xC9C1;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xB17C;&#xC7C1;.

&#xB3CC;&#xC774;&#xD0AC; &#xC218; &#xC5C6;&#xB294; glucuronyl C5 epimerization heparan &#xD669;&#xC0B0; &#xC5FC;&#xC758; &#xC0DD; &#xD569;&#xC131;&#xC5D0;.

Glucuronil C5-Epimerasa cataliza la conversi&oacute;n de &aacute;cido d-glucur&oacute;nico en unidades de &aacute;cido l-idur&oacute;nico en bios&iacute;ntesis de hepar&aacute;n sulfato. Reconocimiento del sustrato depende el patr&oacute;n N-sustituto del polisac&aacute;rido de precursor de hepar&aacute;n sulfato y requiere el residuo de glucosamina adyacentes hacia el extremo no reductor que N-sulfatada. Epimerizaci&oacute;n de un sustrato N-sulfatada apropiadamente es libremente reversible en un sistema soluble, con equilibrio, favoreciendo la retenci&oacute;n de la configuraci&oacute;n d-gluco (Hagner-McWhirter, A., Lindahl, U. y Li, j.-P. Biochem (2000). J. 347, 69-75). Estudiamos la reversibilidad de la reacci&oacute;n Epimerasa en un sistema celular, por incubaci&oacute;n de las c&eacute;lulas de ri&ntilde;&oacute;n embrionario humano 293 con d - galactosa [5-(3) H]. La etiqueta se incorpor&oacute; con unidades de &aacute;cido glucur&oacute;nico el polisac&aacute;rido de precursor de hepar&aacute;n sulfato y se perdi&oacute; en C5-epimerizaci&oacute;n posterior al &aacute;cido idur&oacute;nico. Sin embargo, el an&aacute;lisis de oligosac&aacute;ridos obtenidos por escote deaminative de las cadenas de maduro hepar&aacute;n sulfato indic&oacute; que todas las unidades de &aacute;cido glucur&oacute;nico conservan su etiqueta de C5 - 3 H, independientemente de si hab&iacute;an producido en secuencias susceptibles o resistentes a la Epimerasa. Todas (3) H-las etiquetas de los productos finales se resist&iacute;a a incubaci&oacute;n con Epimerasa en un sistema soluble, al parecer debido al bloqueo de grupos O-sulfato. Estos resultados indican que el &aacute;cido glucur&oacute;nico C5-Epimerizaci&oacute;n es efectivamente irreversible en vivo y abogar por una organizaci&oacute;n estricta de la maquinaria biosint&eacute;tica.

Irreversible glucuronil C5-Epimerizaci&oacute;n en la bios&iacute;ntesis de hepar&aacute;n sulfato.

