どのように文化、レコードとマイクロ電極アレイで神経ネットワークを刺激する（多国間環境協定）へ

要約

このプロトコルは、セットアップの世話から、記録と電気的に多国間での文化を刺激するために必要な情報を提供します。試験管内でネットワークは、脳機能と機能障害のより良い理解につながるネットワークと細胞レベルでの生理学的に関連する質問をするための手段を提供します。

要約

最後の世紀のために、世界中の多くの神経科学者は神経回路網がどのように働くかを理解するために命を捧げていると、なぜ彼らは様々な疾患に動作しなくなるものがあります。研究は、神経病理学的観察、遺伝標識と蛍光顕微鏡、および解離神経細胞やスライス標本の両方で細胞内記録を含めました。このプロトコルは、マイクロ電極アレイ（マルチ電極アレイも呼ばれ、MEAの）上に成長解離ニューロン培養を伴う別の技術を、説明します。

他の技術よりもこのシステムを使用する複数の利点があります。多国間環境協定上の解離ニューロン培養では、ネットワークアクティビティがアレイの複数の電極を介して電気刺激シーケンスで操作可能な単純化したモデルを提供しています。ネットワークが小規模であるため、刺激の影響はそのまま調剤の場合ではない、観測可能な領域に制限されています。細胞は様々なイメージング技術を使用して監視する形態の変化が容易に単層に成長する。最後に、多国間環境協定上の文化は他の培養技術に固有の任意の明確な時間の制限を削除するin vitroで一年以上生き延びることができる^1。

世界中の私たちの研究室や他の人は神経回路網に関する重要な質問をするこの技術を利用しています。このプロトコルの目的は、世話、セットアップから録音すると電気的に多国間での文化を刺激するために必要な情報を提供することです。ネットワークで生理学的に関連する質問をするとのより良い理解につながる細胞レベルのための手段を提供するin vitroでのネットワークでは脳機能と機能不全。

プロトコル

A.はじめに

人間の脳のニューロンの十億があります。これらのニューロンのそれぞれは、多くの異なる細胞で数百数千の接続にしばしば時間を持つことができます。これらの接続は、私たちは、歩いてピアノを弾く、自転車に乗る、笑う、泣く、と覚えてできるように信号を抱く。最後の世紀のために、世界中の多くの神経科学者は神経回路網がどのように働くかを理解するために命を捧げていると、なぜ彼らは様々な疾患に動作しなくなるものがあります。

この一見克服できない課題で撮るときにひとつのプログラムが使用できるツールは数多くあります。初期の研究は、神経回路が、人間と他の動物の脳でどのように構成されるかの神経病理学的観察に焦点を当てていた。蛍光顕微鏡と遺伝標識の出現は、タンパク質やDNAレベルに細胞組成を探索し、これらの構造研究の範囲を拡大。

しかし、これらの実験では、唯一の静的な配列を脳の動的な機能に対応していませんでした。進行中の神経活動を理解するために、人気の高い技術は、一般的に細胞内記録と電気生理学的活性を調べることに焦点を当てる。解離文化の単一のニューロンは有用な還元主義のモデルを提供する、しかし、この手法は、単一細胞から記録するための短い時間間隔によって制限されます。また、このモデルでは、ネットワーク内の他のセルについての限られた情報を提供します。げっ歯類からの脳切片は、皮質構造が維持されている現実的なモデルの多くを提供しています。しかし、このようなスライスは、培養した場合でも、限られた寿命を持ち、細胞構築^2を保持したまま存続させるには技術的に挑戦することができます。

別の技術は、マイクロ電極アレイ（マルチ電極アレイ、MEAのと呼ばれる）上に成長解離ニューロン培養を行います。ニューロンは、皿の底に埋め込まれた微小電極を有するMEAの上にプレーティングされています。三週間の経過とともに、これらの文化は、軸索、樹状突起と数百いない場合はシナプス結合数千人の完全なニューロンのネットワークを形成する。他の技術よりもこのシステムを使用する複数の利点があります。多国間環境協定上の解離ニューロン培養のどちらで動作するように単純化したモデルを（単一の皮質カラムの順番ではなく、そのまま脳に）を提供。細胞は様々なイメージング技術を使用して監視する形態の変化が容易に単層に成長する。ネットワークアクティビティは、配列の複数の電極を介して電気刺激の配列で操作することができます。ネットワークが小規模であるため、刺激の影響はそのまま調剤の場合ではない、観測可能な領域に制限されています。最後に、多国間環境協定上の文化は他の培養技術に固有の任意の明確な時間の制限を削除するin vitroで一年以上生き延びることができる^。1したがって、MEAの上の文化は、神経接続性を研究するための理想的なモデルを表しています。

