トランスジェニックの世代 C.エレガンスバイオリスティック変換による

要約

トランスジェニックワームは一般的に使用されています C.エレガンス研究。説明するには、DNAでコーティングされた金粒子と微粒子銃砲撃を使用してワームに導入遺伝子を導入するために、効果的な、まだ、単純なプロトコルです。労力と砲撃の結果は、トランスジェニック動物の生成のためのマイクロインジェクションに匹敵する。

要約

自由生活線虫C.を使用して多数の研究所虫は急速に増加している。この生物学的モデルの人気は急速な世代時間と短い寿命、簡単かつ安価な保守、完全に配列ゲノム、およびRNAiリソースおよび変異動物の配列に起因する。 C.のさらに、分析エレガンスのゲノムは、ワームの研究は、全体のマウスや培養細胞で行われた研究に重要な補助であることを示唆しているワームや高等脊椎動物の間に大きな類似性を、明らかにした。ワームの研究の強力かつ重要な部分は、遺伝子の局在性と機能を研究するトランスジェニック動物を使用する機能です。トランスジェニック動物は、ワームの生殖細胞のマイクロインジェクションを介して、または微粒子銃砲撃の利用を通じて作成することができます。砲撃は、新しい技術であり、ラボの数にはあまり馴染みがあります。ここでは、Bio - Rad社製PDS - 1000システムを使用して金粒子と微粒子銃爆撃によりトランスジェニックワームを生成する単純なプロトコルを記述する。両性生殖細胞へのDNAのマイクロインジェクションと比較して、このプロトコルは、ワームの解剖学的構造を識別したり、マイクロインジェクションを行うことに関して持つオペレータからの特別なスキルを必要としないという利点があります。さらに、複数のトランスジェニック系統は、通常、単一の爆撃から取得されます。また、マイクロインジェクションとは対照的に、微粒子銃爆撃は体外アレイと統合された導入遺伝子の両方でトランスジェニック動物を生成します。統合されたトランスジェニック系統を取得する機能は、外来DNAを統合する変異原性プロトコルの使用を避けることができます。結論では、微粒子銃爆撃、特にマイクロインジェクションで熟練になるために必要な時間と労力を投資に興味のない研究者のために、トランスジェニック動物の生成のための魅力的な方法になります。

プロトコル

概要

伝統的にトランスジェニックワームは、Cに導入遺伝子DNAをマイクロインジェクションすることによって生成されたelegansの生殖系列^1,2,3,4。成功しながら、このアプローチは、特殊な機器やワームの解剖学とマイクロインジェクション技術と経験の開発が必要。さらに最近では遺伝子銃砲撃は生殖細胞系列^5,6に外来DNAを導入するDNAでコーティングされた金粒子を使用する代替アプローチとして開発されました。このアプローチは成功するために実践の面でより短い時間投資が必要です。

Cの微粒子銃爆撃成功は、動物の大量を必要とするので、トランスジェニックワームを生成するために線虫は、個々のワームのレベルの低効率を有する。これらは、いくつかの方法で栽培が、我々は関与してプレートの作業と数を減らすために卵のプレートを使用することができます。我々のプロトコルは、卵のプレートやワームの準備から始まり、その後、バイオラッドPDS-1000/Heヘプタシステムを使用して砲撃のプロトコルに焦点を当てています。我々はBerezikovら⁷の仕事の一部が我々のプロトコルを適応した。

爆撃で、UNC - 119遺伝子は通常、トランスジェニック動物のためのマーカーとして使用されます。この変異を有するワームの株がひどくまとまりのないものであり、かろうじて移動、外観がみすぼらしいです、とdauer幼虫^8を形成することはできません。 dauerは、不利な条件下での生殖成人に開発を遅らせるために使用されている代替の幼虫期である、とdauerへのエントリは複数の遺伝子⁹によって規制されています。 UNC - 119の遺伝子を持ついくつかの菌株はC.から入手できます。 elegansの遺伝学センター（CGC、ミネアポリス、ミネソタ州）。オリジナルDP38株（UNC - 119（ED3））も、下流の実験に影響を与える可能性のある関係のないdauer形成構成（DAF - c）の変異を運ぶ。いくつかのラボではこの突然変異をoutcrossedている、とHT1593株はCGCから入手可能です。我々はトランスジェニック動物は、DP38株を識別するために、いくらか簡単であることがわかるとトランスジェニック動物を作成する場合に、この菌株を使用する傾向があります。必要な場合には、我々は、DAF - C変異を削除するには、トランスジェニックワームを異系交配させるためにHT1593を使用してください。導入遺伝子を準備している間私達が成長しているプレートの在庫を維持できるようにDP38ワームが成長するために取得するプロトコル内の最も遅いステップの一つです。