&#x514D;&#x75AB;&#x5370;&#x8FF9;&#x662F;&#x5F3A;&#x5927;&#x7684;&#x548C;&#x5E7F;&#x6CDB;&#x4F7F;&#x7528;&#x7684;&#x65B9;&#x6CD5;&#xFF0C;&#x4F46;&#x5728;&#x68C0;&#x6D4B;&#x7075;&#x654F;&#x5EA6;&#x548C;&#x7279;&#x5F02;&#x6027;&#xFF0C;&#x4EE5;&#x53CA;&#x9AD8;&#x8D28;&#x91CF;&#x7684;&#x6297;&#x4F53;&#x6765;&#x68C0;&#x6D4B;&#x76EE;&#x6807;&#x7684;&#x86CB;&#x767D;&#xFF0C;&#x4F9D;&#x8D56;&#x7684;&#x5C40;&#x9650;&#x6027;&#x662F;&#x8981;&#x514B;&#x670D;&#x7684;&#x969C;&#x788D;&#x3002;&#x539F;&#x4F4D;&#x63A5;&#x8FD1;&#x7ED3;&#x624E;&#x672F;&#x68C0;&#x6D4B;&#x4E2D;&#xFF0C;&#x57FA;&#x4E8E;&#x53CC;&#x6297;&#x4F53;&#x8BC6;&#x522B;&#x548C;&#x5F3A;&#x5927;&#x7684;&#x672C;&#x5730;&#x5316;&#x7684;&#x4FE1;&#x53F7;&#x653E;&#x5927;&#xFF0C;&#x63D0;&#x4F9B;&#x4E86;&#x63D0;&#x9AD8;&#x7684;&#x68C0;&#x6D4B;&#x7075;&#x654F;&#x5EA6;&#x548C;&#x7279;&#x5F02;&#x6027;&#xFF0C;&#x80FD;&#x591F;&#x8BC6;&#x522B;&#x590D;&#x6742;&#x7684;&#x76EE;&#x6807;&#xFF0C;&#x5982;&#x78F7;&#x9178;&#x5316;&#x6216;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x7684;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x3002;&#x5728;&#x8FD9;&#x91CC;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x5DF2;&#x5C06;&#x5E94;&#x7528;&#x514D;&#x75AB;&#x5370;&#x8FF9;&#x7684;&#x539F;&#x4F4D;&#x63A5;&#x8FD1;&#x7ED3;&#x624E;&#x6CD5;&#x68C0;&#x6D4B;&#x673A;&#x5236;&#x3002;&#x8FD9;&#x79CD;&#x7EC4;&#x5408;&#x5141;&#x8BB8;&#x4F7F;&#x7528;&#x7B49;&#x6E29;&#x6EDA;&#x5706;&#x653E;&#x5927;&#x7684; DNA &#x5206;&#x5B50;&#x4E2D;&#x7279;&#x5B9A;&#x4E8E;&#x76EE;&#x6807;&#x7684;&#x7ED3;&#x624E;&#x7684;&#x53CD;&#x5E94;&#xFF0C;&#x5F62;&#x6210;&#x7684;&#x6570;&#x91CF;&#x6216;&#x68C0;&#x6D4B;&#x7075;&#x654F;&#x5EA6;&#x589E;&#x5E45;&#x8F83;&#x5927;&#x3002;&#x7531;&#x4E8E;&#x53CC;&#x6297;&#x4F53;&#x8BC6;&#x522B;&#x589E;&#x52A0;&#x7279;&#x5F02;&#x6027;&#x786E;&#x4FDD;&#x9AD8;&#x5EA6;&#x9009;&#x62E9;&#x6027;&#x68C0;&#x6D4B;&#x65B9;&#x6CD5;&#xFF0C;&#x68C0;&#x6D4B;&#x7279;&#x5B9A;&#x7684;&#x6CE2;&#x6BB5;&#x65F6;&#x90FD;&#x4F7F;&#x7528;&#x7684;&#x4E24;&#x4E2A;&#x4EA4;&#x53C9;&#x53CD;&#x5E94;&#x83CC;&#x6297;&#x4F53;&#x7684;&#x7EC4;&#x5408; &#xFF08;&#x5373;&#x4E24;&#x4E2A;&#x751F;&#x4EA7;&#x4E0D;&#x540C;&#x975E;&#x7279;&#x5F02;&#x6027;&#x4E50;&#x961F;&#x5728;&#x4F20;&#x7EDF;&#x514D;&#x75AB;&#x5370;&#x8FF9;&#xFF09;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x8FD8;&#x5C55;&#x793A;&#x4E86;&#x78F7;&#x9178;&#x5316;&#x7684;&#x8840;&#x5C0F;&#x677F;&#x884D;&#x751F;&#x7684;&#x751F;&#x957F;&#x56E0;&#x5B50;&#x53D7;&#x4F53; &beta; &#x68C0;&#x6D4B;&#x63A5;&#x8FD1;&#x7ED3;&#x624E;&#x4E0E;&#x4E00;&#x4E2A;&#x9488;&#x5BF9;&#x53D7;&#x4F53;&#x7684;&#x6297;&#x4F53;&#x548C;&#x53E6;&#x4E00;&#x79CD;&#x9488;&#x5BF9;&#x916A;&#x6C28;&#x9178;&#x78F7;&#x9178;&#x5316;&#x7684;&#x6E23;&#x3002;&#x8FD9;&#x907F;&#x514D;&#x4E86;&#x5265;&#x79BB;&#x548C;&#x518D;&#x8BA4;&#x8BC6;&#x819C;&#x6216;&#x5BF9;&#x9F50;&#x4E24;&#x4E2A;&#x5355;&#x72EC;&#x7684;&#x4F20;&#x7EDF;&#x6C61;&#x70B9;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x8BC1;&#x660E;&#x9AD8;&#x6027;&#x80FD;&#x539F;&#x4F4D;&#x63A5;&#x8FD1;&#x5370;&#x8FF9;&#x672C;&#x6587;&#x4E2D;&#x63CF;&#x8FF0;&#x7684;&#x57FA;&#x4E8E;&#x7ED3;&#x624E;&#x7684;&#x897F;&#x65B9;&#x4E0E;&#x589E;&#x5F3A;&#x5316;&#x5B66;&#x53D1;&#x5149;&#x548C;&#x8367;&#x5149;&#x68C0;&#x6D4B;&#x7CFB;&#x7EDF;&#xFF0C;&#x901A;&#x8FC7;&#x68C0;&#x6D4B;&#x517C;&#x5BB9;&#xFF0C;&#x53EF;&#x4EE5;&#x968F;&#x65F6;&#x8058;&#x7528;&#x4EFB;&#x4F55;&#x5B9E;&#x9A8C;&#x5BA4;&#x3002;

