固定ボリュームまたは固定圧力：出血性ショックのマウスモデル

要約

出血性ショックモデルでは、外傷後の炎症およびエンド臓器障害に関連するシグナル伝達カスケードの同定と理解を容易に信頼性と再現性のあるリソースとなっています。この記事では、マウスでは出血性ショックの実験手順に関連付けられている外科的および機械的な側面のステップバイステップの説明を提供します。

要約

それは、重度の失血や外傷が（MODこれらのシグナリングのイベントはまた敗血症および/ ​​または多臓器不全につながることがしばしば死亡をもたらす有害なシグナル伝達事象のカスケード^{1、2、3、4、5}が発生する可能性があることはよく知られて^{）6、7、8、9}それは外傷に苦しむ患者を助けるために、より効果的な方法を開発するために、抑制免疫機能と有害なシグナル伝達カスケードの原因を調査して重要である^。10この固定圧力の出血性ショック（HS）手順は、技術的に困難なものの、これらの病態生理学的条件の調査のための優れたリソースです^{。11、12、}生物系の評価¹³の進歩は、すなわちシステムバイオロジーは、さらに複雑な生理的なネットワークとセルラー通信のパターンを理解するために科学的なコミュニティを有効にしている^。14出血性ショックは、免疫機能に関連するこれらの細胞のコミュニケーションパターンを発表するための重要なツールであることが実証されています^{。15、16、17、18}この手順をマスターすることができます！この手順は、一定量または一定の圧力のアプローチのどちらかとして使用することができます。我々は、自然免疫と獲得免疫機能の研究を強化するためにマウスモデルでこの手法を適応した。マウスのサイズが小さいのHSのために^{19、20、21は}固有の課題を提示。多くの利用可能なマウス系統にしかし原因で、この種は、生物学的応答の研究のための比類のないリソースを表します。 HSモデルは、ショックの他の形態とは異なる別個の応答を誘発するとして、携帯通信パターンやホルモンや炎症性メディエーターシステム、および危険信号、すなわちDAMPとPAMP上方制御などのシステムの応答を研究するための重要なモデルです^{。22、23 、24、25}トランスジェニックマウス系統と特定のシグナル伝達を阻害する生物学的製剤の誘導の開発は^、さらに深刻な失血、すなわちHSおよび外傷^26日以降のシグナル伝達のアップおよびダウンレギュレーションの理解を明らかにする²⁷の貴重な機会を提示している^{、28、29、30。}

HSおよび外傷に関連して多数の蘇生法^{（R）。31、32、33、34が}存在する三回小屋の血液量に等しいだけに乳酸リンゲル液（LR）の一定量の蘇生法は、、このモデルで使用されていますこのような遠隔臓器障害と全身性炎症のような内因性のメカニズムを研究する。蘇生^{35、36、38、}このメソッドはHSと外傷^38、39の効果を評価する上で有効であることが証明されている。

プロトコル

1。楽器と手術野の準備：

1。楽器の準備。

すべての外科的処置は無菌操作を使用して実行されます。外科青パッドと滅菌フィールドのドレッシングが使用されます。すべての材料や器具は使用前に滅菌されています。 6から0縫合糸、綿の先端のアプリケーター、ガーゼ、オス - オス3ウェイコック、測定機器は、オートクレーブ滅菌する。トランスデューサ、PE - 50、およびPE - 10チューブはエチレンオキサイド滅菌です。すべての3ウェイコック、シリンジや針は滅菌受信されます。

6から0縫合糸は1インチの部分（6個/動物）に切断し、小さな滅菌袋に入れています。コットンチップアプリケーター、4x4のガーゼの正方形、およびオス - オス3ウェイコックは、小規模または中規模の滅菌袋とオートクレーブのどちらかに配置されます。私たちの外科用器具はオートクレーブ毎晩滅菌されています。それらは抗菌石鹸と水道水を使用して手術後に洗浄されています。彼らはきれいな手術青いパッドの上に乾燥させる。次に、これらを注意深く滅菌袋に入れ、次の日に使用するために滅菌されています。