世界中の私たちの研究室や他の人は神経回路網に関する重要な質問をするこの技術を利用しています。このモデルで研究されている現在の神経突起は、ネットワークのダイナミクス、開発、学習と記憶、シナプス可塑性、興奮、虚血や神経変性などがあります。これらの研究3 ^から 10までの知見は、先天性奇形のような人間の病気、てんかんのためにより良い治療法を確立するために重要な影響を与える可能性が、脳卒中とアルツハイマー病。このプロトコルの目的は、からの録音と多国間環境協定上の文化を刺激する、の世話、セットアップするために必要な情報を提供することです。究極の目標は、研究者が私たちの神経細胞とそれらがどのように通信に影響を及ぼす疾患の治療、最終的には、おそらく脳の機能と機能障害のより良い理解につながる可能性があります携帯電話とネットワークレベルでの生理学的に関連する質問がある場合はするための手段を提供することです。

次のプロトコルから記録し、マイクロ電極アレイで神経ネットワークを刺激し、培養の研究室から10年以上の経験を表します。長く健康な神経回路網の存続の開発につながるとして、各ステップは、その最適化されています。いくつかの最適な設定は、我々は経験的に決定しながら使用可能な場合の参照が用意されています。前のプロトコルを開始するために、機器および消耗品を入手し、タイトルのセクションに記載されているソリューションを準備"材料。" "脳の解剖"のセクションでは、簡単に説明がありますが、このトピック^11を覆う可視化実験の記事の他の研究として、付属のビデオで示されません。

B.脳解剖

1. 全体の脳は、胎生18日（E18）ラットから抽出されます。時限妊娠雌ラットでは吸入イソフルランと首を切らで麻酔する。胚は、国立研究評議会のGUIDに基づいて削除され、解剖されていますエモリー大学IACUCによって承認されたプロトコルを使用して実験動物の管理と使用のためのe。
2. 無菌技術を活用しながら、胎児の脳は削除および100mm滅菌シャーレに冷たいハンクス平衡塩溶液（HBSS）に配置されます。解剖のプロトコルの残りの部分は、汚染のリスクを最小限に抑えるために層流フードの解剖顕微鏡下で発生します。
3. ラットの脳を解剖するためのHBSSで2滅菌ペトリ皿に一つずつ転送されます。 HBSSに潜水したまま、脳幹、視床と小脳が切り取っていると半球が二分されています。
4. 嗅結節を穏やかに髄膜を除去しながら、半球を保護するためのハンドルとして利用されている。
5. 通常、複数の胚が存在するので、皮質が、基本となる海馬と線条体から剥離し、氷の上で休止状態の溶液中での滅菌15 mlコニカルチューブに保存されている^。12です 、この手順は、被めっき多国間環境協定の目的の数に応じて繰り返されますと所望の細胞密度。皮質は、後述するように細胞解離のプロセスに結合されます。皮質は4℃で保存することができる°〜細胞の生存の唯一の損失を最小限に抑えて解離の24時間前には、Hibernateの溶液中でC。社内で切除した組織を利用する別の方法として、解剖脳組織は、脳のビット（から購入することができますwww.brainbitsllc.com ）。

