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Single Cell Measurements of Vacuolar Rupture Caused by Intracellular Pathogens

Shigella flexneri are pathogenic bacteria that invade host cells entering into an endocytic vacuole. Subsequently, the rupture of this membrane-enclosed ...

Institut Pasteur, Paris, France

Sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs) are transcription factors involved in the synthesis of cholesterol and fatty acids. In adults, the isoform SREBP-1c is the predominant transcript in the liver of fed animals, and it activates triglyceride production from glucose when diet is enriched in carbohydrates. Studies have shown that SREBP-1c expression is dependent on insulin but also on the availability of oxysterols, ligands of the nuclear liver X receptor (LXR). The aim of this study was to investigate the regulation of the hepatic SREBP-1c expression in vivo in situations where drastic nutritional and hormonal changes occur, from the gestation to the weaning period. In this paper, we report the discovery of LXR-independent SREBP-1c transcriptional activity during late gestation. In utero insulin injection prior to the natural rise in insulin in late gestation triggers SREBP-1c mRNA elevation, nuclear SREBP-1c binding activity, and expression of its target genes independently of LXR transactivation. On the other hand, during suckling, we observed strong SREBP-1c mRNA expression despite very low plasma insulin, an expression that may be due to LXR transactivation. In contrast to insulin, LXR is not sufficient to trigger nuclear SREBP-1c binding activity and target gene induction. This could be due to the concomitant induction of INSIG-2a by LXR and subsequent retention of SREBP-1c in the endoplasmic reticulum.

Differential regulation of sterol regulatory element-binding protein 1c transcriptional activity by insulin and liver X receptor during liver development.

Prot&eacute;ines liant l&#39;&eacute;l&eacute;ment r&eacute;glementaires de st&eacute;rol (SREBP) sont des facteurs de transcription impliqu&eacute;s dans la synth&egrave;se du cholest&eacute;rol et des acides gras. Chez l&#39;adulte, l&#39;isoforme SREBP - 1C est la transcription pr&eacute;dominante dans le foie des animaux nourris, et il active la production de triglyc&eacute;rides du glucose lorsque le r&eacute;gime alimentaire est riche en hydrates de carbone. Des &eacute;tudes ont montr&eacute; qu&#39;expression SREBP - 1C d&eacute;pend de l&#39;insuline mais aussi sur la disponibilit&eacute; des oxyst&eacute;rols, ligands du nucl&eacute;aire liver X receptor (LXR). Le but de cette &eacute;tude &eacute;tait d&#39;&eacute;tudier la r&eacute;gulation de l&#39;expression h&eacute;patique de SREBP - 1C in vivo dans des situations o&ugrave; des changements nutritionnels et hormones se produisent, de la gestation jusqu&#39;&agrave; la p&eacute;riode de sevrage. Dans cet article, nous rapportons la d&eacute;couverte de l&#39;activit&eacute; transcriptionnelle de LXR ind&eacute;pendant SREBP - 1C en fin de gestation. Injection d&#39;insuline in utero avant l&#39;augmentation naturelle de l&#39;insuline en fin de gestation d&eacute;clenche l&#39;&eacute;l&eacute;vation de l&#39;ARNm SREBP - 1C, activit&eacute; de liaison SREBP - 1C nucl&eacute;aire et expression de ses g&egrave;nes cibles ind&eacute;pendamment de transactivation LXR. En revanche, au cours de l&#39;allaitement, nous avons observ&eacute; forte expression de l&#39;ARNm SREBP - 1C malgr&eacute; la tr&egrave;s faible insulin&eacute;mie, une expression qui peut &ecirc;tre due &agrave; la transactivation LXR. Contrairement &agrave; l&#39;insuline, LXR n&#39;est pas suffisante pour d&eacute;clencher le nucl&eacute;aire SREBP - 1C liaison activit&eacute; et cible g&egrave;ne induction. Cela pourrait &ecirc;tre d&ucirc; &agrave; l&#39;induction concomitante d&#39;INSIG-2 a par LXR et r&eacute;tention ult&eacute;rieure de SREBP - 1C dans le r&eacute;ticulum endoplasmique.

R&eacute;gulation diff&eacute;rentielle de l&#39;activit&eacute; transcriptionnelle de st&eacute;rol prot&eacute;ine r&eacute;gulatrice de liaison &eacute;l&eacute;ment 1C de r&eacute;cepteur de l&#39;insuline et le foie X pendant le d&eacute;veloppement du foie.

Sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs) sono fattori di trascrizione coinvolti nella sintesi di acidi grassi e colesterolo. Negli adulti, l&#39;isoforma SREBP - 1c &egrave; la trascrizione predominante nel fegato di animali nutriti, e che attiva la produzione di trigliceridi da glucosio quando la dieta &egrave; arricchita in carboidrati. Gli studi hanno dimostrato che SREBP - 1c espressione dipende da insulina ma anche sulla disponibilit&agrave; di oxysterols, ligandi del nucleare fegato X receptor (LXR). Lo scopo di questo studio era di studiare la regolazione dell&#39;espressione epatica SREBP - 1c in vivo in situazioni dove si verificano drastici cambiamenti nutrizionali e ormonali, dalla gestazione al periodo dello svezzamento. In questa carta, segnaliamo la scoperta di attivit&agrave; trascrizionale LXR-indipendente SREBP - 1c durante la tarda gestazione. Iniezione di insulina in utero prima l&#39;aumento naturale della insulina nella tarda gestazione innesca elevazione SREBP - 1 c mRNA nucleare attivit&agrave; associazione SREBP - 1 c ed espressione dei suoi geni bersaglio indipendentemente dalla transattivazione LXR. D&#39;altra parte, durante l&#39;allattamento, abbiamo osservato la forte espressione del mRNA SREBP - 1c nonostante insulina molto bassi al plasma, un&#39;espressione che pu&ograve; essere causa di transattivazione LXR. A differenza dell&#39;insulina, LXR non &egrave; sufficiente a far scattare il nucleare SREBP - 1 c associazione attivit&agrave; e destinazione gene induzione. Questo potrebbe essere dovuto l&#39;induzione concomitante di INSIG-2a di LXR e conseguente ritenzione di SREBP - 1 c nel reticolo endoplasmatico.

Regolamento differenziale di sterol regulatory element-binding protein 1c transcriptional attivit&agrave; dal recettore X insulina e fegato durante lo sviluppo di fegato.

Sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs) are transcription factors central to the regulation of lipid metabolism. The SREBPs are synthesized as precursor proteins that require proteolytic processing to become transcriptionally active. Whereas the regulation of SREBP-1a and -2 cleavage by cellular sterol content is well defined, much less is known about the regulation of SREBP-1c, the predominant SREBP isoform in the liver. Both insulin and liver X receptor alpha (LXRalpha) induce SREBP-1c transcription; however, the respective roles of these factors and the mechanism responsible for proteolytic cleavage of this SREBP isoform are not known. In this study, we compare the effects of insulin and LXR agonist TO-901317 on SREBP-1c expression and transcriptional activity in isolated rat hepatocytes. We report that full induction of the mature and transcriptionally active form of SREBP-1c protein requires insulin. Although activation of LXR leads to the induction of SREBP-1c gene expression and precursor protein, it has a very poor effect in inducing the mature nuclear form of the transcription factor. This may be due to the induction of insulin-induced gene-2a mRNA and protein by LXR activation. The LXR-induced SREBP-1c precursor, however, is rapidly cleaved on acute exposure to insulin via a phosphatidylinositol 3-kinase-dependent mechanism. Finally, we show through experiments in suckling mice that this acute action of insulin to stimulate the proteolytic processing of SREBP-1c is functional in vivo.

Distinct roles of insulin and liver X receptor in the induction and cleavage of sterol regulatory element-binding protein-1c.

Prot&eacute;ines liant l&#39;&eacute;l&eacute;ment r&eacute;glementaires de st&eacute;rol (SREBP) sont des facteurs de transcription centrales dans la r&eacute;gulation du m&eacute;tabolisme des lipides. La SREBP est synth&eacute;tis&eacute;es sous forme de prot&eacute;ines pr&eacute;curseurs n&eacute;cessitant prot&eacute;olytique de transformation pour devenir transcriptionnellement actif. Consid&eacute;rant que le r&egrave;glement de SREBP-1 a et -2 clivage de contenu en st&eacute;rols cellulaire est bien d&eacute;fini, est beaucoup moins connu sur la r&eacute;gulation de SREBP - 1C, l&#39;isoforme SREBP pr&eacute;dominant dans le foie. L&#39;insuline et foie X alpha du r&eacute;cepteur (LXRalpha) induisent la transcription SREBP - 1C ; Cependant, les r&ocirc;les respectifs de ces facteurs et le m&eacute;canisme responsable de clivage prot&eacute;olytique de cette isoforme SREBP ne sont pas connus. Dans cette &eacute;tude, nous comparons les effets de l&#39;insuline et agoniste LXR TO-901317 sur l&#39;expression SREBP - 1C et activit&eacute; transcriptionnelle dans les h&eacute;patocytes de rat isol&eacute;. Les auteurs rapportent que l&#39;induction compl&egrave;te de la forme mature et activit&eacute; de transcription SREBP - 1C prot&eacute;ine n&eacute;cessite l&#39;insuline. Bien que l&#39;activation de LXR conduit &agrave; l&#39;induction de l&#39;expression du g&egrave;ne SREBP - 1C et pr&eacute;curseur de la prot&eacute;ine, il a un effet tr&egrave;s pauvre en induisant la forme mature nucl&eacute;aire du facteur de transcription. Cela peut &ecirc;tre d&ucirc; &agrave; l&#39;induction de l&#39;ARNm du g&egrave;ne induite par l&#39;insuline-2 a et de prot&eacute;ines par activation de LXR. Le pr&eacute;curseur induite par le LXR SREBP - 1C, cependant, est rapidement cliv&eacute; sur une exposition aigu&euml; &agrave; l&#39;insuline par un m&eacute;canisme de phosphatidylinositol 3-kinase d&eacute;pendante. Enfin, nous montrons &agrave; travers les exp&eacute;riences chez les souris que cette action aigu&euml; d&#39;insuline pour stimuler le traitement prot&eacute;olytique de SREBP - 1C est fonctionnelle allait&eacute;es in vivo.