トランスデューサとチューブはプラスチック製のコンポーネントを持っているので、彼らはガス、すなわち酸化エチレンを用いて滅菌する必要があります。 PE - 10チューブが5インチの片に切断し、小さな滅菌袋に入れられます。 PE - 50チューブを18インチの片に切断し、培地滅菌ポーチに入れられます。

2。手術野。

手術野を設定するには、まず、それは手術を開始する前に適切な温度300〜350 ° Fに達する保証するためにホットビーズ滅菌器の電源を入れます。その後、ダウンベンチ拭き、アルコールで手術青いパッドを配置することによって、次のステップに進んでください。一つのパッドには、顕微鏡下になり、他のはBPアナライザが置かれている循環加熱パッドになります。両方の手術の青いパッドの上ドレッシング滅菌フィールドを配置します。 70％アルコールとの双方向のステンレス鋼製器具のトレイ1 / 3を埋める。すべての手術器具をカバーするのに十分な70％エタノールを使用してください。別の滅菌フィールドドレッシングを使用し、顕微鏡の隣に置きます。この滅菌フィールド上の全ての滅菌器具、縫合糸、ガーゼ、そしてカテーテルを置きます。それらに触れることにより、それらを汚染しないように滅菌器具と縫合を開くときは注意してください。このセットアップ手順を行うときには、滅菌手袋を使用するのが最適です。

2。機械的なセットアップと手順：

1。カテーテル設定します。

滅菌手袋を着用し、BP、最初に、測定するために使用される右脚マウスカテーテルを設定するには。その後、オートクレーブ袋から無菌PE - 10チューブを得る。ポインタの指とそれらの間のインチほど残して親指とチューブの真ん中をつかむ。チューブのこのセクションカテーテルの挿入を支援するため、直径が細くするだけビットを伸ばす。延伸後チューブは滅菌済みのハサミを使用して半分に切る。 5インチのチューブは、現在½インチの長さは約2 2個でなければなりません。ベベル伸ばされた端をすることを確認してください。

*は、あまりにも多く、これが血管壁の下側を通して突くことによって内腔を終了の可能性を高めることができるように斜めのエッジを傾けますしないでください。

チューブの鈍未延伸の終わりに30Gの針を挿入します。滅菌1cc注射器と3方活栓を取得。アルコールヘパリン生理食塩水（0.1ミリリットルHeparin/9.9ml生理食塩水）を含む10ccの滅菌バイアルの上部を滅菌するためにワイプを使用してください。ヘパリン溶液の0.6 - 0.7ccでシリンジを埋める。オスの向かいに直接接続している三方の端に30Gの針とカテーテルを取り付けます。ストップコック、30Gの針、およびヘパリン溶液によるPE - 10チューブを埋める。システムのすべての気泡を出すようにしてください。すべての気泡を除去する最も効果的な方法は、重力を使用することです。ベンチにチューブぶら下げるをさせる間、地面に向かって針を指す。指のフリックと気泡がヘパリン溶液の上に浮く針ハブを与える。 3方向から30Gの針を外し、泡を取り除く。 3ウェイの中に閉じ込めと3方向にチューブを再接続されているすべての気泡を除去するために戻って1cc注射器に3方向に流体を引き出す。混合物の約1ccの注射器に残ります。マウスは、1Uヘパリン/マウス約等しいこの混合物の0.05cc（挿入時に開存性を維持するためにカテーテルをフラッシュするの結果として）約受け取ります。手術器具でドレッシング滅菌フィールド上にこの完成したカテーテルを置きます。

左脚マウスカテーテルを設定するには、3方活栓を除いて上記と同じ手順に従います。左脚は血を描くのに使われ、3方活栓は必要ありません。ヘパリン生理食塩水の混合物の0.15〜0.2ccと別の滅菌1cc注射器を埋める。 30Gの針とPE - 10 tubiをフック1cc注射器に直接NG。ソリューションでこの左脚のカテーテルシステムを埋める。あまりにも、このシステムから気泡を取り除く。滅菌機器でドレッシング滅菌野に完成したカテーテルを置きます。