C. MEAの準備と皮質解離

1. 多国間環境協定は、ALAサイエンティフィック（から取得されますwww.alascience.com ）、製造業者のためのベンダー、マルチチャンネルシステム。電極の向きや間隔、ガラスのリングの内部の接地電極、有無の有無、およびガラスのリングの大きさの変化と多国間環境協定には、いくつかの異なる構成があります。私たちの基本的な実験のために我々は、小さなガラスのリングで8グリッドの配置により、8で60の電極を含む標準のマイクロ電極アレイを使用してください。窒化チタン電極の直径は30μmであり、電極の中心間距離は200μmである。一方の電極はグランドまたは内部参照電極として大きいと機能です。 MEAを取り扱う際には、電極を損傷する可能性がない固体のオブジェクト（例えば、ピペットチップ、ティッシュペーパー、またはゴムの警察官が）今までこのように皿の内側に触れていないことが極めて重要です。多国間環境協定と処理についてのより詳細な情報は、MEAのユーザマニュアル（記載されてwww.multichannelsystems.com /製品- MEA /微小電極- arrays.html ）。
2. 前の細胞調製の夕方に、多国間環境協定は、脱イオン水ですすぎ、その後15分間70％エタノールに浸漬することが許可されます。料理は、一晩でUV光を層流フード内に配置されています。処理の目的のために、それぞれのMEAは、日付とペトリ皿に置かれたラベル付き準拠の100 mm滅菌ポリスチレンシャーレに配置されます。ノートの、90で水をオートクレーブし、活用を含め他の滅菌技術℃のMEAのユーザーマニュアルに記載されている。しかし、我々は経験的にオートクレーブ滅菌がMEAが使用できる回数を減らすように見えることを発見した。あなたが現在の文化を持つMEAを再利用している場合は、有機物が除去されている必要があります。 PBS中0.25％トリプシンの300から400μlを20分間35から37℃でMEAにインキュベートする。 MEAは、脱イオン水で洗浄し、光学顕微鏡で検査されます。携帯電話の問題が依然として残っている場合には、トリプシンのステップはきれいになるまで繰り返されます。料理がきれいであれば、上記のような滅菌工程に進みます。一般的には、多国間環境協定は、適切なケアを使用して複数回再利用することができます。
3. また、プレーティング前の夕方に、MEAの蓋を用意し、オートクレーブされています。蓋はカスタムメイドであるだけでなく、ALA - Scientificから購入することができます。これらは、ポリテトラフルオロエチレンテフロン製で、透明な膜（フッ素化エチレン - プロピレンテフロン）トップまたがっを持っています。膜は、ガスの拡散を使用できますが、実質的に加湿雰囲気の必要性を排除し、蒸発し、高浸透の有害な影響を防止することにより、水の拡散を制限する^1。
4. 上記の解剖が完了すると、MEAの準備が各MEAの中心にポリエチレンイミン（PEI）溶液100μlを配置することで継続される。我々の手で^13は 、PEIのソリューションは、ポリリジン使用するよりも、MEAのセルの少ないクラスタリングを提供します。皿は軽く蒸発を防ぐために多国間で休む蓋つきの30分間層流フード中で室温で静置されている。念のため、オープンMEAまたは脳組織ですべての作業は、miniに標準的な細胞培養の層流フード内で起こるべきであり汚染のリスクを抑えることができます。
5. MEAは、その後、滅菌脱イオン水1〜2 mLで3回リンスする。理想的な層流フードのセットアップは、皿から液体を除去するための吸引器の装置が含まれます。滅菌200μlのピペットチップは、アスピレータチューブに取り付けることができます。これは、電極に損傷を与えることができるように吸引しながら、MEAの表面に触れないでください。すすぎの最終の後に、MEAは、層流フードで少なくとも30分間乾燥させる。
6. この乾燥期間中に、神経細胞の解離過程を15 mlの滅菌コニカルプラスチックバイアルのパパイン溶液2mlに皮質を置くことによって開始されます。DNアーゼの^1〜50μlの混合物に追加されます。バイアルは35〜37℃の水浴に入れ、約20分間インキュベートする。ゆっくりと泡を導入しないように注意しながら混合するためのソリューションを5分ごとにタップします。皮質は、消化が進むにつれてあいまい外観を取るを開始する必要があります。
7. パパイン溶液を慎重に15ミリリットルコニカルバイアルに皮質を残してピペッティングにより除去される。細胞の培地2mlを、野に加え,2 - 3分間インキュベートさせた後、静かに削除されます。これはまた、培地中の血清によって阻害される任意の残留パパインを、洗い流すためです。細胞培地の別の2ミリリットルを皮質に追加され、このサンプルは、5〜10秒間高速でボルテックスしています。 15ミリリットルコニカルバイアルの底に濁った溶液とせず、残りの脳の部分があるはずです。また、3倍で培地1mlと粉砕がP - 1000ハンドヘルドピペットを使用して、組織を解離するために利用することができる。適切な粉砕の^1は 、各ピペットのストロークが1秒を取るべきである。
