ヒト皮質組織におけるAβ多量体のSDS-PAGE/Immunoblotの検出は、抗原エピトープの検索を使用してホモジネート

要約

我々は明らかに人間の皮質ホモジネート、SDS - PAGEによるタンパク質の分離、抗原の検索とAβペプチドに対する抗体でイムノブロットを調製するためのテクニックを説明します。このプロトコルを使用して、我々は一貫してアルツハイマー病の病理と人間からの皮質組織で単量体と多量体Aβを検出する。

要約

β-アミロイドの異常折り畳み及び重合（Aβ）ペプチドは、アルツハイマー病の発症の神経変性カスケードを開始すると考えられている

プロトコル

パート1：明確に組織ホモジネートの調製

1. 約30にも乳棒ストローク（すなわち400μlのバッファを追加すると - （プラス2倍プロテアーゼ阻害剤カクテル[サンタクルス] [およびMg + + -遊離Ca + +] 0.1Mリン酸緩衝生理食塩水）の氷冷緩衝液の4倍のボリュームで固定されていない皮質組織をホモジナイズダウンス100mgの組織への）。
2. 3000グラム（4℃）で5分間ホモジェネートを回転させる。慎重に-80明確上澄み液と、これらの抽出物のストアアリコートを削除° Cを使用するまで。
3. メーカーの指示（ThermoFisher）によると、ビシンコニン酸（BCA）アッセイを用いて明らかにホモジネートの総タンパク質濃度（μg/μl）を決定します。

パート2：SDS - PAGEのサンプル調製

1. よく10、10から20パーセントトリシンゲル（Invitrogen）を用いて、ウェル毎にロードできる最大量は、〜25μlのです。総体積が2倍のSDSサンプルバッファーと10倍還元剤を含む、ウェル当たり読み込むことができる明確ホモジネートの最大量は10μlのですので。明らかに20％（w / v）の皮質ホモジネートは、ウェルあたり50μgの総蛋白質を考慮し、5μg/μLのより大きいの総タンパク質濃度を持つ必要があります。 5mg/mlのタンパク質より少ないサンプルでは、​​ウェルあたり少なく総タンパク質をロードする必要となります。しかし、高タンパク質レベルは、単量体および凝集したAβ（50 -60μgの総タンパク質が最適である）の検出に最適です。
   常にウェルあたりの総タンパク質の同量をロードする。
2. それぞれのゲルのため、負荷などSeeBlue Plus2（Invitrogen社）などの分子量マーカーの10μlを持つだけでなく少なくとも一つ。ポジティブコントロールとして、合成Aβ40または別の同様のAβ42ペプチド（1xPBSで希釈）を10 - 100ngを実行します。
3. たての融解、明らかホモジネートを用いて、氷上で反応混合物を準備します。 5〜10秒間ボルテックスチューブ、100℃、乾燥槽内の熱℃で5分間、その後すぐにキャップで結露を除去するためにすべてのサンプルをスピン。

パート3：SDS - PAGEゲル電気泳動

1. 、メーカーの指示（Invitrogen社）によると、トリシンSDSランニングバッファーを用いて、X細胞確かにロックミニセルGelboxで10〜20％トリシンゲル上にボルテックスのサンプルをロードする
2. 約90分間125Vの定電圧で泳動する。 4KDaマーカーのバンドがゲルの下端から約1cmになるまでのサンプルが実行してみましょう。

パート4：ゲルから膜への転送タンパク質

1. 慎重にメーカーの指示（Invitrogen社）によると、プラスチックケースからゲルを取り出して、X細胞IIブロットモジュール内部の転送サンドイッチを組み立てる。トリス - グリシントランスファーバッファー（20％メタノール）によるプリウェットブロッティングパッドおよび0.2μmのニトロセルロース膜、およびパッドまたはろ紙/メンブレンサンドイッチをブロッティングから気泡を取り除く。
2. X細胞Gelboxでは、転送バッファで、内部チャンバーを記入し、DIH ₂ O（メタノールへの暴露が時間をかけてプラスチックgelboxを身に着けることができる）と外室を埋める。
3. 25mAの一定のアンペア数で2-3時間の転送を実行します。
4. 転送が完了したら、サンドイッチを分解すると、両方の正方形のプラスチックペトリ皿で1xPBS、（または他の適当な容器）にDIH ₂ Oと膜にゲルを置く。
5. タンパク質の転送の効率を可視化するために、ゲルは単にブルーSafeStain（インビトロジェン社）で染色することができ、ポンソーSレッド染色（シグマアルドリッチ）を有する膜、両方の製造元の指示に従って。この染色は、免疫ブロット法に干渉することはありません。染色は、非効率的なタンパク質の転送があることが判明した場合は、手順3で転送時間を変更します。