&#x901A;&#x8FC7;&#x9AD8;&#x6027;&#x80FD;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x5206;&#x6790;&#x63A5;&#x8FD1;&#x7ED3;&#x624E;&#x5370;&#x8FF9;&#x7684;&#x897F;&#x90E8;&#x3002;

Western blotting is a powerful and widely used method, but limitations in detection sensitivity and specificity, and dependence upon high quality antibodies to detect targeted proteins, are hurdles to overcome. The in situ proximity ligation assay, based on dual antibody recognition and powerful localized signal amplification, offers increased detection sensitivity and specificity, along with an ability to identify complex targets such as phosphorylated or interacting proteins. Here we have applied the in situ proximity ligation assay mechanism in Western blotting. This combination allowed the use of isothermal rolling circle amplification of DNA molecules formed in target-specific ligation reaction, for 16-fold or greater increase in detection sensitivity. The increased specificity because of dual antibody recognition ensured highly selective assays, detecting the specific band when combinations of two cross-reactive antitubulin antibodies were used (i.e. both producing distinct nonspecific bands in traditional Western blotting). We also demonstrated detection of phosphorylated platelet-derived growth factor receptor Î² by proximity ligation with one antibody directed against the receptor and another directed against the phosphorylated tyrosine residue. This avoided the need for stripping and re-probing the membrane or aligning two separate traditional blots. We demonstrate that the high-performance in situ proximity ligation-based Western blotting described herein is compatible with detection via enhanced chemiluminescence and fluorescence detection systems, and can thus be readily employed in any laboratory.

Western blotting via proximity ligation for high performance protein analysis.

&Eacute;ponger occidental est un puissant et m&eacute;thode largement utilis&eacute;e, mais les limitations de la sensibilit&eacute; et sp&eacute;cificit&eacute; et tributaire des anticorps de haute qualit&eacute; pour d&eacute;tecter les prot&eacute;ines cibl&eacute;es, sont des obstacles &agrave; surmonter. Le dosage de ligature de proximit&eacute; in situ, bas&eacute; sur la reconnaissance double anticorps et l&#39;amplification de signal localis&eacute;e puissant, offre la sensibilit&eacute; de d&eacute;tection accrue et de sp&eacute;cificit&eacute;, ainsi qu&#39;une capacit&eacute; &agrave; identifier des objectifs complexes comme les prot&eacute;ines phosphoryl&eacute;es ou interactives. Ici, nous avons appliqu&eacute; le m&eacute;canisme de dosage de ligature proximit&eacute; in situ en Western blot. Cette combinaison autorise l&#39;usage d&#39;isotherme amplification du cercle des mol&eacute;cules d&#39;ADN form&eacute; dans la r&eacute;action de ligature sp&eacute;cifique &agrave; la cible, pour 16 fois de roulement ou une plus grande augmentation de sensibilit&eacute; de d&eacute;tection. La sp&eacute;cificit&eacute; accrue en raison de la reconnaissance de la double anticorps assur&eacute;e essais hautement s&eacute;lectives, d&eacute;tectant la bande sp&eacute;cifique quand les combinaisons des deux anticorps antitubulines crois&eacute;es ont &eacute;t&eacute; utilis&eacute;es (c&#39;est-&agrave;-dire les deux producteurs non sp&eacute;cifiques bandes distinctes en &Eacute;ponger occidental traditionnel). Nous avons aussi d&eacute;montr&eacute; que d&eacute;tection de facteur de croissance d&eacute;riv&eacute; des plaquettes phosphoryl&eacute;s r&eacute;cepteurs &beta; par ligature de proximit&eacute; avec un anticorps dirig&eacute; contre le r&eacute;cepteur et l&#39;autre dirig&eacute;e contre le r&eacute;sidu tyrosine phosphoryl&eacute;es. Cela &eacute;vite la n&eacute;cessit&eacute; pour le d&eacute;capage et re-probing de la membrane ou en alignant les deux taches traditionnelles distinctes. Nous d&eacute;montrons que la proximit&eacute; de hautes performances in situe ax&eacute;e sur la ligature Western blotting d&eacute;crites dans les pr&eacute;sentes est compatible avec la d&eacute;tection par chimiluminescence am&eacute;lior&eacute;e et des syst&egrave;mes de d&eacute;tection de fluorescence et peut donc facilement travailler dans n&#39;importe quel laboratoire.

Western blotting par ligature de proximit&eacute; pour l&#39;analyse de prot&eacute;ines de haute performance.