8. 次いで、この溶液を重力を介して滅菌40μmのセルストレーナーを通して穏やかに渡すことが許可されます。徐々にP - 1000とストレーナーに一度に細胞溶液を一滴を追加。 35ミリメートル滅菌ペトリ皿は、緊張した細胞溶液を収集するために利用されている。
9. 細胞懸濁液を15 mlコニカルバイアルに戻って転送され、細胞の培地を4.0 mlの最終容量に追加されます^。14
10. 500 5％（w / v）のBSA溶液の添加後、慎重にP - 1000と15ミリリットルコニカルバイアルの底部に重ね合わせている^。14これは、バイアルの細胞含有溶液の上方に変位さ。
11. 底のBSAレイヤーと細胞溶液を小さな破片と潜在的に有毒な細胞内のコンテンツを削除するには、200 xgで6分間遠心分離する^。14
12. 細胞の遠心分離のステップの間、多国間環境協定は、視覚的にそれらが完全に乾燥していることを確認するために評価されています。ラミニン溶液20μlを、慎重に、電極のすべてがカバーされることを保証するMEAの中央に配置されます^。1は、それが電極表面の不十分な準備につながることができるので、この溶液中に気泡を導入することは避けてください。 MEAは、完全に乾燥していない場合には、ラミニンの低下が潜在的に十分にめっき電極上の細胞をローカライズすることをより困難に皿全体に行き渡ります。このステップは非常に繊細であり、注目の非定常手または経過と共にMEA表面の損傷につながる可能性を秘めている。
13. テフロンの蓋は、ラミニンの蒸発を防ぐために、この時点で、MEAの上に配置されます。蓋の配置も微妙です。蓋は、MEAが完全に平らな面にあるときに配置または削除する必要があります。そうでなければ、不均一な表面によって加えられる余分な力はそれが使用できなくなる配列のガラスの底を割れる可能性があります。料理は、その後20分間インキュベーターに入れられます。
14. ラミニンは、皿にバインドしている一方で、細胞を含む15 mlコニカルバイアルは、遠心分離機から削除され、層流フードに転送されます。ペレットは、バイアルの底に見えるはずです。上清を注意深く滅菌5ミリリットルのプラスチック血清ピペットで除去する。遠心分離のプロセスが不完全だった場合に上清を保存します。ペレットは、P - 1000または期待利回りに応じて細胞の培地中300から500μlの迅速な渦と粉砕によって優しくどちらかに再懸濁される。細胞懸濁液の10μlを除去し、細胞濃度を決定するために血球計算盤に配置されます。収量が低い場合は、遠心分離のステップが不完全だったかどうかを判断するために顕微鏡下で上清を分析する。リピート遠心分離が必要になる場合があります。収率が高い場合、希釈はより正確なカウントのための必要な場合があります。細胞の播種密​​度は、5,000からMEA約30万セルの範囲で指定できます。メッキのための希望のセル数15〜20μlの最終容量になるように希釈を計算します。我々は一般的にウェルあたり1000から3000の細胞の最終濃度を使用してください。野の1つのペアは、通常、百万円10〜15細胞が得られます。粉砕が利用されている場合、この数値は若干低いかもしれません。
15. この時間によっては、t彼は、MEA上のインキュベーションが完了するはずラミニン。テフロンの蓋は、MEAから削除され、ラミニンのドロップのほとんどは、真空離れて吸引またはピペットで入れる。次に、目的の細胞懸濁液の15〜20μlを直ちにラミニンの残留ウェット領域にピペッティングします。気泡が均一に電極のすべてをカバーするから細胞を防ぐことができるように細胞懸濁液のこの小さな体積に気泡を導入しないように注意してください。蓋を静かに置き換えられ、MEAは慎重に30分間インキュベーターに戻されます。皿は、細胞が付着していることを確認し、電極のすべてをカバーするために光学顕微鏡下で検査されます。電極のすべてがカバーされていない場合は、複数のセルを追加することができ、MEAはこれらの新しい細胞が付着できるようにonに蓋をインキュベーターに戻されます。細胞懸濁液のチューブを静かに座って後に数分以上使用されている場合、それは和解の細胞を再懸濁させる優しく渦にしてください。いったん適切な電極の範囲は、料理をゆっくり暖かいの1ミリリットル（35〜37 ° C）、細胞培地が殺到して、達成されます。テフロンの蓋を交換し、皿をインキュベーターに戻されます。層流フードでは、速やかにテフロンの蓋つき、それらは密閉状態に保つために世話を一度MEA上に小さなラミニン量と細胞懸濁液の量を乾燥させることができる。密閉された多国間環境協定のための理想的なインキュベーターの環境は、35から37で5％CO _{2、9％O 2、65％}の湿度℃です。低酸素圧は、酸化的損傷を減らすこと、長期培養のために重要である¹²の維持65％、湿度はテフロン膜（ない湿度のコントロールに比べて）を通して蒸発を低減し、MEA電子が水の凝縮（などによる損傷することなくインキュベーターで使用することを可能にする飽和に加湿通常のインキュベーター）を持つ。