第5部。抗原エピトープの検索＆イムノ

1. 抗原賦活化は、免疫ブロット中に抗体の結合のための膜にAβエピトープを明らかにする重要なステップです。どんな蒸し器、電子レンジ、または100の温度を一定に維持° Cで十分です水浴。蒸し器での抗原の検索の場合は、室温で、1xPBSで満たされたヘビーデューティKapakのプラスチック袋の膜を熱融着させる。あらかじめ温めておいた蒸し器のフラットポーチを置く、ポーチは、さらに15分間インキュベート、拡大して始まると。膜が過度のしわを防ぐため、袋から取り出す前に、ゆっくりと冷却してください。
2. 室温で、慎重に蒸し袋からメンブレンを取り出し、5分（0.05％のTween - 20で生理食塩水、pH8.0のをTris緩衝TBS - Tで洗浄、続い1xPBSで5分間メンブレンを、すすぎ[シグマ] ）、オービタルシェーカー上で。揺れ、一時間ブロッキング溶液で膜（TBS - Tで2.5％脱脂乳）をインキュベートする。洗浄せずに、泡を避け、（1:1,000で6E10 [1μg/mlの] 5,000 [0.2μg/ml]希釈、Covance）ブロッキング溶液で希釈した一次抗体を含んでいる皿やプラスチック製の袋に膜を転送S.一時間してから、4℃で振盪24〜48時間室温でオービタルシェーカー上でインキュベートする（より長いインキュベーションがより良好な信号を与えるかもしれない）。
3. TBS - Tで30分間メンブレンをリンス（ワンクイック3 × 10分のリンスに続いてリンス）。
4. 室温でシェーカー上で90分間ブロッキング溶液に1:10,000に希釈したHRP -標識二次抗体のメンブレン（Amersham ECLヒツジ抗マウス、GE Healthcare）を、、インキュベートする。
5. TBS - Tで30分間メンブレンをリンス（ワンクイック3 × 10分のリンスに続いてリンス）。
6. シェーカー上で、プラスチックシートプロテクターの間に、糸くずのろ紙上に余分な試薬をオフブロットおよびフィルムカセットにメンブレンを置き、5分間たてのSuperSignalウエストのピコの電気化学発光試薬（ThermoFisher）で膜をインキュベートする。ダストフリーキムワイプ、必要に応じて追加のSuperSignal試薬をオフに汚点。
7. 最大30分30秒の間隔でコダックバイオマックスMRフィルムに感光させるとフィルムの開発者で開発する。 5分後、Aβモノマーのバンドは、おそらく飽和状態になることがあります。
8. 膜は、室温で30分間の復元プラスストリッピングバッファーで振盪することによって（TBS - Tで洗浄後に）取り除かれ、必要に応じて追加の抗体で再プローブすることができます。

パート6：代表イムノブロット：

図1a - C。7ヒト被験者から50μgの総タンパク質を含む清澄ホモジネートは、多量体AβとAPPの存在について分析されています。抗体6E10でイムノブロッティングするAβモノマー、ダイマー、トリマー、テトラマー、およびすべてのアルツハイマー病のケースでAPP（上部バンド）、同様に2段のAD症例の豊富な高い分子量のAβの多量体を明らかにする。合成Aβ40は、低分子量のバンドのアイデンティティを確認する。 AD：アルツハイマー病、DLB：レビー小体型、NDと認知症：ヒトNondemented（）30分のフィルム露光、（b）に 5分間のフィルム露光、（C）30秒のフィルム露光。

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ディスカッション

アルツハイマー病^1,4,5の病因におけるAβ凝集の重要性にもかかわらず、いくつかの研究ではヒト皮質組織試料²に、多様なAβ多量体の分布を説明したり、定量化している。一般的に使用される免疫組織化学法は、固定皮質組織内で個別の多量Aβの種の識別のために許可されていません。固定されていない皮質組織ホモジネートでは、Aβ多量体を分離し、生化学的にゲル電気泳動...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	Sc-29130	1 tablet in 25ml buffer
BCA Protein Assay kit	Thermo Fisher Scientific, Inc.	23225
XCell SureLock Mini-Cell and XCell II Blot Module Kit CE Mark	Invitrogen	EI0002
Novex Tricine SDS Sample Buffer (2X)	Invitrogen	LC1676
NuPAGE Sample Reducing Agent (10X)	Invitrogen	NP0004
SeeBlue Plus2 Pre-Stained Standard	Invitrogen	LC5925
Novex 10-20% Tricine Gel 1.0 mm, 10 well	Invitrogen	EC6625BOX
Nitrocellulose membranes, 0.2 μm pore size	Invitrogen	LC2000
Novex Tricine SDS Running Buffer (10X)	Invitrogen	LC1675
Novex Tris-Glycine Transfer Buffer (25X)	Invitrogen	LC3675
SimplyBlue SafeStain	Invitrogen	LC6060	Will not interfere with immunostaining
ATX Ponceau S Red staining solution	Sigma-Aldrich	09276	Will not interfere with immunostaining
Kapak heat sealable plastic sample pouches	Fisher Scientific	0181225AA
6E10 mouse monoclonal antibody to Aβ(1-16)	Covance	SIG-39320	Dilute 1:1,000 up to 1:5,000 for WB
Tween 20	Sigma-Aldrich	P2287
ECL Mouse IgG, HRP-Linked Whole Aβ (from sheep)	GE Healthcare	NA931-1ML	Dilute at 1:10,000
SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate	Thermo Fisher Scientific, Inc.	34077
Kodak Biomax MR Film	Carestream Health	870 1302