Westliches Beflecken ist ein leistungsf&auml;higes und weit verbreitete Methode, aber Einschr&auml;nkungen bei der Erkennung-Sensitivit&auml;t und Spezifit&auml;t und Abh&auml;ngigkeit hochwertige Antik&ouml;rper gegen gezielte Proteine zu erkennen sind H&uuml;rden zu &uuml;berwinden. Die in-situ N&auml;he Ligation Probe, Grundlage dual Antik&ouml;rper Anerkennung und leistungsstarke lokalisierte Signalverst&auml;rkung, bietet h&ouml;here Erkennung Sensitivit&auml;t und Spezifit&auml;t, zusammen mit einer F&auml;higkeit, komplexe Ziele wie Phosphorylierte oder interagierenden Proteine zu identifizieren. Hier haben wir den in-situ N&auml;he Ligation Probe Mechanismus im westlichen Beflecken angewendet. Diese Kombination erlaubt die Verwendung von rollenden Kreis Verst&auml;rkung von DNA-Molek&uuml;len gegr&uuml;ndete zielspezifische Verbindungreaktion, f&uuml;r 16fache Isotherme oder st&auml;rkeren Anstieg der Erkennung Empfindlichkeit. Die erh&ouml;hte Spezifit&auml;t wegen dual Antik&ouml;rper Anerkennung gew&auml;hrleistet hochselektive Proben, die bestimmte Band zu erkennen, wenn Kombinationen von zwei kreuzreagierenden antitubulin Antik&ouml;rper verwendet wurden (d.h. beide produzieren unterschiedliche unspezifische Bands im traditionellen westlichen Beflecken). Wir zeigt auch Nachweis von phosphorylierten Platelet-derived Growth Factor Rezeptor &beta; N&auml;he Verbindung mit einem Antik&ouml;rper gegen den Rezeptor und anderen gegen den phosphoryliertes Tyrosin-R&uuml;ckstand gerichtet. Dies verhindert die Notwendigkeit Strippen und re-probing der Membran oder Ausrichten von zwei separate traditionelle Flecken. Wir zeigen, dass die in-situ-Hochleistungs-N&auml;he Ligaturen-basierte Western blotting hierin beschrieben kompatibel mit Erkennung &uuml;ber verst&auml;rkte Chemilumineszenz und Fluoreszenz-Detection-Systeme ist und somit leicht in jedem Labor eingesetzt werden kann.

Westlichen Beflecken &uuml;ber N&auml;he Ligaturen f&uuml;r Hochleistungs-Protein-Analyse.

Macchiarsi occidentale &egrave; un potente e Metodo largamente usato, ma le limitazioni nella sensibilit&agrave; e specificit&agrave; e dipendenza da anticorpi di alta qualit&agrave; per rilevare le proteine mirate, sono ostacoli da superare. Il dosaggio di legatura in situ prossimit&agrave;, basato sul riconoscimento del doppio anticorpo e amplificazione del segnale localizzato potente, offre maggiore sensibilit&agrave; e specificit&agrave;, insieme con la capacit&agrave; di identificare gli obiettivi complessi quali le proteine fosforilate o interagenti. Qui abbiamo applicato il meccanismo di dosaggio in situ prossimit&agrave; legatura in Western blotting. Questa combinazione permetteva l&#39;uso di isotermica rolling amplificazione cerchio delle molecole di DNA formato nella reazione di legatura mirate, per 16-fold o maggiore aumento della sensibilit&agrave; di rilevamento. La maggiore specificit&agrave; a causa del riconoscimento doppio anticorpo assicurata dosaggi altamente selettive, rilevando la band specifica quando sono state usate combinazioni di due anticorpi antitubulin interferenti (cio&egrave; entrambi produce distinte aspecifiche bande a macchiarsi occidentale tradizionale). Abbiamo anche dimostrato individuazione del fattore di crescita derivato dalle piastrine fosforilata del recettore &beta; di legatura di prossimit&agrave; con un anticorpo diretto contro il recettore e l&#39;altro diretto contro i residui di tirosina fosforilata. Questo evitato la necessit&agrave; di stripping e disondaggio la membrana o allineare due macchie tradizionale separate. Dimostriamo che la vicinanza in situ ad alte prestazioni basati su legatura Western blotting descritto nel presente documento &egrave; compatibile con rilevamento tramite chemiluminescenza avanzata e sistemi di rilevazione di fluorescenza e quindi pu&ograve; essere facilmente impiegato in qualsiasi laboratorio.

Western blotting tramite legatura di prossimit&agrave; per analisi delle proteine ad alte prestazioni.