D.は、多国間環境協定の解離培養用の細胞の培地と思いやりを変更する

1. 細胞播種後の日に、光学顕微鏡下でMEAを点検。培地の色が赤色にまだ桃であると細胞残渣と細胞死の限られた量がある場合は、第1の媒質の変化が別の日に遅らせることができます。しかし、媒体がカラーでより多くのオレンジ色または黄色で表示するために開始および/または細胞残渣と細胞死が大量にあるとされている場合は、培地を変更してください。すべてのメディアの変更は、標準細胞培養層流フード内で発生する必要があります。
2. 第1の媒質の変化は、MEAの蓋を取り外し皿に培地のすべてを離れて吸引し、新鮮な細胞の培地で除去量を交換し、蓋を交換で構成されています。めっき工程から残りの細胞残渣を除去する第1の媒質の変化に細胞培地の全量を交換してください。その後のメディアの変更は、離れて新鮮な培地を使用して削除量に置き換えることによって続いて培地の約半分を吸引してください。これにより、より最適な生育環境を維持する細胞とを維持する細胞の培地中に分泌された成長因子のいくつかをすることができます。蓋の裏側は、培地の変更プロセス中に汚染やふたが破損または緩みの兆しを表示するような場合は、新しいオートクレーブの蓋を利用している場合。細胞の培地は、カスタム変更された蓋付き滅菌容器（ガス交換を可能にするためにテフロン（エチレン - プロピレンフッ素化）膜を持つ）でインキュベーターで保存することができます。細胞の培地はまた、4℃で保存することが変化する培地に前培養器でこれを温めると平衡化できます。
3. 削除して、週二回程度皿に培地の約半分を交換してください。いくつかの細胞の調製物は、より頻繁に変更の必要性を引き起こす培地でより迅速な色の変化につながる可能性があります。培地が黄色であることが明記されている場合は、培地の全体量を変更する。黄色へと急速に移行でも汚染の徴候であるので、感染の視覚的な兆候のために光学顕微鏡下で料理を調べることができます。
4. 実験の条件および無菌操作に応じて、慎重に世話されている文化を1年以上生き延びることができる^1。