対象の遺伝子と一緒にUNC - 119マーカーの発現は、正常な運動性と体の大きさ⁵の救助に基づいて導入遺伝子を発現する動物を簡単に識別することができます。 UNC - 119遺伝子は小さなCのためにいくつかの情報源、およびベクトルUNC - 119のゲノムDNAを使用して、UNC - 119プロモーターとcDNA、およびゲノムDNAから得ることができます。 briggsiae遺伝子は^、8,10を使用している。我々は最近、相同組換え¹¹およびトランスジェニック動物^12を生成するためのCre - LOX組み換えによるUNC - 119遺伝子を運ぶためにワームのfosmidsを変更する方法により、アンピシリン耐性遺伝子を含むプラスミドにUNC - 119カセットを追加するために単純なプロトコルを説明した。プラスミドはAddgene社（ケンブリッジ、マサチューセッツ州）から入手可能である。

単一の砲撃を行うことに伴う労力は重要ではあるが、管理している間、1日のうちに複数の砲撃を行うに関与して追加の作業は最小限に抑えられます。その結果、我々は日常的に各を生成するために必要な作業を減少させるトランスジェニックワームの生産をクラスタ化する。

1。エッグプレートの準備

彼らの運動障害ではプレートの他の部分はまだ食べ物が含まれている間、板の部分に餓死する傾向があるため、UNC - 119変異体ワームは、標準のNGMプレート上で増殖することは困難です。卵のプレート上に厚い食品層がUNC - 119ワームがより簡単にクロールするとすべての板^7を乗っ取ることができるように卵のプレートは、この問題を解決する。卵プレートも少ないプレートが^13を必要とされるようにワームの大量の成長を支援するという利点があります。通常5卵のプレート一砲撃のためにワームを成長させるために十分である。下のレシピは約50枚になりますが、必要に応じてより少ないように半減することができます。

我々はプレート内で抗生物質や抗真菌薬の両方を使用してのみプレートをシーディングするための次亜塩素処理によって生成された卵を使うので、卵のプレートは、容易に汚染されることができる。

1日目：

1. 500ミリリットル瓶でLB（400 mL）を準備する。 20分のためのオートクレーブ。
2. 2％寒天を1リットルNGAを使用して、〜50 10センチメートルNGAのプレートを注ぐ。我々は200μg/ mLの¹³にリットルとストレプトマイシンあたりナイスタチン10 mLを加える。
3. 200μg/ mlのストレプトマイシンを含むLBでOP50 - 1 40mLの一晩培養して成長する。この株は、ストレプトマイシン耐性とCGCから入手可能です。
4. 用500mLにボトルをオートクレーブ次の日。

2日目：

1. 滅菌瓶に10鶏の卵の別の卵黄。我々は、卵黄のセパレータを（ターゲットを含む家庭用店舗、で入手可能）を使用します。シェイク。
2. LBと400MLにボリュームをもたらす。振る
3. 1時間60℃でインキュベートする。
4. 室温まで冷却。
5. OP50 - 1の40mlのを追加。振る
6. プレート当たりの混合物の5〜8 mLを配布する。
7. プレートは室温で一晩沈殿することができます。

3日目：

1. 静かにプレートから残留液を捨てる。室温で一晩上ふたで乾燥することができます。

4日目：

1. 必要になるまで4℃ボックスやビニール袋や店舗° Cにプレートを置く。これらのプレートは、1〜2ヶ月のために使用するためにOKのように見える。

2。種まきエッグプレート

1. 最近飢えプレートに集中OP50を追加することで、6センチメートルNGAプレート上DP38ワームを展開します。単一の爆​​撃のために、私たちは種子5卵のプレートに〜6小さなプレートを使用してください。複数の爆撃のために、我々は、卵のプレートを播種する前に代わりにシード2濃縮ペプトンのプレートに小さなプレートを使用してください。
2. 次亜塩素酸^13,14の使用を介してDP38ワームから卵を隔離する。滅菌S -基底またはM9バッファ^13,14の卵を再懸濁します。
3. 卵板の適切な数に卵を（プレートあたり> 10,000）を追加します。砲撃に使用する70から10日間20 ° Cで卵のプレート上でワームが成長する。プレートは、ワームは、プレートから食べ物をクリアするために始めた後に使用できるようになります。これらのプレートは、餓死することが非常に困難ですし、長い期間のために成長すると、ワームの歩留まりが向上します。