2。トランスデューサセットアップします。

マイクロメッドの仕様に従ってデジ- MED BPA 400アナライザに滅菌器を接続してください。変換器の両端に3方活栓を取り付けます。乳酸リンゲル液（LR）を10ccの注射器を記入し、トランスデューサーは、ベンチトップで平らになるように3方向に取り付けます。 18インチPE - 50チューブを滅菌済みプレカットの部分の両端に23G針を挿入します。 10ccの注射器が添付された3ウェイにPE - 50チューブの一方の端を取り付けます。 LRで3 - wayおよびPE - 50のセットアップを埋める。前のセクションで説明したようにシステムのすべての気泡を出すようにしてください。トランスデューサに三方を再接続し、変換器とLRで²回、3の方法を記入してください。最後に、右脚マウスカテーテルへの付着のためのPE - 50チューブの23G針に金属オス - オスLeurのロックのコックを取り付けます。

*これは動作時に流体がトランスデューサに残ることが重要です。

*マイクロMEDプロトコルに従ってキャリブレーションやゼロ手順に従ってください。

3。外科的および実験方法：

1。外科的処置。

Pentobarbitolナトリウムの腹腔内注射（Nembutol）（70mg/kg @ 1:10希釈）を投与することによって始まります。この手順は、その尾の付け根（最も近位端）を使用してケージからマウスを拾うには、まず、によって達成されます。まだ尾を押しながら次の、ケージの上に動物を置く。ちょうど前足の後ろのマウスの両側に親指と中指でマウスの首の首筋をつかむ。人差し指は、ヘッドを固定するために首筋に向かって頭/首の地域で皮膚を引っ張るために使用されます。薬指がマウスの背骨の腰部に押されている間にマウスの尾は、ラップと小指と薬指の間に開催されます。マウスは5分以内に眠っている必要があります。動物の後に麻酔の場所、それらは、仰臥位で金属外科プレート上にあります。緩いループテープの技術は、その四肢をテープで動物を固定化するために使用されます。緩いループのテクニックは、単にテープの薄いストリップを切断し、足に劣る船首手足のそれぞれの周りや足に劣る後肢のそれぞれの周りゆるくテープをラップ伴います。テープは、その後、自分自身に戻って貼り付けされ、テープ上の左側は、ボードに添付されます。これは、マウスの四肢は、より自然な解剖学的位置を仮定することができます。動物の腹部および鼠径部の領域は、その後、オスターA5クリッパーサイズ40ブレードを使用して剃毛している。 4x4のガーゼはbetadineでdousedされており、外科領域は、不妊のために消去されます。

固定および滅菌後、イソフルランの1ccとノーズコーンは、初期の切開を加える前に数秒間マウスの鼻の上に配​​置されます。ノーズコーンは、ガーゼで満たされた50cc​​の円錐管で構成されています。チューブの底の半分は、接触することなく内部の残りの部分にマウスの鼻のためのスペースを作成することを切り出す。キャップ（組織の貯蔵容器の底面）はイソフルラン蒸気が脱出しないように50ccの円錐形の端に配置されます。動物の呼吸が減速し始めると、小4〜5ミリメ​​ートル切開は、腹部の左側の内腹斜筋と左横腹の筋肉に皮膚と平行に行われます。大腿静脈および動脈の解離は次のとおりです。周囲の筋肉やタッチの神経を損傷しないことを確認してください。この解剖を開始するには、腹部の接続でdumontsで脂肪組織をつかんで斜めや横腹部の筋肉から脂肪組織を分離。離れて筋肉の壁からこの組織を引っ張る。その後、dumontsの他のペアを使用して筋膜や脂肪組織を離れてからかう腹部の筋肉に沿って詳細に分析を鈍らせる。ちょうどこの脂肪組織の下に大腿神経と一緒に大腿静脈と動脈をうそ。