R&ocirc;les distincts du r&eacute;cepteur de l&#39;insuline et le foie X dans l&#39;induction et le clivage du st&eacute;rol r&eacute;glementaire liaison &eacute;l&eacute;ment prot&eacute;ine - 1C.

Sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs) sono fattori di trascrizione centrale alla regolazione del metabolismo lipidico. Il SREBPs sono sintetizzati come proteine precursore che richiedono elaborazione per diventare transcriptionally attivi proteolitici. Considerando che il regolamento di SREBP-1a e -2 scissione dal contenuto di steroli cellulare &egrave; ben definito, tanto meno &egrave; conosciuto circa il regolamento di SREBP - 1 c, l&#39;isoforma predominante SREBP nel fegato. Insulina e fegato X alfa del ricevitore (LXRalpha) inducono la trascrizione di SREBP - 1c; Tuttavia, i rispettivi ruoli di questi fattori e il meccanismo responsabile del clivaggio proteolitico di questa isoforma SREBP non sono noti. In questo studio, si confrontano gli effetti di insulina e agonista LXR TO-901317 su SREBP - 1c espressione e attivit&agrave; transcriptional in epatociti isolati di ratto. Segnaliamo che l&#39;induzione completa della forma matura e transcriptionally active della proteina SREBP - 1c richiede insulina. Sebbene l&#39;attivazione di LXR conduce per l&#39;induzione dell&#39;espressione del gene SREBP - 1c e proteina precursore, ha un effetto molto povero a indurre il matura forma nucleare del fattore di trascrizione. Ci&ograve; pu&ograve; essere dovuto l&#39;induzione di insulino-indotta gene-2a mRNA e proteina di attivazione LXR. Il precursore di LXR-indotta SREBP - 1c, tuttavia, &egrave; rapidamente spaccato sull&#39;esposizione acuta all&#39;insulina attraverso un meccanismo di fosfatidilinositolo 3-chinasi-dipendente. Infine, vi mostriamo attraverso esperimenti nel lattante topi che questa azione acuta dell&#39;insulina di stimolare l&#39;elaborazione proteolitica di SREBP - 1c &egrave; funzionale in vivo.

Distinti ruoli del recettore X insulina e fegato nell&#39;induzione e la scissione di sterolo normativa element-binding proteina - 1c.

[A new role for insulin in the control of energetic metabolism in liver].

[Un nouveau r&ocirc;le pour l&#39;insuline dans le contr&ocirc;le du m&eacute;tabolisme &eacute;nerg&eacute;tique dans le foie].

[Un nuovo ruolo per insulina nel controllo del metabolismo energetico nel fegato].

Cette &eacute;tude examine le r&ocirc;le de l&#39;insuline et l&#39;angiotensine II dans le m&eacute;tabolisme des lipoprot&eacute;ines de haute densit&eacute; (HDL) en mettant l&#39;accent sur la r&eacute;gulation et la fonction de scavenger r&eacute;cepteur type-BI (SR-BI) dans le tissu adipeux.

Preuves in vivo d&#39;un r&ocirc;le du tissu adipeux SR-BI dans la r&eacute;gulation nutritionnelle et hormonal de l&#39;hom&eacute;ostasie du cholest&eacute;rol et l&#39;adiposit&eacute;.

Questo studio analizza il ruolo dell&#39;insulina e dell&#39;angiotensina II nel metabolismo della lipoproteina ad alta densit&agrave; (HDL) concentrandosi sul regolamento e funzione di scavenger receptor type-BI (SR-BI) nel tessuto adiposo.

Prove in vivo per un ruolo del tessuto adiposo SR-BI nella regolazione ormonale e nutrizionale della omeostasi del colesterolo e adiposit&agrave;.

This study examines the role of insulin and angiotensin II in high-density lipoprotein (HDL) metabolism by focusing on the regulation and function of scavenger receptor type-BI (SR-BI) in adipose tissue.