砲撃

我々は、事前に金の株式を用意し、それが℃で使用するために4℃で保存されてください。また、必要に応じては、気づかれていないと10cm NGAプレートをスポットされています。汚点のないプレートは事前によく注ぎ、完全にワームで追加された液体の吸収を促進するために乾燥して許可する必要があります。

砲撃の日に、我々は、DNAでコーティングされた金粒子を準備最初に起動した後、ワームを洗い流してください。私たちは、その後、気づかれていないNGAプレートにワームを追加し、金粒子を洗浄、macrocarriersに転送することを終える。

金粒子の調製：

1. 1.7mLチューブに金粒子の60mgを秤量し、15分間70％エタノールに浸漬。金粒子を沈殿させるために簡単にスピン。
2. 滅菌水で3回洗浄し、金を集めるために簡潔にするたびにスピン。
3. 50パーセント滅菌グリセロール1mLのに金を再懸濁します。これは、株式、金粒子溶液であり、4℃で数ヶ月保存することができる

ワーム：

1. S -基底またはM9バッファーと卵板オフDP38ワームをフロートし、50mLのコニカルチューブに移す。
2. ワームが底になるまでベンチでチューブを保持します。その後、バッファーを吸引除去し、新鮮なS -基底またはM9を追加。バッファがゴミの比較的明確になるまで、2〜3回洗浄する。 DNAのコーティングが完了するまで、この手順でワームを保つ。
3. 爆撃あたりのバッファのワームの約2〜3 mLを吸引しておきます。氷上で10センチメートル気づかれていないNGAのプレートに移す。 NGAのプレートが衝突前に完全に乾燥させる必要があるので、転送量を最小限に抑えることが重要です。ワームとプレートの表面全体を覆​​うようにしてください。
4. プレートは氷上で乾燥することができます。氷は、乾燥しながら凝集からワームを防ぐことができます。

このステップは重要です：プレートはドライでなければならず、ワームは、均等にNGAのプレート上に分散した。氷の上にワームを保つことはプレート上に移動し、山に集約することを防ぎます。

DNA調製（一爆撃用）：

1. 1.7mLチューブに混ぜる。
   • 50μlの金粒子。追加する前に徹底的に再懸濁します。
   • 50μlのDNA（10 - 15ug）。我々は、環状または直鎖DNAの間にほとんど差を参照してください。通常、我々は、DNA精製（キアゲン社、バレンシア、カリフォルニア州）のためにキアゲンミディプレップカートリッジを使用してください。
   • 50μlの2.5MのCaCl _2。このソリューションは、室温で数週間安定です。
   • 20μlの0.1Mスペルミジン。
     
     スペルミジンは、水溶液中で不安定である。我々は、-20℃で70μlスペルミジンのアリコートとストアを行う私たちは、その後、0.1M溶液を得るために右使用前に水1mLの追加。このソリューションは、それぞれの砲撃のために新しく調製する必要があります。
     
     ボルテックスしながらのCaCl _2、DNAとスペルミジン/プロタミン滴ずつを追加し、我々は通常、低速で1.7mLチューブに金粒子渦と。リン酸カルシウムでトランスフェクションしている人にとっては、このテクニックはよく知られている。
     
     我々はまた、プロタミンの代わりに非常に良い結果が¹⁵とスペルミジン使用している。我々は、水に新鮮な溶液（1mg/mL）を準備し、私たち電子50μlのではなく、スペルミジンの20μlの。我々はプロタミンを使用する場合、我々は通常、代わりに氷の上に置くの10分間室温で混合物をインキュベートする。プロタミンは、冷凍保管する必要はありませんし、粉は液体の代わりになります。
2. 30分間氷上で混合物をインキュベートし、定期的に懸濁液中の金粒子を保つために混ぜる。その後簡単に回転し、上清を吸引除去する。
3. 300μl70％エタノールで洗う。簡単にスピン。
4. 1mLの100％エタノールで洗浄する。簡単にスピン。
5. 170μlの100％エタノールに再懸濁します。

macrocarriersの準備：

1. 2 - プロパノール7 macrocarriers（バイオラッド、ヘラクレス、CA）をすすいでください。ティッシュペーパーの上に置き、室温でそれらを乾燥させて。
2. 各macrocarrierの中心にDNA /金の混合物の20μlのを追加。懸濁液中の金を維持するためにピペッティングの前に渦の右側にしてください。
3. エタノールが蒸発してみましょう。