多国間環境協定からE.記録

1. 各MEAは59記録電極と1つの内部接地電極を持っています。利用可能ないくつかの商用の録音システムだけでなく、カスタムメイドのバージョンがあります。ベンダーは、マルチチャンネルシステム、タッカーデービステクノロジーズ、アクシオンアプライドバイオシステムズ、アルファメッドサイエンティフィックMED64、Plexon、Ayandaバイオシステムズ社と生物学などがあります。当研究室では現在、マルチチャンネルシステム、NeuroRighter ¹⁵と呼ばれるカスタム設計されたWindowsベースのシステム、およびMeaBench ¹⁶と呼ばれるカスタム設計されたLinuxベースのシステムから商業セットアップを使用しています。これらの各システムは、マルチチャンネルシステムのプリアンプを使用して、多国間環境協定（マルチチャンネルシステム）から記録することができます。タッカーデービステクノロジーズから商業セットアップは、使用されてもです。このプロトコルは、NeuroRighterと多国間環境協定から録音のデモンストレーションを行います。 NEuroRighterソフトウェアはオープンソースとNeuroRighterのGoogleグループのハードウェアデザインと一緒に無料でダウンロード可能です。 （ http://sites.google.com/site/neurorighter/ ）
2. 多国間環境協定上の文化は、活動の定常状態に達するまで2-3週間かかります^。17,18この活動は、（文化を越えシナプス広がる活動電位の集中砲火）破裂自発活動電位および文化全体が含まれています。実験の性質は、しかし、録音の前にin vitroでの日数の理想的な数を決定します。
3. 上記のような神経活動は、温度やpHなど、理想的な環境条件に依存している^。1はその結果、私たちの記録はインキュベーターで行われます。短い実験（<30分）に設計されている場合、理想的なMEAの温度を維持するためのMCSのプリアンプに接続可能な市販の加熱モジュールもあります。
4. 録音を開始するには、MEAは（まだそのシャーレ内）優しくストレージインキュベーターから録音インキュベーターに転送されます。地面に皿と平行の底を保つ。これらは、基板からの文化を切り離すことができるようにMEAや耳障りなMEAとの迅速な動きは避けてください。 MEAは、ペトリ皿から削除され、記録のプリアンプに配置されます。我々は現在、プリアンプのアース電極（MCSのプリアンプのチャンネルCR15）で実証されている皿の内部接地電極と一致している。綿棒は、良好な接続を妨げることが指紋やゴミ等を除去するために70％エタノールで湿らせたティッシュや綿を使用して、MEAの周囲に接触部分を拭いてください。 MEAが正しく装着されていることを確認した後、プリアンプの蓋をし、正しい位置に下げて、ラッチされます。プリアンプの蓋の接点は、MEAの電極のコンタクトパッドにしっかりと休息してください。視覚的に接触アライメントを点検し、必要に応じて綿棒で調整します。インキュベーター中でペルチェ素子の上にプリアンプを置きます。これは、それらの間に挟まれたペルチェ熱ヒートポ​​ンプと二枚の銅板から構成されています。我々は、プリアンプ回路によって生成される熱の一部を削除するには、約5Vで、これを実行する。これは、テフロン膜のふたの内側に形成さから結露を防ぐことができます。任意の結露は、蒸発による、細胞と接触媒質の浸透圧の増加により、文化を害する示すであろう。プリアンプと媒体がインキュベーター空気の温度下に学位または2つである、浸透圧の変化が最小化されていることを保証することにより。
5. NeuroRighterに電源をオンにして、ワークステーション上のソフトウェアを開きます。場所にも適切なソフトウェア/ハードウェア構成でのin vitroにNeuroRighter設定を調整します。ソフトウェア内の電極の数を選択します。バックグラウンドノイズの量を減らすために、デジタルバンドパスフィルタを有効にすることができます。データは、後で解析するために保存する場合は、記録のスイッチを持つデータファイルを選択します。すべての適切な設定が選択されるとスタートボタンをアクティブにします。
6. 画面は、アクティビティやバックグラウンドノイズの実行トレースを表示する必要があります。時折の活動電位と活動の料理幅広いバーストが見えるはずです。期待される活動が可視化されていない場合のMEAから録音のトラブルシューティングに関する以下のセクションでは、いくつかの一般的な問題について説明します。
7. 画面表示は、彼らが3msの時間枠に発生した活動電位が静的に表示されているスパイクの検出モード（"SPKワークフロー管理シス​​テム"タブ）に変更することができます。指定されたチャネルの場合は、実際の細胞外活動電位は約1ms持続させるべきと同じ方向（正または負）で繰り返し起動する必要があります。時折、二つ以上のニューロンは、極性の異なる同一電極上に表示することができます。短い時間のコースと可変極性を持つスパイクはおそらくアーティファクトです。図1は、スパイクのデータのラスタープロットを示しています。
8. 画面のビューは、アクティビティをバーストの起源のローカライズで一見のための局所電場電位（LFPs）に変更することができます。 生体内で録音するとき、単層培養で弱いLFPsを持っているので、このタイプの設定は、より便利です。注目すべきは、いくつかのプリアンプは、（我々はマルチチャンネルシステムから使用するものを含む）より低い周波数のLFPのリズムを減衰する10 Hzのハイパスフィルタを持っている。