*広筋メディウス、内側、および大腿四頭や腹直筋の大腿の外側の筋肉を損傷しないように注意してください。これらの筋肉をつかむかにも触れる必要はまったくありません。

*大腿神経を触れるな

その横にある脂肪組織をつかんで神経を離れて分析する。静脈と動脈から横方向にこの組織を引っ張り、それがこの組織に埋め込まれているように神経が続きます。神経が横方向に引っ張られるように、動脈に対して、それらを開いたり閉じたり、ポイントダウン、他のdumontsを配置することにより、筋膜を解剖鈍らせる。船は非常に表面的なものとそうではないにしてください下層にある筋肉掘り下げる。神経が分離された後、筋肉に血管を保持している筋膜を分離するdumontsを使用してください。 dumontsは閉じておいてくださいとの船舶にdumontsの背を滑り。 dumontsの先端が静脈の反対側に表示されるように、筋膜の解剖鈍らせるために、それらを開きます。容器にdumontsの背側を保持し、最初の縫合糸をつかむ。 dumontsに縫合糸を入れ、血管や下層にある筋肉の間に作られた開口部を通って戻って縫合糸を引き出します。再び、周囲の筋肉を損傷する必要はありません。

静脈と動脈の周りに3の合計、6から0縫合糸を置く。縫合糸1は、腹部の筋肉に最も近位です。結び目を作るが、それが緩んと止血剤、それをオフのまま。止血剤の凹面エッジは動物の腹腔内にくるようにしてください。縫合糸2は、場所の最も遠位になります。この縫合糸は、すぐにダウンして再び血管やhemostated、凹面側を連結から接続することができます。遠位と近位の縫合糸がピンと張った容器を（血液の損失を防ぐために）プルとそれらにカテーテル挿入を支援するためにビットを持ち上げるために使用されます。縫合糸3は、カテーテルのサポートの縫合です。遠位と近位の縫合糸の間にこの縫合糸を置きます。挿入後に容器内にカテーテルを保護するために使用される緩い結び目を作る。縫合糸は安全になった後、太い血管の壁が動脈を識別する。それは非常に白いです。 microscissorsを使用して、動脈の上に小さな切開を加えます。最初のカテーテル挿入のための動脈の十分な量があるので、このホールは遠位縫合に近いください。動脈血管の内腔にdumontsの一端を配置し、血管壁の上にそれらを閉じて、穴を開くためにdumontsを使用してください。中央の縫合糸は、それが最初の挿入後の場所にカテーテルを保持するために使用できるように、動脈の穴に近位にあることを確認してください。動脈壁を押しながらカテーテルを介して血管を手前に引いて、内腔にカテーテルを押し込みます。軽く場所にカテーテルを保持するために、中間サポートの縫合糸を縛り付ける。近位止血剤を離します。このリリースでは、近位縫合糸を緩め、血管周囲縫合糸を再度開きます。この時点で、動脈圧は、カテーテル内に血液を戻すプッシュする必要があります。脈動血は、カテーテル内で可視にする必要がある。 oneデュモンでカテーテルの周囲血管を押さえ、4〜5ミリメ​​ートル程度血管にカテーテルをプッシュする他のを使用してください。カテーテルの周囲に血管を押し続けると、動脈の引き裂き防止に役立ちます。カテーテルの先端が内部斜めや横方向の腹の筋肉が真下にくるようにしてください。動脈ラインの血栓予防のために、カテーテルに血液を撤回し、ヘパリン液を注入し、マウスに数回、それを押し戻す。両側大腿動脈カニュレーションのための他の脚についてもこの手順を繰り返します。生理的パラメータのモニターに動物をフックする、BPA - 400アナライザー、すなわち、動脈血ラインをフラッシュする。周囲の組織の潤いを保つために外科的開口部に滅菌生理食塩水を1滴もしくは2滴を置く。プロシージャ全体で飽和、この領域を必ず保管してください。無菌性を維持するための手順を通して、動物を介してドレッシング滅菌フィールドを配置します。