3。砲撃

実験は、システムを介してヘリウムをフラッシュする前に、空白の砲撃を行ってください。

1. 真空ポンプと密接な真空ポンプのトラップをオンにします。我々は、オイルフリー真​​空ポンプを使用してください。
2. ヘリウムタンクをオンにします。その圧力が≥2200psiかどうかをチェック。
3. 2 - プロパノールのウェットラプチャーディスクは、（1350 PSI）、ヘプタアダプタのキャップを保持に配置する。
4. PDS - 1000のシステムにアダプタをネジ込み、付属のトルクレンチで締めます。
5. ホルダーとシート、それら提供されたツールでに7 macrocarriersを置きます。その後、ホルダーへのヘプタの停止画面と底を置く。上から二番目の棚に上のホルダーと場所を反転します。 macrocarriersの金の斑点の側は、この時点では下向きにする必要があります。
6. ヘプタアダプタのコンセントを備えたmacrocarrierホルダーの上部の穴を合わせます。
7. 衝撃チャンバー内で最も低い棚の上のワーム（蓋のオフ）でコーティングされたNGAのプレートを置きます。
8. 完全にPDS - 1000で真空流量のノブを開きます。チャンバーは、水銀を26に達するまでVACボタンを押してください。その後、真空を維持するために位置を保持するために切り替えます。
9. ディスクが破裂するまで、発射ボタンを押したままにします。圧力が1350psiに達したときに発生します。時々これが発生する50〜20秒かかります。ボタンを離します。
10. チャンバー（排気口の位置）から真空を解放し、プレートを取り外します。
11. 真空とヘリウムをオフにします。
12. ラインはヘリウムを（ヘリウムゲージが0 psiをマークする）が含まれていないまで、数回起動。
13. PDS - 1000システムの電源を切ります。

爆撃後のワームの回復：

1. ℃で20分間20℃で砲撃プレートにしておきます。
2. 10mLのS -基底またはM9バッファーでプレートからワームをフロートさせます。
3. 10センチメートル斑点NGAプレート - 20に0.5mLをワームを置く。
4. 救出ワームをチェックする前に20℃で約2週間° Cまたは室温（22〜24 ° C）を残す。
5. 解剖顕微鏡でUNC - 119（+）の表現型を持つワームの画面。救出ワームが非救出ワーム以上生存の優位性を持っているので、プレートが飢えている後にスクリーニングするための最適な時間です​​。
6. 救出ワームが含まれている各10cmのプレートから一個の行を生成します。

4。代表的な結果

トランスジェニック動物を得ることに関して持つプロトコルの成功は、特定の遺伝子に依存する。プロモーターの場合：GFPレポータートランスジーン私たちは20行まで取得している。より多くの典型的な結果は3-10行です。アップトランスジェニック系統の30％に統合された行ですが、これはランダムで、統合されたラインが特に望まれている場合我々は一日に複数の爆撃を実行します。

ディスカッション

微粒子銃砲撃はC.を含む、多くの生物に外来DNAを導入する簡単な方法です。 エレガンス ^{1,5,6,7,16。}それは、CaCl ₂の存在下でDNAと複合体を形成する金粒子に依存しています。このようなスペルミジンなどのカチオン性ポリアミンは、生体内のヌクレアーゼ分解からDNAを保護する。スペルミジンは不安定な分子なので、-20℃で小分けに格納し、右側の爆撃を実行する?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gold particles	Inbio gold	BD021	1micron
Midiprep kit	Qiagen	12143
Spermidine	Sigma-Aldrich	S4139
Protamine	Sigma-Aldrich	P4505
Macrocarriers	Bio-Rad	165-2335
PDS-1000/He Hepta System	Bio-Rad	165-2257
Rupture disk	Bio-Rad	165-2330
Nystatin	Sigma-Aldrich	N1638
Streptomycin	MP Biomedicals	100556