多国間環境協定に関するF.刺激神経回路網

1. MEA上の同じ59の記録電極も文化を刺激するために利用することができます。実験の性質は、刺激の程度を決定します。それはオープンソースコードであるためNeuroRighterは、刺激、実験デザインの柔軟性を提供します^。15
2. 文化を刺激するとの課題は、刺激が数ミリ秒続くことができるアーティファクトを作成することです。このアーティファクトは、スパイク検出と曖昧な刺激の応答をトリガーするのに十分な大きさにすることができます。 NeuroRighterは最小限に抑え、場合によっては本質的に刺激のアーチファクトを除去するためのサルパアルゴリズムを利用^。19
3. MEA上の神経ネットワークを刺激する、刺激アーチファクトを制限するために"記録設定"タブの下サルパのアルゴリズムを訓練する。 "オンライン設定"タブでサルパをアクティブにします。ファイル名を選択して、録音を開始する以前のように[スタート]ボタンをクリック。次に、"スティミュラス"タブをクリックしてください。このページに刺激をセットアップするための多くの選択肢があります。
4. 簡単な実験では、一方の電極を刺激し、"オープンループ"のセクションを使用して料理の応答性を監視することです。速度、電圧、位相幅とチャネル番号を選択します。オープンループのセクションにあるスタートボタンを押してください。この刺激への応答は、主な"スパイク"タブと"SPKワークフロー管理シス​​テム"タブを可視化することと、データファイルで分析できます。
5. リアルタイムで、バーストは複数の電極間の0.5Vの一つヘルツの刺激に対する時間 - ロックな方法で視覚化することができます。図2は、後の刺激応答のラスタープロットを示しています。事前の観測では、刺激誘発活動の2つの異なるタイプがあることを実証している：。直接的に誘発活動電位（DAPS）とシナプス誘発活動電位が^（SAPS）20
6. 培養中のニューロンが活動の自発的なバーストを持っている。いくつかの実験では、破裂のこのタイプは、ネットワークのダイナミクスを制御しようとすると干渉する可能性があります。興味深いことに、電極に1〜2 Hzでの分散刺激は、MEA上で神経回路網におけるバースト活性を抑制するために始めることができます^。21

多国間環境協定からG.トラブルシューティングの記録

1. 活動電位やソフトウェアがオンになっているMEAにおける破裂存在しない。
   1. 文化は十分な歳ですか？活動電位は、in vitroでの最初の週の終わりに向かって見えるはずです。バーストは、in vitroで 2〜3週間の周りに発生します。
   2. ハードウェアは電力が供給されている？ NeuroRighterシステムは、電源ハードウェアをするには、2つの6V鉛蓄電池を使用しています。電源スイッチをオンの位置と充電池に入っている必要があります。
   3. 文化は生きていますか？時にはこれは特に理由グリア細胞の増殖の密集や古い文化の中で決定するために挑戦することができます。しかし、人は健康的に現れる神経細胞（位相差顕微鏡下で光沢のある、楕円形の細胞体）と無傷（断片化されていない）細胞プロセスを探すことができます。目に見える汚れや急速に低下させる培地（培地の変化の間に1〜2日後に酸性になる）のための証拠がある場合にも文化に問題がある可能性があります。
   4. 電極インピーダンスとは何ですか？複数の用途にわたって、微小電極やMEAの絶縁​​が低下する可能性があります。 NeuroRighterは、電極のインピーダンスを評価する能力を持っています。1kHzで約¹⁵ノーマルインピーダンスの測定値が10,000〜100,000オームの間の範囲である。より高いインピーダンスは10,000未満オームが漏れやすい絶縁を示唆断線や電極と測定値を示唆している。
   5. ハードボードに接続されているプリアンプはいますか？プリアンプは、ハードウェアボードに接続する出力ケーブルが必要です。プリアンプはまた、また、主要なハードウェアボードに接続し、唯一の刺激のために重要な4つの小さな刺激のボードを持っています。
   6. NeuroRighterソフトウェアの設定が変更されている？ソフトウェアでハードウェアの構成設定は、動作するように記録するための正しい必要があります。更新されたバージョンと複数のユーザー設定の変更をインストールすると、これを引き起こす可能性があります。
   7. MEAは35〜37 ° C時のものです？クーラーの温度は、皮質ネットワークの自発活動の低下につながることができます。 MEAは数秒以上外にインキュベーターのされている場合、記録は気候制御インキュベーター内で発生するので、これは通常問題ではありませんが、一つは温度平衡を許可する必要があります。
   8. 過去数時間で培地中に変更されています？我々は、文化はしばしば授乳後数時間のために発砲停止を観察した。そのため、授乳する前に、実験を行うことがベストです。
2. 過度のバックグラウンドノイズの飽和記録ウィンドウと電極：
   1. MEA十分な上に電極とプリアンプのピンの接触でしょうか？この問題は、プリアンプの蓋、ゴミの小片、培地のドロップ、劣化した電極表面、または蓋から重複する明確な膜上にずれてピンが原因で発生することができます。これらの問題の連絡先を検査すると、その最初のステップです。離れて、クリーニングに必要な培地のドロップがあった場合は特に、70％エタノールに浸した綿棒でピンを調整すると、時々接触を向上させることができます。信号は、エタノールが蒸発するまで悪く見えることがあります。
   2. 電極が破損して表示されますか？光学顕微鏡下で可視化は、時々の案件のこのタイプにつながる亀裂やくぼみ電極の絶縁性を明らかにすることができます。
   3. コンタクトパッドが磨耗したり傷が付いていますか？時々最適化が困難なMEA上に複数の電極の接触があるかもしれません。これは、複数のMEAの用途とめっき後の方が一般的です。金線含浸ゴムのスペーサーは、0.5ミリメートル厚さの方向にのみ行っており、MEAとプリアンプのピンの接触を向上させることができます。この材料は、Fujipolyから入手可能であり、MEAと蓋を合わせてキュートにすることができます。
3. 全体のMEAは、過度のバックグラウンドノイズを示しています。
   1. MEA上に接地電極がプリアンプのグランドピンと連絡を取ることができるようになるように正しい向きでMEAていますか？ MEAは、正しい向きにある場合には地面との接触の問題は（2 AC上記）がない確実にすることも検討することが重要です。チャンネルCR15は、プリアンプのシャーシへの短い線で接地されている？内部30キロオームの抵抗を介して接地するジャンパを使用すると、余分なノイズが発生することがあります。
   2. 周囲が点灯、電源や他の機器からの干渉はありますか？干渉の最も一般的な形式のいずれかが点灯し、機器から60 Hzです。記録システムが正しく接地する必要があります。むき出しのケーブルをシールドしてもバックグラウンド干渉を減少させることに役立ちます。