70％のアルコールに手術器具を配置し、滅菌ガーゼでふいてください。動物の間の殺菌のための〜20秒間ホットビーズ滅菌器に入れてください。手術器具を取り外し、それらを冷やすために70％アルコールでそれらをスプレー。滅菌パッド上に配置します。次の動物に戻ってドリップされる楽器に残っているアルコールがないことを確認してください。

2。出血性ショック。

15分以上。期間は、約1 / 2マウスの血液量のは、28〜32ミリメートルHgの平均動脈圧を達成する引き出される。

* 25〜27グラ​​ムのマウスには所望の圧力を達成するために採血した血液の初期量は約0.6ccです。

この手順は、一定量とは対照的に固定された圧力の方法です。これらの手順は、しかし、一定の圧力と一定量の出血の両方で追跡することができる。常に監視されている間、動物は1.5 - 3時間のために出血性ショックのままになります。所望の圧力を達成するために多くの血液を撤回動物は、補正を試み、平均動脈圧は、（BP / HRアナライザを介して目に見える）少し、再び上昇し始めるように。サプリメント（0.05cc NembutolのIP）はめったにHS手順の実行中に必要とされていないが、動物の呼吸、ウィスカーの動き、反射テスト、およびデジタルBP / HR読書は、動物が麻酔のサプリメントを必要とするときに判断するのに役立ちます。動物は、ランプの下と36から37の温度を維持するために循環加熱パッド上に保存されています° C出血性ショックの手順を通して。温度は直腸プローブを介してチェックされます。

3。蘇生。

衝撃の時間がelaps後ES、動物は、乳酸リンゲル（LR）倍ごとに動物の小屋の血液量の一定量の溶液を用いて（R）蘇生された。 LRの音量が一定の割合、15分以上のボリュームで、ディスペンスに設定されてシリンジポンプを介して管理されます。間隔。カテーテルを外し、3縫合糸を使用して血管を結紮。ちょうど近位縫合糸を過ぎてカテーテルを引いて、完全にオフにこの縫合糸を結ぶ。これは任意の血液の損失を防ぐことができます。担保の流れは、虚血になるの後肢を防ぎます。

4。 Rescitationを投稿。

Rの後に、両方の後肢の開口部は、滅菌4から0 PDSIIの縫合糸を使って縫われます。緩いループテープが削除され、動物は、数時間の後の回復のために循環加熱パッド上に保持されクリーンなケージに入れられます。動物が適切に痛みを管理するために麻酔から起こさを開始すると鎮痛剤が投与されている必要があります。ブプレノルフィンは、動物が身体活動を始めると（0.1mg/kg）を皮下注射され、前ではなく、そのような呼吸機能を損なわないように。 IACUC承認されたプロトコル、個々の動物の行動、および現在の病状によって保証されるよう積極的な術後モニタリングの使用が推奨されます。

4。成功の秘密：

1. 血管を解剖するときに、大腿神経に触れないようにしてください
2. 腹直筋外側直筋大腿、および内側広筋の筋肉を損傷しないように注意してください。これらの筋肉をつかむかにも触れる必要はまったくありません。
3. これはルーメンと出血が出るカテーテルにつながるとして、カテーテルのベベルの角度が鋭いしないでください
4. できるだけ無菌のままに余分な労力がかかるようにしてください。
5. カテーテルまたは変換器システムのいずれにも気泡がないことを確認します。
6. それが運転中にトランスデューサでLRの液体を持っていることを確認してください。予行演習は、BPのシステムを損傷する恐れがあります。
7. 動脈穴を小さくする。
8. 遠位縫合に近い動脈の穴をあけます。
9. 同時に動脈をリッピングを避けるために、カテーテルの挿入のためにそれ以上の船舶を引きながらカテーテルを押してください。
10. 制御されていない組織の損傷や流体の損失を防ぐために無菌の生理食塩水で飽和させた足で外科的開口部を必ず保管してください。
11. 忍耐と技巧が重要です。
12. 実験を通して、動物の生理機能に細心の注意を払ってください。