In vivo evidence for a role of adipose tissue SR-BI in the nutritional and hormonal regulation of adiposity and cholesterol homeostasis.

Escape into the host cell cytosol following invasion of mammalian cells is a common strategy used by invasive pathogens. This requires membrane rupture of the vesicular or vacuolar compartment formed around the bacteria after uptake into the host cell. The mechanism of pathogen-induced disassembly of the vacuolar membrane is poorly understood. We established a novel, robust and sensitive fluorescence microscopy method that tracks the precise time point of vacuole rupture upon uptake of Gram-negative bacteria. This revealed that the enteroinvasive pathogen Shigella flexneri escapes rapidly, in less than 10 min, from the vacuole. Our method demonstrated the recruitment of host factors, such as RhoA, to the bacterial entry site and their continued presence at the point of vacuole rupture. We found a novel host marker for ruptured vacuoles, galectin-3, which appears instantly in the proximity of bacteria after escape into the cytosol. Furthermore, we show that the Salmonella effector proteins, SifA and PipB2, stabilize the vacuole membrane inhibiting bacterial escape from the vacuole. Our novel approach to track vacuole rupture is ideally suited for high-content and high-throughput approaches to identify the molecular and cellular mechanisms of membrane rupture during invasion by pathogens such as viruses, bacteria and parasites.

Tracking the dynamic interplay between bacterial and host factors during pathogen-induced vacuole rupture in real time.

&Eacute;vadez-vous dans le cytosol cellulaire h&ocirc;te suite &agrave; l&#39;invasion des cellules de mammif&egrave;res est une strat&eacute;gie commune utilis&eacute;e par des agents pathog&egrave;nes envahissants. Cela exige la rupture des membranes du compartiment v&eacute;siculaire ou vacuolaire form&eacute; autour de la bact&eacute;rie apr&egrave;s absorption dans la cellule h&ocirc;te. Le m&eacute;canisme du d&eacute;montage induite par l&#39;agent pathog&egrave;ne de la membrane vacuolaire est mal compris. Nous avons mis en place une m&eacute;thode de microscopie de fluorescence roman, robuste et sensible qui suit le point dans le temps pr&eacute;cis de rupture de la vacuole apr&egrave;s absorption de bact&eacute;ries &agrave; Gram n&eacute;gatif. Il en est ressorti que l&#39;e.coli pathog&egrave;ne Shigella flexneri s&#39;&eacute;chappe rapidement, en moins de 10 min, de la vacuole. Notre m&eacute;thode a d&eacute;montr&eacute; le recrutement des facteurs de l&#39;h&ocirc;te, tels que RhoA, le site d&#39;entr&eacute;e bact&eacute;rienne et leur pr&eacute;sence continue au point de rupture de la vacuole. Nous avons trouv&eacute; un marqueur de roman h&ocirc;te pour ruptures vacuoles, galectine-3, qui s&#39;affiche instantan&eacute;ment dans la proximit&eacute; des bact&eacute;ries apr&egrave;s l&#39;&eacute;vasion dans le cytosol. En outre, nous montrons que les prot&eacute;ines effectrices de Salmonella, SifA et PipB2, stabiliser la membrane de la vacuole inhibant bact&eacute;rien s&#39;&eacute;chapper de la vacuole. Notre approche novatrice pour suivre la rupture de la vacuole est id&eacute;alement adapt&eacute; pour des approches haute teneur et haut d&eacute;bit afin d&#39;identifier les m&eacute;canismes mol&eacute;culaires et cellulaires de la rupture des membranes au cours de l&#39;invasion de pathog&egrave;nes comme les virus, les bact&eacute;ries et les parasites.

Suivi de l&#39;interaction dynamique entre facteurs bact&eacute;riens et h&ocirc;te au cours de la rupture de la vacuole induite par l&#39;agent pathog&egrave;ne en temps r&eacute;el.

Fuga nel cytosol delle cellule ospite seguito all&#39;invasione delle cellule di mammiferi &egrave; una strategia comune utilizzata da agenti patogeni invasivi. Questo richiede la rottura della membrana vescicolare o vacuolare vano formato intorno i batteri dopo assorbimento nella cellula ospite. Il meccanismo di smontaggio patogeno-indotta della membrana vacuolar &egrave; scarsamente compreso. Abbiamo stabilito un metodo di microscopia di fluorescenza romanzo, robusto e sensibile che registra il punto preciso tempo di rottura del vacuolo su assorbimento di batteri Gram-negativi. Questo ha rivelato che il enteroinvasive patogeni Shigella flexneri sfugge rapidamente, in meno di 10 min, dal vacuolo. Il nostro metodo ha dimostrato l&#39;assunzione di fattori ospite, quali RhoA, al sito voce batterica e la loro presenza costante sul punto di rottura del vacuolo. Abbiamo trovato un marcatore romanzo host per rotti vacuoli, galectin-3, che appare immediatamente in prossimit&agrave; dei batteri dopo la fuga nel cytosol. Inoltre, ci mostra che le proteine effettrici Salmonella, SifA e PipB2, stabilizzare la membrana del vacuolo inibizione batterica sfuggire il vacuolo. Nostro approccio innovativo per tenere traccia di rottura vacuolo &egrave; ideale per gli approcci di alto-rendimento e ad alto contenuto di identificare i meccanismi molecolari e cellulari della rottura della membrana durante l&#39;invasione di agenti patogeni quali virus, batteri e parassiti.