代表的な結果

図1：これは、神経回路網から自発的な活動の2分間のラスタープロットです。それぞれの黒い点は、活動電位を表しています。活動の2つのバーストは、青色の矢印で示されます。複数の電極上の応答は、ネットワーク接続の機能です。

図2：ここで刺激誘発活性の16秒のラスタープロットです。赤い星は刺激を表します。赤い矢印は、正常に複数の電極間にシナプス活動のバーストを誘導five刺激を示す。時折、刺激は青い矢印でここで、バーストを生成しません。

ディスカッション

このプロトコルは、どのように文化と同様に記録し、神経ネットワークを刺激への導入をマイクロ電極アレイ上の神経ネットワークを維持する上での指示を示しています。多国間環境協定から録音するより一般的な問題の一部は、MEAのトラブルシューティングのセクションで議論された。で説明すると、しばしばこれらの変更が特定の実験設計で必要とされる特定の条件を最適化するために利用されるプロトコルで、時々のバリエーションがあります。

ここで紹介する記録と刺激的なシステムがMCSのプリアンプでNeuroRighter ^15を設計したカスタムで構成されていますが、神経回路網とのインタフェースを提供できる他の複数のシステムがあります。特定のセットアップを選択すると、特定の実験のニーズに依存します。

単純な記録と刺激の例は、しかし、MEAの上にこれらの培養物は、シナプス活性と神経回路網の接続に関する複雑な問題への洞察を提供するために使用できるこのプロトコルで提供されていました。上記のように、進行中の仕事は、細胞可塑性、開発、興奮毒性および神経変性のようなプロセスを研究するためにこの技術を利用している述べた^。6-10は例えば、我々の研究室から最近の出版物はでリアルタイム閉ループの刺激とin vitroでの学習の指示再現可能な目標を示した現在の神経回路網の活動³に応答。

MEAの文化はしばしば凝り性で繊細なものですが、そのシンプルさとアクセシビリティ（インタクトな動物と比較して）のおかげで、彼らはネットワークレベルでの神経活動を研究するための強力なモデルを提供しています。

資料

解剖液（100ミリリットル株）	4で、順番に0.22μmのフィルターと店舗を組み合わせた℃に
コンポーネント	ボリュームミリリットル	最終濃度（mM）を
ダブル蒸留水	91.175
1 M MgCl 2の	0.58	5.8 mMの
1 M CaCl 2を	0.025	0.25 mMの
0.5 MのHEPES	0.32	1.6mmの
0.5パーセントフェノールレッド	0.2	（0.001％）
0.1N NaOHを	0.2	0.2mMの
2 M硫酸ナトリウム	4.5	90 mmの
1 M K2SO4	3.0	30mMの
0.1 Mキヌレン酸	1.0	1mMの
5mMのAPV	1.0	0.05mMの