5。手術懸念を投稿：

1. 脚の虚血を確認してください。担保の流れは、これを防ぐ必要がありますが。
2. 動物は、外科的操作と関連する炎症の結果として、後肢を使って問題がある可能性があります。適切な痛みを管理する。
3. 触れると、その後神経を損傷すること動員する動物のできないことにつながる可能性があります。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
装置	メーカー	カタログ番号
Dumonts（SS/45 °の角度0.2x0.12mmチップ、13.5センチメートル長さ）	ファイン科学ツール	11203〜25
外科はさみ（まっすぐ- 12センチメートル）	ファイン科学ツール	14068〜12
止血（曲面- 12.5センチメートル）	ファイン科学ツール	13009〜12
Microscissors（春のはさみ-ストレート- 8センチメートル）	ファイン科学ツール	15000〜00
鉗子（0.8ミリメートルチップ、曲面- 10センチメートル）	ファイン科学ツール	11050〜10
リール6-0で縫合	ファイン科学ツール	18020〜60
縫合糸4から0 PDSII	ペンの獣医	ETHZ304H
ガーゼ4 × 4	任意のグローバルベンダーから購入することができます
綿チップアプリケーター	任意のグローバルベンダーから購入することができます
30Gの針	任意のグローバルベンダーから購入することができます
23Gの針	任意のグローバルベンダーから購入することができます
3CCシリンジ	任意のグローバルベンダーから購入することができます
5ccシリンジ	任意のグローバルベンダーから購入することができます
10ccのシリンジ	任意のグローバルベンダーから購入することができます
50ccの円錐管	任意のグローバルベンダーから購入することができます
1ccの注射器のw / 25G針	フィッシャーサイエンティフィック	14-826-88
ポリエチレン10チューブ100`（PE - 10）	フィッシャーサイエンティフィック	14から170 - 12P
ポリエチレン50チューブ100`（PE - 50）	フィッシャーサイエンティフィック	14から170 - 12B
3方活栓	フィッシャーサイエンティフィック	NC9779127
外科青パッド	フィッシャーサイエンティフィック	50から7105
滅菌フィールドドレッシング	フィッシャーサイエンティフィック	NC9517505
テープは"1ロール	コー​​ポレートエクスプレス	MMM26001
ストレートサイド広口瓶（ノーズコーン用キャップとして使用される）	VWR	159000-058
ステンレス製トレイ8"× 11"	VWR	62687-049
オス - オスLeurのロック3方向	VWR	20068-909
滅菌ポーチ3"X8"	VWR	24008
滅菌袋5"X10"	VWR	24010
ワイルドM650顕微鏡のw /ブームスタンド	ライカ
ライカIC Dデジタルカメラ/ライブ映像	ライカ
デジメッドBPA - 400アナライザ＆システムインテグレーター	マイクロメッド	SYS - 400
TXD - 310（Digi - Keyはメッドトランスデューサ）	マイクロメッド	TXD - 300
コンピュータ	デル
ホットビーズ機器滅菌器	VWR	18000〜45
オスターA5バリカンワットサイズ40ブレード	VWR	10749-020
循環heatinグラムパッド18x26	ハーバード	py872 - 5272
直腸温度計	ケントサイエンティフィック	RET - 3

試薬	濃度	メーカー	カタログ番号
ペントバルビタールナトリウム（Nembutolナトリウム溶液）	70mg/kg	オベーション
ブプレノルフィン塩酸	0.1mg/kg	ベッドフォード研究所
乳酸リンゲル注射250ccクラスIVのバッグ	バクスター
Aerrane（イソフルラン）	99.9パーセント	NLSアニマルヘルス	105996
ヘパリンナトリウム	1000U	Abraxis
静菌性塩化ナトリウム	0.9パーセント	ホスピーラ
エチルアルコール	70パーセント	ファーマAAPER
Triadineポビドンヨード（Betadine）		トライアドの使い捨て