&#x897F;&#x90E8;&#x306E;&#x3057;&#x307F;&#x304C;&#x4ED8;&#x304F;&#x3053;&#x3068;&#x5F37;&#x529B;&#x306A;&#x3067;&#x3042;&#x308A;&#x5E83;&#x304F;&#x4F7F;&#x7528;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x30E1;&#x30BD;&#x30C3;&#x30C9;&#x304C;&#x691C;&#x51FA;&#x611F;&#x5EA6;&#x304A;&#x3088;&#x3073;&#x7279;&#x7570;&#x6027;&#x3001;&#x304A;&#x3088;&#x3073;&#x30BF;&#x30FC;&#x30B2;&#x30C3;&#x30C8;&#x86CB;&#x767D;&#x8CEA;&#x3092;&#x691C;&#x51FA;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x9AD8;&#x54C1;&#x8CEA;&#x306E;&#x6297;&#x4F53;&#x4F9D;&#x5B58;&#x306E;&#x5236;&#x9650;&#x30CF;&#x30FC;&#x30C9;&#x30EB;&#x3092;&#x514B;&#x670D;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x3002;&#x30C7;&#x30E5;&#x30A2;&#x30EB;&#x6297;&#x4F53;&#x8A8D;&#x8B58;&#x3068;&#x5F37;&#x529B;&#x306A;&#x30ED;&#x30FC;&#x30AB;&#x30E9;&#x30A4;&#x30BA;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x4FE1;&#x53F7;&#x5897;&#x5E45;&#x306B;&#x57FA;&#x3065;&#x304F;&#x3001;in situ &#x8FD1;&#x63A5;&#x7D50;&#x7D2E;&#x30A2;&#x30C3;&#x30BB;&#x30A4;&#x3067;&#x306F;&#x3001;&#x5897;&#x52A0;&#x306E;&#x691C;&#x51FA;&#x611F;&#x5EA6;&#x3068;&#x7279;&#x7570;&#x6027;&#x30EA;&#x30F3;&#x9178;&#x5316;&#x307E;&#x305F;&#x306F;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x3059;&#x308B;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x306A;&#x3069;&#x306E;&#x8907;&#x96D1;&#x306A;&#x76EE;&#x6A19;&#x3092;&#x8B58;&#x5225;&#x3059;&#x308B;&#x80FD;&#x529B;&#x3068;&#x5171;&#x306B;&#x3092;&#x63D0;&#x4F9B;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3053;&#x3053;&#x30A6;&#x30A7;&#x30B9;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D6;&#x30ED;&#x30C3;&#x30C6;&#x30A4;&#x30F3;&#x30B0; in situ &#x8FD1;&#x63A5;&#x7D50;&#x7D2E;&#x30A2;&#x30C3;&#x30BB;&#x30A4; &#x30E1;&#x30AB;&#x30CB;&#x30BA;&#x30E0;&#x3092;&#x9069;&#x7528;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3053;&#x306E;&#x7D44;&#x307F;&#x5408;&#x308F;&#x305B;&#x306F;&#x3001;&#x30ED;&#x30FC;&#x30EA;&#x30F3;&#x30B0; &#x30B5;&#x30FC;&#x30AF;&#x30EB;&#x5897;&#x5E45; DNA &#x5206;&#x5B50;&#x30BF;&#x30FC;&#x30B2;&#x30C3;&#x30C8;&#x56FA;&#x6709;&#x306E; ligation &#x306E;&#x53CD;&#x4F5C;&#x7528;&#x306E;&#x305F;&#x3081; 16-fold &#x5F62;&#x6210;&#x306E;&#x7B49;&#x6E29;&#x306E;&#x4F7F;&#x7528;&#x3092;&#x8A31;&#x53EF;&#x307E;&#x305F;&#x306F;&#x691C;&#x51FA;&#x611F;&#x5EA6;&#x306E;&#x5927;&#x304D;&#x3044;&#x5897;&#x52A0;&#x3002;&#x30C7;&#x30E5;&#x30A2;&#x30EB;&#x6297;&#x4F53;&#x8A8D;&#x8B58;&#x306B;&#x3088;&#x308A;&#x9AD8;&#x3081;&#x3089;&#x308C;&#x305F;&#x7279;&#x5B9A;&#x6027;&#x9AD8;&#x9078;&#x629E;&#x7684;&#x8A66;&#x91D1;&#x3001;&#xFF08;&#x4F1D;&#x7D71;&#x7684;&#x306A;&#x30A6;&#x30A7;&#x30B9;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D6;&#x30ED;&#x30C3;&#x30C6;&#x30A4;&#x30F3;&#x30B0;&#x3059;&#x306A;&#x308F;&#x3061;&#x4E21;&#x65B9;&#x751F;&#x7523;&#x7570;&#x306A;&#x308B;&#x7121;&#x6307;&#x5B9A;&#x30D0;&#x30F3;&#x30C9;) 2 &#x3064;&#x306E;&#x4EA4;&#x5DEE;&#x53CD;&#x5FDC;&#x6027; antitubulin &#x6297;&#x4F53;&#x306E;&#x7D44;&#x307F;&#x5408;&#x308F;&#x305B;&#x304C;&#x4F7F;&#x7528;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x3068;&#x304D;&#x306B;&#x7279;&#x5B9A;&#x306E;&#x30D0;&#x30F3;&#x30C9;&#x3092;&#x691C;&#x51FA;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x78BA;&#x8A8D;&#x3057;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x6211;&#x3005; &#x3082;&#x30EA;&#x30F3;&#x9178;&#x5316;&#x8840;&#x5C0F;&#x677F;&#x7531;&#x6765;&#x5897;&#x6B96;&#x56E0;&#x5B50;&#x53D7;&#x5BB9;&#x4F53; &beta; &#x306E;&#x691C;&#x51FA;&#x8FD1;&#x63A5;&#x7D50;&#x7D2E;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066; 1 &#x3064;&#x306B;&#x5BFE;&#x3057;&#x3066;&#x53D7;&#x5BB9;&#x4F53;&#x6297;&#x4F53;&#x3092;&#x5B9F;&#x8A3C;&#x3057;&#x3001;&#x5225;&#x306E;&#x30EA;&#x30F3;&#x9178;&#x5316;&#x30C1;&#x30ED;&#x30B7;&#x30F3;&#x6B8B;&#x57FA;&#x306B;&#x5BFE;&#x3059;&#x308B;&#x76E3;&#x7763;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3053;&#x308C;&#x306F;&#x3001;&#x30B9;&#x30C8;&#x30EA;&#x30C3;&#x30D4;&#x30F3;&#x30B0;&#x3057;&#x819C;&#x518D;&#x5FB9;&#x5E95;&#x7684;&#x306A;&#x3084; 2 &#x3064;&#x306E;&#x5225;&#x3005; &#x306E;&#x4F1D;&#x7D71;&#x7684;&#x306A;&#x3057;&#x307F;&#x3092;&#x6574;&#x5217;&#x3059;&#x308B;&#x5FC5;&#x8981;&#x304C;&#x56DE;&#x907F;&#x3002;&#x6211;&#x3005; &#x306F;&#x3001;&#x9AD8;&#x30D1;&#x30D5;&#x30A9;&#x30FC;&#x30DE;&#x30F3;&#x30B9; in situ &#x8FD1;&#x63A5;&#x3053;&#x3053;&#x8AAC;&#x660E;&#x7D50;&#x7D2E;&#x30D9;&#x30FC;&#x30B9; &#x30A6;&#x30A8;&#x30B9;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D6;&#x30ED;&#x30C3;&#x30C8;&#x691C;&#x51FA;&#x3092;&#x4ECB;&#x3057;&#x3066;&#x5316;&#x5B66;&#x767A;&#x5149;&#x3084;&#x86CD;&#x5149;&#x691C;&#x51FA;&#x30B7;&#x30B9;&#x30C6;&#x30E0;&#x3068;&#x4E92;&#x63DB;&#x6027;&#x304C;&#x3042;&#x308B;&#x3057;&#x3001;&#x3053;&#x306E;&#x3088;&#x3046;&#x306B;&#x5BB9;&#x6613;&#x306B;&#x4EFB;&#x610F;&#x306E;&#x7814;&#x7A76;&#x5BA4;&#x3067;&#x7528;&#x3044;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x3067;&#x304D;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x793A;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