Rilevamento dell&#39;interazione dinamica tra fattori batterici e host durante la rottura indotta dal patogeno vacuolo in tempo reale.

A common strategy of microbial pathogens is to invade host cells during infection. The invading microbes explore different intracellular compartments to find their preferred niche.

Spotting the right location- imaging approaches to resolve the intracellular localization of invasive pathogens.

Une strat&eacute;gie commune des pathog&egrave;nes microbiens est d&#39;envahir les cellules de l&#39;h&ocirc;te au cours de l&#39;infection. Les microbes envahisseurs explorent diff&eacute;rents compartiments intracellulaires pour trouver leur cr&eacute;neau privil&eacute;gi&eacute;.

Rep&eacute;rer les approches de localisation d&#39;image droite pour r&eacute;soudre la localisation intracellulaire de pathog&egrave;nes invasifs.

Una strategia comune di microbi patogeni &egrave; di invadere le cellule ospiti durante l&#39;infezione. I microbi invasori esplorano diversi compartimenti intracellulari per trovare la loro nicchia preferito.

Individuare la giuste posizione-imaging approcci per risolvere la localizzazione intracellulare di agenti patogeni invasivi.

Invasive bacterial pathogens such as Shigella flexneri force their uptake into non-phagocytic host cells. Upon internalization, they rupture the endocytic vacuole and escape into the host cell cytoplasm. Recent studies applying fluorescence resonance energy transfer (FRET) based methods to track host-pathogen interactions have provided insights into the process of bacterial infection at the single cell level. We have previously reported that the vacuolar escape of invasive bacteria into the host cellular cytosol can be tracked by fluorescence microscopy using a FRET CCF4/Î²-Lactamase reporter assay. Here, we show that our vacuolar rupture assay can also be analyzed by flow cytometry constituting an important alternative to data acquisition by microscopy. Whereas analysis of our assay by fluorescence microscopy offers precise spatiotemporal resolution, flow cytometry analysis represents a high-throughput method that allows efficient and fast quantification of a large number of events and can further improve future research on vacuolar escape.

Monitoring Shigella flexneri vacuolar escape by flow cytometry.

Invasives bact&eacute;riennes pathog&egrave;nes comme Shigella flexneri forcer leur absorption dans les cellules h&ocirc;tes non phagocytaires. Apr&egrave;s internalisation, ils rompent la vacuole endocytose et la fuite dans le cytoplasme de la cellule h&ocirc;te. Des &eacute;tudes r&eacute;centes, appliquant les m&eacute;thodes de transfert (FRET) bas&eacute;e d&#39;&eacute;nergie de r&eacute;sonance de fluorescence pour suivre les interactions h&ocirc;te-pathog&egrave;ne ont fourni des id&eacute;es dans le processus d&#39;infection bact&eacute;rienne au niveau de la cellule unique. Nous avons d&eacute;j&agrave; rapport&eacute; que l&#39;&eacute;vasion vacuolaire de bact&eacute;ries envahissantes dans le cytosol cellulaire de l&#39;h&ocirc;te peut &ecirc;tre d&eacute;tect&eacute;e en microscopie de fluorescence en utilisant un test de journaliste frette CCF4/&beta;-Lactamase. Ici, nous montrons que notre test de rupture vacuolaire peut &eacute;galement &ecirc;tre analys&eacute; par cytom&eacute;trie en flux, constituant une alternative importante &agrave; l&#39;acquisition de donn&eacute;es par microscopie. Consid&eacute;rant que l&#39;analyse de notre essai par microscopie de fluorescence offre une r&eacute;solution spatio-temporelle pr&eacute;cise, analyse en cytom&eacute;trie en flux repr&eacute;sente une m&eacute;thode de haut-d&eacute;bit qui permet la quantification rapide et efficace d&#39;un grand nombre d&#39;&eacute;v&eacute;nements et peut am&eacute;liorer les recherches futures sur &eacute;vasion vacuolaire.

Surveillance Shigella flexneri vacuolaire &eacute;vasion par cytom&eacute;trie en flux.

