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ウェスタンブロッティング：サンプル調製を検出する
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要約
ウエスタンブロット法は、組織ホモジネートまたは抽出物の特定のサンプル中の特定のタンパク質を検出するために使用される分析手法です。
要約
ウエスタンブロット法は、組織ホモジネートまたは抽出物の特定のサンプル中の特定のタンパク質を検出するために使用される分析手法です。それは、ポリペプチドの長さ（変性条件）またはタンパク質の3次元構造（ネイティブ/非変性条件）で、ネイティブまたは変性タンパク質を分離するゲル電気泳動を使用しています。タンパク質を標的タンパク質に特異的な抗体を使用してそれらがプローブされる膜（通常はニトロセルロースまたはPVDF）、（検出）に転送されます。
プロトコル
1。サンプル準備
ウエスタンブロット法の最初のステップは、サンプルの準備です。ゲルの細胞や組織を実行するためのサンプルを準備するには、目的のタンパク質を解放するために溶解する必要があります。
- 汎用性と可溶性タンパク質の抽出のために使いやすい、便利、すぐに使用できる試薬はCytoBusterまたはPhosphoSafeです。これらの抽出バッファーには、哺乳類と昆虫細胞から可溶性タンパク質を効率的に抽出するために最適化された洗剤を含まれています。 CytoBusterのタンパク質抽出試薬の穏やかな、非イオン性組成物は、超音波処理や凍結/融解などの二次治療を必要とせずに機能的に活性な内因性または発現タンパク質の分離を可能にします。 PhoshoSafeは、4つのホスファターゼ阻害剤を含む付加的な利点を持っています。
- 低速の遠心分離（2500 xgで例えば5分）により細胞をペレット化は、よく細胞ペレットを排出。
- 10 6細胞（CytoBusterのタンパク質抽出試薬の最適量は、セルサイズに基づいて異なる場合があります）あたり150μLを使用してCytoBusterのタンパク質抽出試薬で細胞を再懸濁します。
- 5分間室温でインキュベートする。
- 適切なチューブに移し、4℃で16000 × gで5分間スピン℃に
- 転送は、新しいチューブに（細胞抽出液）上清をクリアし、分析を進める。
- 特殊なタンパク質の抽出には、我々は高品質のプロテオキットを使用することをお勧めします。 EMDは、ミトコンドリアの分離、細胞内プロテオームの抽出、膜貫通タンパク質の抽出、および他の多くのためのダース以上のキットを持っています。詳細については、私たちのウエスタンブロットのランディングページをご覧ください。
- EMDはまた、プロテアーゼやホスファターゼ阻害剤のカクテルセットを幅広く販売しています。とすぐに溶解が発生すると、タンパク質分解、脱リン酸化し、変性が始まります。これらのイベントのサンプルは氷上または4℃で保管している場合は途方もなく遅くすることができます·すべての時間と適切な阻害剤でのCは、溶解バッファーに新鮮な追加されます。詳細については、私たちのウエスタンブロットのランディングページをご覧ください。
2。 SDS - PAGE
ウエスタンブロット法の第二段階は、タンパク質の分離です。タンパク質は分子量に基づいて分離されている。
- あなたがあなた自身のPAGEゲルを作ることができる、しかし我々は市販のプレキャストゲルを使用することになります。
- あなたのサンプルを準備した後、タンパク質濃度を決定する準備が整いました。 EMDの濃度を測定するには、このための2つのキットを持っており、一つは非干渉タンパク質アッセイキットおよびBCAタンパク質アッセイキットであることその他のであること。
- タンパク質濃度が評価されると我々は、ゲルをロードするための我々のサンプルを準備する準備が整いました。抗体は通常、目的のタンパク質の小さな部分（エピトープと呼ばれる）を認識し、このドメインは、タンパク質の立体構造内に存在していてもよい。この部分に対する抗体のアクセスを有効にするには、それはタンパク質を展開する必要があります。
- 変性させ、アニオン変性界面活性剤ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）とローディング緩衝液を使用し、5分間95〜100℃で混合物を沸騰。使いやすく、便利なローディングバッファーには、4Xサンプルバッファーです。
- トレイルミックスのタンパク質マーカーとよく最初の車線をロードする。このマーカーは、電気泳動を監視できるようにする3つの基準バンドを持っています。ゲルを染色されると、10バンドは10から225 kDaのからまで表示されます。
- バッファを実行して電気泳動ユニットを埋める。 PAGEゲルの場合、これは通常1Xトリス - グリシンです。詳細なバッファのレシピの場合は、ウェスタンブロッティングのページをご覧ください。 EMDは、私たちのOmniPur化学ラインで高品質のバッファの試薬を提供しています。 1時間220Vでゲルを実行します。
- タンパク質が分離した後、蛋白質が均等にかつ均一に移行したことを確認するために、クマシーブルーでゲルを染色。 RAPIDstainのに使える準備ができている超高感度の染色です。いいえ脱色は必要ありません。
3。タンパク質の転送
電荷を持つタンパク質が電界のゲルを通過するように誘導することができるのと同じように、タンパク質はPVDFまたはニトロセルロースのいずれかである、メンブレン上にゲルから電気的なフィールドで転送することができます。