&#x9AD8;&#x6027;&#x80FD;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x89E3;&#x6790;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x8FD1;&#x63A5;&#x7D50;&#x7D2E;&#x3092;&#x4ECB;&#x3057;&#x3066;&#x30A6;&#x30A8;&#x30B9;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D6;&#x30ED;&#x30C3;&#x30C8;&#x304C;&#x767A;&#x751F;&#x3057;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;

&#xC11C;&#xC591; blotting&#xB294; &#xAC15;&#xB825; &#xD558; &#xACE0; &#xB110;&#xB9AC; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xB418;&#xB294; &#xBC29;&#xBC95;, &#xD558;&#xC9C0;&#xB9CC; &#xAC80;&#xCD9C; &#xAC10;&#xB3C4; &#xBC0F; &#xD2B9;&#xC774;&#xC131;, &#xACE0;&#xD488;&#xC9C8; &#xD56D; &#xCCB4; &#xD0C0;&#xAC9F;&#xB41C; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xAC80;&#xCD9C;&#xC5D0; &#xB530;&#xB77C; &#xC758;&#xC874;&#xC5D0; &#xD55C;&#xACC4;&#xB294; &#xC7A5;&#xC560;&#xBB3C;&#xC744; &#xADF9;&#xBCF5; &#xD558;&#xAE30; &#xC704;&#xD574;. &#xC6D0;&#xB798;&#xC758; &#xC7A5;&#xC18C;&#xC5D0; &#xADFC;&#xC811; &#xACB0; &#xCC30; &#xBD84;&#xC11D; &#xACB0;&#xACFC;, &#xC774;&#xC911; &#xD56D; &#xCCB4; &#xC778;&#xC2DD; &#xBC0F; &#xAC15;&#xB825;&#xD55C; &#xC9C0;&#xC5ED;&#xD654; &#xB41C; &#xC2E0;&#xD638; &#xC99D;&#xD3ED; &#xAE30;&#xBC18; &#xC99D;&#xAC00; &#xAC80;&#xCD9C; &#xAC10;&#xB3C4; &#xBC0F; &#xD2B9;&#xC774;&#xC131;, phosphorylated &#xB610;&#xB294; &#xC0C1;&#xD638; &#xC791;&#xC6A9; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xB4F1; &#xBCF5;&#xC7A1; &#xD55C; &#xBAA9;&#xD45C;&#xB97C; &#xC2DD;&#xBCC4; &#xD558;&#xB294; &#xB2A5;&#xB825;&#xACFC; &#xD568;&#xAED8; &#xC81C;&#xACF5; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC5EC;&#xAE30; &#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294; &#xC11C;&#xC591; blotting&#xC5D0; &#xC6D0;&#xB798;&#xC758; &#xC7A5;&#xC18C;&#xC5D0; &#xADFC;&#xC811; &#xACB0; &#xCC30; &#xBD84;&#xC11D; &#xACB0;&#xACFC; &#xBA54;&#xCEE4;&#xB2C8;&#xC998;&#xC744; &#xC801;&#xC6A9; &#xD588;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC774; &#xC870;&#xD569;&#xC740; &#xD5C8;&#xC6A9; 16-fold&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xD2B9;&#xC815; &#xB300;&#xC0C1; &#xACB0; &#xCC30; &#xBC18;&#xC751;&#xC5D0;&#xC11C; &#xD615;&#xC131; &#xD558;&#xB294; DNA &#xBD84;&#xC790;&#xC758; &#xC6D0; &#xD655;&#xB300;&#xB97C; &#xC555; &#xC5F0; &#xD558;&#xB294; &#xB4F1;&#xC628; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xB610;&#xB294; &#xAC10;&#xC9C0; &#xAC10;&#xB3C4;&#xC5D0; &#xD070; &#xC99D;&#xAC00;. &#xC774;&#xC911; &#xD56D; &#xCCB4; &#xC778;&#xC2DD; &#xB54C;&#xBB38;&#xC5D0; &#xC99D;&#xAC00; &#xD55C; &#xD2B9;&#xC774;&#xC131; &#xBCF4;&#xC7A5; &#xBD84;&#xC11D; &#xB9E4;&#xC6B0; &#xC120;&#xD0DD;&#xC801; &#xC2E4;&#xD5D8;, &#xB450; cross-reactive antitubulin &#xD56D; &#xCCB4;&#xC758; &#xC870;&#xD569;&#xC744; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558;&#xB294; &#xACBD;&#xC6B0; &#xD2B9;&#xC815; &#xBC34;&#xB4DC;&#xB97C; &#xAC10;&#xC9C0; (&#xC989; &#xC0DD;&#xC0B0; &#xACE0;&#xC720; &#xC77C;&#xBC18; &#xB300;&#xC5ED; &#xBAA8;&#xB450; &#xC804;&#xD1B5;&#xC801;&#xC778; &#xC11C;&#xC591; blotting&#xC5D0;). &#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294; &#xB610;&#xD55C; &#xD558;&#xB098;&#xC758; &#xD56D; &#xCCB4; &#xC218;&#xC6A9; &#xCCB4;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xAC10;&#xB3C5;&#xACFC; &#xADFC;&#xC811; &#xACB0; &#xCC30;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; phosphorylated &#xD608;&#xC18C;&#xD310; &#xC720;&#xB798; &#xC131;&#xC7A5; &#xC778;&#xC790; &#xC218;&#xC6A9; &#xCCB4; &beta;&#xC758; &#xAC80;&#xCD9C; &#xC2DC;&#xC5F0; &#xBC0F; &#xB2E4;&#xB978; phosphorylated &#xD2F0;&#xB85C;&#xC2E0; &#xC794;&#xB958;&#xBB3C;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xAC10;&#xB3C5;. &#xC774;&#xAC83;&#xC740; &#xC2A4;&#xD2B8;&#xB9BD; &#xD558; &#xACE0; &#xB9C9; re-probing &#xB610;&#xB294; &#xB450; &#xAC1C;&#xC758; &#xBCC4;&#xB3C4; &#xC804;&#xD1B5;&#xC801;&#xC778;&#xB3C4; &#xB9D0; &#xC815;&#xB82C;&#xC744; &#xC704;&#xD55C; &#xD544;&#xC694; &#xD53C;&#xD560;. &#xC6B0;&#xB9AC; &#xBCF4;&#xC5EC; &#xACE0;&#xC131;&#xB2A5; &#xD604;&#xC7A5;&#xC5D0;&#xC11C; &#xADFC;&#xC811; &#xACB0; &#xCC30;&#xC5D0; &#xAE30;&#xCD08;&#xB97C; &#xB454; &#xC11C;&#xC591; &#xC5EC;&#xAE30; &#xC124;&#xBA85; blotting &#xD5A5;&#xC0C1; &#xB41C; &#xD654;&#xD559; &#xBC0F; &#xD615;&#xAD11; &#xAC80;&#xCD9C; &#xC2DC;&#xC2A4;&#xD15C;&#xC744; &#xD1B5;&#xD574; &#xD0D0;&#xC9C0;&#xC640; &#xD638;&#xD658;&#xC744; &#xC5B4;&#xB5A4; &#xC2E4;&#xD5D8;&#xC2E4;&#xC5D0; &#xB530;&#xB77C;&#xC11C; &#xC27D;&#xAC8C; &#xCC44;&#xD0DD; &#xB420; &#xC218; &#xC788;&#xB2E4;.