Invasivi batterici patogeni quali Shigella flexneri forzare loro assorbimento nelle cellule ospiti non fagocitica. All&#39;interiorizzazione, essi rottura il vacuolo endocitico e fuga verso il citoplasma della cellula ospite. Recenti studi applicando fluorescenza resonance energy transfer (FRET) basato su metodi per tenere traccia delle interazioni ospite-patogeno hanno fornito approfondimenti sul processo di infezione batterica a livello di singola cellula. In precedenza abbiamo segnalato che la fuga vacuolar di batteri invasivi nel citosol cellulare host pu&ograve; essere rintracciata da microscopia di fluorescenza usando un dosaggio di reporter FRET CCF4/&beta;-lattamasi. Qui, ci mostra che il nostro test di rottura vacuolar anche pu&ograve; essere analizzato mediante citometria a flusso, che costituiscono un&#39;importante alternativa per acquisizione dati da microscopia. Considerando che l&#39;analisi del nostro test da microscopia di fluorescenza offre una precisa risoluzione spatiotemporal, analisi di citometria a flusso rappresenta un metodo di alto-rendimento che permette la quantificazione efficiente e veloce di un gran numero di eventi e pu&ograve; migliorare ulteriormente la ricerca futura sulla fuga vacuolare.

Monitoraggio Shigella flexneri vacuolar fuga tramite flusso cytometry.

Antigen (Ag) crosspresentation by dendritic cells (DCs) involves the presentation of internalized Ags on MHC class I molecules to initiate CD8+ T cell-mediated immunity in response to certain pathogens and tumor cells. Here, we identify the SNARE Sec22b as a specific regulator of Ag crosspresentation. Sec22b localizes to the ER-Golgi intermediate compartment (ERGIC) and pairs to the plasma membrane SNARE syntaxin 4, which is present in phagosomes (Phgs). Depletion of Sec22b inhibits the recruitment of ER-resident proteins to Phgs and to the vacuole containing the Toxoplasma gondii parasite. In Sec22b-deficient DCs, crosspresentation is compromised after Ag phagocytosis or endocytosis and after invasion by T. gondii. Sec22b silencing inhibited Ag export to the cytosol and increased phagosomal degradation by accelerating lysosomal recruitment. Our findings provide insight into an intracellular traffic pathway required for crosspresentation and show that Sec22b-dependent recruitment of ER proteins to Phgs critically influences phagosomal functions in DCs.

Sec22b regulates phagosomal maturation and antigen crosspresentation by dendritic cells.

Crosspresentation (Ag) de l&#39;antig&egrave;ne par les cellules dendritiques (CD) implique la pr&eacute;sentation de l&#39;Ags int&eacute;rioris&eacute;e sur MHC classe I mol&eacute;cules d&#39;initier des CD8 + immunit&eacute; &agrave; m&eacute;diation cellulaire T en r&eacute;ponse &agrave; certains agents pathog&egrave;nes et les cellules tumorales. Ici, nous identifions le SNARE Sec22b r&eacute;gulateur sp&eacute;cifique des Ag crosspresentation. Sec22b se localise le compartiment interm&eacute;diaire de ER-Golgi (ERGIC) et les paires &agrave; la membrane plasmique SNARE syntaxine 4, qui est pr&eacute;sente dans les phagosomes (Phgs). Appauvrissement de la couche de Sec22b inhibe le recrutement des prot&eacute;ines ER r&eacute;sidant &agrave; Phgs et &agrave; la vacuole contenant le parasite Toxoplasma gondii. Dans DCs Sec22b d&eacute;ficient, crosspresentation est compromise apr&egrave;s la phagocytose Ag ou endocytose et apr&egrave;s l&#39;invasion de T. gondii. Sec22b silence inhib&eacute; exportation Ag au cytosol et augmentation de la d&eacute;gradation phagosome en acc&eacute;l&eacute;rant le recrutement lysosomal. Nos r&eacute;sultats fournissent une voie de circulation intracellulaire requise pour crosspresentation et montrent que le recrutement Sec22b d&eacute;pendant des prot&eacute;ines ER &agrave; Phgs influence critique fonctions phagosome dans DCs.

Sec22b r&eacute;glemente la maturation phagosome et crosspresentation de l&#39;antig&egrave;ne par les cellules dendritiques.