- 今日は、ウェットの転送を行います。ウェット転送では、ゲルとメンブレンはスポンジと紙の間に挟まれている（スポンジ/紙/ゲル/メンブレン/紙/スポンジ）とすべてがない気泡はゲルとメンブレンの間に形成されている確認した後、しっかりと一緒にクランプされています。サンドイッチは、電界が印加される転写バッファーに浸漬される。負に帯電したタンパク質は、正に帯電した電極に向かって移動するが、膜はそれらを停止し、それらを結合する、との継続からそれらを防ぐことができます。
- 膜の2種類が用意されています：ニトロセルロースおよびPVDF。どちらも動きます。今日は、PVDFを使用することになります。 PVDF膜は、メタノに浸かっRequireの5分間氷冷転送バッファに続いて数分の場合はl、。ゲルはまた、氷冷転送バッファの数分間平衡化する必要があります。そうしないと、転送中にゲルを減少することもあります。
- ウェット転送用バッファは、20％メタノールで1Xトリス - グリシンです。詳細なバッファーの調製は、当社のウェブサイトで入手できます。
- 転送が完了したら、それは決して、エアポケットに転送さえ確保するためにタンパク質を可視化することをお勧めします。これは簡単にステインレッドアラートウエスタンブロットで行うことができます。この染色は、に使用準備ができており、脱色は水で簡単に行うことができます。
4。抗体およびアクセサリの試薬
- 抗原にプロービングし、抗体を行う最初のステップは、メンブレンをブロックすることです。メンブレンをブロックすると、非特異的バックグラウンドの結合を防ぎます。
- 無脂肪牛乳やBSAのどちらかをブロッキング溶液として使用することができます。しかし、リン酸化特異的抗体を使用するとき、それは高いバックグラウンドの原因となるので、ミルクを使用することは推奨されません。
- EMDは、準備される非哺乳類遮断剤とブロットQuickBlockerであるSeaBlock、、など、いくつかの高品質なブロッキング試薬は、ブロッキング剤の使いすぐに提供しています。我々はまた、高品質のBSA（フラクションV）を利用している。
- 穏やかに撹拌しながら室温で膜1時間インキュベートします。
- インキュベーション後、TBSTまたはPBSTで3回洗浄する。 TBSTまたはPBSTを作るのは簡単で便利な方法は（PBS TWEEN錠/ TBS TWEEN錠）私たちの錠剤を使用することです。
- 膜がブロックされたら、一次抗体とインキュベートする準備が整いました。 EMDは30年以上にわたって業界で最高の抗体の保証と例外的な抗体の包括的なポートフォリオを提供してきました。すべてのEMDの抗体を用いて、我々が100％リスクのない保証を提供することを忘れないでください。抗体を購入し、あなたが望むあらゆる種の特異性やアプリケーションのためにそれを使用してください。抗体は、あなたの満足に動作しない場合は、我々は、他の製品で使用される完全な信用を提供します。詳細については、私たちのウェスタンブロッティングのWebページをご覧ください。
- 今日、我々はSignalBoostの溶液1を使用して私たちの一次抗体をインキュベートされます。 SignalBoostは、信号が大幅に強化できるように偉大な製品です。単に解決方法1で一次抗体をインキュベートし、1時間または通常どおりインキュベートする。さらにブロッキング剤を追加する必要はありません。代わりに、ブロッキング剤としてBSAや脱脂粉乳を使用することができます。
- TBSTで洗浄する。我々は、既製溶解するTBSTのタブレットを使用してTBSTを行います。
- SignalBoostの溶液2を使用して、二次抗体をインキュベートする。 1時間をブロッキングバッファーで二次抗体をインキュベートする。 TBSTで再び数回膜を洗浄してください。
5。検出
HRPコンジュゲート二次抗体の場合、ECLは、伝統的に使用されます。私たちが提供する優秀なECL試薬はRapidStepです。 RapidStepの利点は、管腔またはエンハンサーのないミキシングが必要ないことです。単純に膜を数回スプレーし、X線フィルムを使用して開発する。 RapidStepは、基質の添加後2時間までに低ピクトグラムの感度だけでなく、発光光を提供しています。
ディスカッション
このビデオプレゼンテーションでは、我々は、サンプル調製、SDS - PAGE、抗体、および検出とブロッキング/プロービング膜であるウエスタンブロット法の主な手順を強調している。プロセスの各ステップについては、適切なプロトコルと適切な試薬は、高品質な結果を達成するために使用する必要があります。
開示事項
作家アンナEslamiとジェシールハンは、この記事で使用する試薬や器具を生産するEMDケミカルズ社によって採用されています。
資料
参考文献
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- Renart, J., Reiser, J., Stark, G. R., R, G. Transfer of proteins from gels to diazobenzyloxymethyl-paper and detection with antisera: a method for studying antibody specificity and antigen structure. Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (7), 3116-3120 (1979).
- Burnette, W. N. '. W. e. s. t. e. r. n. blotting': electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A. Analytical Biochemistry. 112, 195-203 (1981).
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