Western blotting &#xACE0;&#xC131;&#xB2A5; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xBD84;&#xC11D;&#xC744; &#xC704;&#xD55C; &#xADFC;&#xC811; &#xACB0; &#xCC30;&#xC744; &#xD1B5;&#xD574;.

Western Blot es un de gran alcance y m&eacute;todo ampliamente utilizado, pero con limitaciones en la sensibilidad de detecci&oacute;n y especificidad y dependencia de los anticuerpos de alta calidad para detectar prote&iacute;nas espec&iacute;ficas, son obst&aacute;culos que superar. El ensayo de ligadura de proximidad in situ, basado en el reconocimiento de doble anticuerpo y amplificaci&oacute;n de la se&ntilde;al localizada potente, ofrece detecci&oacute;n mayor sensibilidad y especificidad, junto con una capacidad para identificar objetivos complejos como las prote&iacute;nas fosforiladas o interacci&oacute;n. Aqu&iacute; hemos aplicado el mecanismo de an&aacute;lisis in situ de proximidad ligadura en Western blotting. Esta combinaci&oacute;n permite el uso de isot&eacute;rmico balanceo amplificaci&oacute;n de c&iacute;rculo de mol&eacute;culas de ADN formadas en reacci&oacute;n de ligadura espec&iacute;fico del destino, para 16-fold o mayor incremento en la sensibilidad de detecci&oacute;n. La mayor especificidad por reconocimiento de doble anticuerpo asegur&oacute; ensayos altamente selectivos, detectar la banda espec&iacute;fica cuando se utilizan combinaciones de dos anticuerpos antitubulin cruz-reactivos (es decir, ambos productores inespec&iacute;ficos vendas distintas en Western blotting tradicional). Tambi&eacute;n demostramos la detecci&oacute;n de factor de crecimiento derivado de plaquetas fosforilado del receptor &beta; por ligadura de proximidad con un anticuerpo dirigido contra el receptor y otra dirigida contra los residuos de tirosina fosforilados. Esto evita la necesidad de pelar y re-probing de la membrana o alinear dos lacras tradicionales separados. Demostramos que la proximidad de in situ de alto rendimiento basadas en la ligadura Western Blot descrito en este documento es compatible con la detecci&oacute;n mediante sistemas de detecci&oacute;n de fluorescencia y quimioluminiscencia mejorada y as&iacute; puede utilizarse f&aacute;cilmente en cualquier laboratorio.

Asa Hagner-McWhirter

Research and Development

GE Healthcare Bio-Sciences AB

Selective Labelling of Cell-surface Proteins using CyDye DIGE Fluor Minimal Dyes

Asa Hagner-McWhirter

.css-o250i3{font-size:18px;font-family:Open Sans,sans-serif;line-height:21.6px;}Research and Development

GE Healthcare Bio-Sciences AB

Selective Labelling of Cell-surface Proteins using CyDye DIGE Fluor Minimal Dyes

Research and Development