Antigene (Ag) crosspresentation da cellule dendritiche (DCs) comporta la presentazione di Ags interiorizzata su MHC classe I molecole di avviare CD8 + immunit&agrave; mediata da cellule T in risposta a determinati agenti patogeni e cellule tumorali. Qui, ci identifichiamo il rullante Sec22b come un regolatore specifico della crosspresentation Ag. Sec22b si localizza al vano intermedio ER-Golgi (ERGIC) e coppie per la membrana plasmatica SNARE Sintaxina 4, che &egrave; presente in phagosomes (Phgs). Deplezione di Sec22b inibisce l&#39;assunzione di proteine ER-residente di Phgs e il vacuolo contenente il parassita Toxoplasma gondii. Nel sistema DCs Sec22b-carenti, crosspresentation &egrave; compromessa dopo fagocitosi Ag o endocitosi e dopo l&#39;invasione di T. gondii. Sec22b silenziamento inibito esportazione Ag al citosol e aumentata degradazione phagosomal accelerando il reclutamento lisosomiale. I nostri risultati forniscono informazioni in un percorso di traffico intracellulare necessario per crosspresentation e visualizza che reclutamento Sec22b-dipendente delle proteine ER a Phgs influenze criticamente le funzioni phagosomal in DCs.

Sec22b regola la maturazione phagosomal e crosspresentation dell&#39;antigene dalle cellule dendritiche.

Survival within macrophages is a central feature of Mycobacterium tuberculosis pathogenesis. Despite significant advances in identifying new immunological parameters associated with mycobacterial disease, some basic questions on the intracellular fate of the causative agent of human tuberculosis in antigen-presenting cells are still under debate. To get novel insights into this matter, we used a single-cell fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based method to investigate the potential cytosolic access of M. tuberculosis and the resulting cellular consequences in an unbiased, quantitative way. Analysis of thousands of THP-1 macrophages infected with selected wild-type or mutant strains of the M. tuberculosis complex unambiguously showed that M. tuberculosis induced a change in the FRET signal after 3 to 4 days of infection, indicating phagolysosomal rupture and cytosolic access. These effects were not seen for the strains M. tuberculosisÎ”RD1 or BCG, both lacking the ESX-1 secreted protein ESAT-6, which reportedly shows membrane-lysing properties. Complementation of these strains with the ESX-1 secretion system of M. tuberculosis restored the ability to cause phagolysosomal rupture. In addition, control experiments with the fish pathogen Mycobacterium marinum showed phagolysosomal translocation only for ESX-1 intact strains, further validating our experimental approach. Most importantly, for M. tuberculosis as well as for M. marinum we observed that phagolysosomal rupture was followed by necrotic cell death of the infected macrophages, whereas ESX-1 deletion- or truncation-mutants that remained enclosed within phagolysosomal compartments did not induce such cytotoxicity. Hence, we provide a novel mechanism how ESX-1 competent, virulent M. tuberculosis and M. marinum strains induce host cell death and thereby escape innate host defenses and favor their spread to new cells. In this respect, our results also open new research directions in relation with the extracellular localization of M. tuberculosis inside necrotic lesions that can now be tackled from a completely new perspective.

Phagosomal rupture by Mycobacterium tuberculosis results in toxicity and host cell death.

Survie dans les macrophages est un &eacute;l&eacute;ment central de la pathog&eacute;n&egrave;se de Mycobacterium tuberculosis. Malgr&eacute; les avanc&eacute;es significatives dans l&#39;identification de nouveaux param&egrave;tres immunologiques associ&eacute;es maladie mycobact&eacute;rienne, certains basic interroge sur le sort intracellulaire de l&#39;agent causal de la tuberculose humaine dans pr&eacute;sentatrices d&#39;antig&egrave;ne des cellules sont encore en cours de d&eacute;bat. Pour obtenir de nouveaux aper&ccedil;us de cette question, nous avons utilis&eacute; un transfert d&#39;&eacute;nergie de fluorescence unicellulaires r&eacute;sonance (FRET)-base de m&eacute;thode pour &eacute;tudier l&#39;acc&egrave;s potentiel cytosolique de M. tuberculosis et les cons&eacute;quences cellulaires d&#39;une mani&egrave;re impartiale, quantitative. Analyse de milliers de macrophages THP-1 infect&eacute;s par des souches s&eacute;lectionn&eacute;es sauvage ou mutants du complexe M. tuberculosis montr&eacute; sans ambigu&iuml;t&eacute; que M. tuberculosis induit un changement dans le signal de la frette apr&egrave;s 3 &agrave; 4 jours de l&#39;infection, indiquant la rupture phagolysosomal et acc&egrave;s cytosolique. Ces effets n&#39;&eacute;taient pas vu pour les souches M. tuberculosis&Delta;RD1 ou BCG, les deux manquent de la prot&eacute;ine s&eacute;cr&eacute;t&eacute;e de ESX-1 ESAT-6, qui aurait &eacute;t&eacute; pr&eacute;sente des propri&eacute;t&eacute;s de membrane-lyse. Compl&eacute;mentation de ces souches avec le syst&egrave;me de s&eacute;cr&eacute;tion de ESX-1 de M. tuberculosis restaur&eacute; la capacit&eacute; &agrave; provoquer la rupture de la phagolysosomal. En outre, des exp&eacute;riences de contr&ocirc;le avec le poisson pathog&egrave;ne Mycobacterium marinum a montr&eacute; phagolysosomal translocation uniquement pour les souches intactes ESX-1, plus valider notre approche exp&eacute;rimentale. Plus important encore, pour M. tuberculosis aussi bien en ce qui concerne M. marinum nous avons observ&eacute; que phagolysosomal rupture a &eacute;t&eacute; suivie de la mort des cellules n&eacute;crotiques des macrophages infect&eacute;s, tandis que ESX-1 - ou troncature-mutants de d&eacute;l&eacute;tion qui sont rest&eacute;s ferm&eacute;s dans les compartiments de phagolysosomal n&#39;a pas provoqu&eacute; cette cytotoxicit&eacute;. Par cons&eacute;quent, nous fournissent un m&eacute;canisme de roman comment ESX-1 comp&eacute;tente, particuli&egrave;rement virulente, M. tuberculosis et souches de M. marinum induisent la mort des cellules h&ocirc;tes et ainsi &eacute;chapper les d&eacute;fenses inn&eacute;es de l&#39;h&ocirc;te et favoriser leur propagation de nouvelles cellules. &Agrave; cet &eacute;gard, nos r&eacute;sultats &eacute;galement ouvrent des nouvelles orientations de recherche en relation avec la localisation extracellulaire de M. tuberculosis &agrave; l&#39;int&eacute;rieur des l&eacute;sions n&eacute;crotiques qui peuvent maintenant &ecirc;tre abord&eacute;es dans une perspective compl&egrave;tement nouvelle.

Phagosome rupture par Mycobacterium tuberculosis entra&icirc;ne la mort cellulaire de toxicit&eacute; et h&ocirc;te.

Sopravvivenza all&#39;interno dei macrofagi &egrave; una caratteristica centrale della patogenesi di Mycobacterium tuberculosis. Nonostante i significativi progressi nell&#39;individuazione di nuovi parametri immunologici associati a malattie micobatteriche, alcuni semplici domande sul destino dell&#39;agente eziologico della tubercolosi umana in presentanti l&#39;antigene intracellulare delle cellule sono ancora in discussione. Per ottenere nuovi approfondimenti in questa materia, abbiamo utilizzato un trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza a cella singola (FRET)-basato su metodo per indagare il potenziale accesso citosolico di M. tuberculosis e le conseguenze di cellulare risultante in modo imparziale, quantitativo. Analisi di migliaia di THP-1 macrofagi infettati con ceppi selezionati di wild-type o mutanti del complesso M. tuberculosis senza ambiguit&agrave; ha mostrato che il M. tuberculosis indotta da un cambiamento nel segnale FRET dopo 3-4 giorni di infezione, che indica la rottura di phagolysosomal e accesso citosolico. Questi effetti non sono stati visti per i ceppi M. tuberculosis&Delta;RD1 o BCG, entrambi manca l&#39;ESX-1 secreto proteine ESAT-6, che secondo come riferito Mostra propriet&agrave; di membrana di lisi. Complementazione di questi ceppi con il sistema di secrezione ESX-1 di M. tuberculosis ripristinato la capacit&agrave; di provocare la rottura di phagolysosomal. Inoltre, esperimenti di controllo con il pesce patogeno Mycobacterium marinum ha mostrato una traslocazione phagolysosomal solo per ESX-1 ceppi intatti, convalida ulteriormente il nostro approccio sperimentale. La cosa pi&ugrave; importante per M. tuberculosis come pure per quanto riguarda M. marinum abbiamo osservato che la rottura di phagolysosomal &egrave; stata seguita da morte necrotica delle cellule dei macrofagi infetti, considerando che ESX-1 eliminazione - o troncamento-mutanti che &egrave; rimasto chiuso all&#39;interno di compartimenti phagolysosomal non ha indotto tale citotossicit&agrave;. Quindi, ci forniscono un meccanismo romanzo come ESX-1 competente, virulenta di M. tuberculosis e M. marinum ceppi inducono morte della cellula ospite e quindi sfuggire le difese innate host e favorire la diffusione di nuove cellule. A questo proposito, i nostri risultati anche aprire nuove direzioni di ricerca in relazione con la localizzazione extracellulare di M. tuberculosis all&#39;interno di lesioni necrotiche che pu&ograve; ora essere affrontato da una prospettiva completamente nuova.

Alexandre Bobard

Dynamique des Interactions Hôte Pathogène

Institut Pasteur, Paris, France

Single Cell Measurements of Vacuolar Rupture Caused by Intracellular Pathogens

Alexandre Bobard

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Institut Pasteur, Paris, France

Single Cell Measurements of Vacuolar Rupture Caused by Intracellular Pathogens

Dynamique des Interactions Hôte Pathogène