V3の人口ベースのシーケンシングを用いたHIV - 1トロピズムの遺伝子型推論

要約

HIV指向性は、ウイルスエンベロープのV3領域から推測することができます。 V3は、PCRには、ネストされたRT - PCR、配列決定を用いてtriplicateで増幅し、バイオインフォマティクスのソフトウェアを使用して解釈されます。低G2Pスコア1以上のシーケンス（S）とを有するサンプルは、非R5ウイルスとして分類されています。

要約

背景：前HIV治療のCCR5アンタゴニストのクラスから薬を受け取るために、患者は彼または彼女のウイルスの人口は、別のコレセプターを細胞侵入のためにCCR5コレセプターを使用し、ないことを確認するために、HIVの親和性の試験を受ける必要があります。親和性のテストへの一つのアプローチは、コレセプターと相互作用するHIVのエンベロープのV3領域の配列を調べることです。

方法：ウイルスRNAは、血漿から抽出されます。 V3領域は、ネストされた逆転写酵素- PCRによる三重に増幅されます。増幅を配列決定し、ソフトウェア、RE_Callを用いて分析している。シーケンスは、V3領域からウイルス親和性を推測するなどgeno2phenoなどのバイオインフォマティクスのアルゴリズムに送信されます。配列は、そのgeno2pheno偽陽性率は、以下の5.75パーセントを下回る場合は、非R5と推定されています。サンプルからの3つのシーケンスのいずれかが非R5ように推論される場合は、患者はCCR5拮抗薬に反応するそうです。

プロトコル

手順：

1。抽出：

血漿の少なくとも500μLがこの遺伝子型のHIVの親和性のテスト用サンプルの入力として必要とされる。

1. easyMAG（ビオメリュー）自動抽出、またはラボの好ましい抽出法を用いてプラズマの500μLからHIV RNAを抽出する。
   60μL分注しに抽出したウイルスRNAを溶出する。 -20℃で保存摂氏または抽出後直ちに転写酵素- PCRリバース始める。

2。 RT - PCR：

サンプル抽出の4μLは、ネストされたRT - PCR法を用いて三重に増幅されます。 RT - PCR反応は、PCR -クリーンルームで設定する必要があります。

1. 増幅されるサンプル数に必要な試薬量を計算する。 1反応のために試薬の量を示す下の表に従ってください。
   

   試薬	体積（μL） （1X反応）
   DEPCは水を扱わ	10.56
   2 ×反応バッファー	20
   50％のスクロース及び0.04％ブロモフェノールブルーミックス	4
   HIV V3領域を標的とするフォワードプライマー	0.32
   リバースプライマー	0.32
   酵素 - スーパースクリプトIIIワンステップRT - PCRシステムプラチナTaq DNAポリメラーゼと	0.8
   合計	36

   ワンステップRT PCR 1反応に必要な、表1。試薬の量。
   それぞれのステップRT - PCR反応は以下のレシピが必要です。
   • 10.56μLDEPC処理水
   • 2倍の反応緩衝液20μL
   • 50％のスクロース及び0.04％ブロモフェノールブルーミックスの4μL
   • HIV V3領域を標的とするフォワードプライマーの0.32μL
   • リバースプライマーの0.32μL
   • 酵素0.8μL
   反応当たり36μLの合計。
2. 空、標識された96ウェルPCRプレートの横の行のサンプルの抽​​出チューブをラインアップ。
3. リピーターピペットを用いて、各サンプルの抽​​出のために製造した3井戸が存在するような、PCRプレートの各ウェルにサンプルのミックス36μLを加える。
   *注意：この手順は、ウイルスの人口の適切なサンプリングを保証するために、最低でも、三重で実行する必要があります。
4. 8チャンネルのマルチチャンネルピペットを使用して、その3ウェルの各々にサンプルの抽​​出物4μLを追加します。各添加の間にヒントを変更します。
5. PCRストリップキャップ付き井戸をカバーしています。
6. 転送がcomleteの場合は、サーマルサイクラーでのPCRプレートを置きます。 68で52℃で30分間94℃で2分間°のC 40サイクル（94℃15秒° C、55℃30秒℃、68℃1.5分° C）5分：次のプログラムを実行するためのサーマルサイクラーを設定する° C
7. クラーからPCRプレートを取り外します。プレートは室温で保存することができます。

第二ラウンドのPCRステップに進みます

3。第二ラウンドPCR：

1. 増幅されるサンプル数に必要な試薬量を計算する。 1反応のために試薬の量を示す下の表に従ってください。
   

   試薬	体積（μL） （1X反応）
   DEPCは水を扱わ	13.45
   60％ショ糖、0.08％クレゾールレッドミックス	2
   ロシュHiFiシステムバッファ2	2
   MgCl 2の	0.8
   のdNTP	0.16
   フォワードPCRプライマー	0.15
   逆方向PCRプライマー	0.15
   ハイファイ酵素を展開	0.29
   合計	19

   第²ラウンドのPCR 1反応に必要な、表2。試薬量。
   それぞれの第二ラウンドのPCR反応は以下のレシピが必要です。
   • 13.45μLDEPC処理水
   • 2μL、60％ショ糖、0.08％クレゾールレッドミックス
   • ロシュHiFiシステムバッファ2の2μL
   • 25 mMのMgCl _2を 0.8μL
   • 25 mMのdNTPを0.16μL
   • 0.15μLフォワードおよびリバースPCRプライマーの両方
   • 0.29μL展開ハイファイ酵素
   反応あたり19μLの合計。
2. PCR -クリーンルームでは、リピータのピペットを使用して、クリーンなPCRプレートにウェル当たりの反応バッファー19μLを加える。
3. ポスト増幅室では、8チャンネルのマルチチャンネルピペットを使用して、第二ラウンドのPCRバッファーにRT - PCRのテンプレートの1μLを転送する。各添加の間にヒントを変更します。
4. PCRストリップキャップ付き井戸をカバーし、サーマルサイクラーに第二ラウンドのPCRプレートを転送する。
5. 94℃2分の° C 35サイクル（15秒94℃55℃、30秒° C、72で1分° C）72 7分° C：次のプログラムを実行するためのサーマルサイクラーを設定する
6. 温度が25に戻った後クラーからプレートを取り外します℃に

4。ゲル電気泳動：

V3領域が正常に増幅されていることを確認するために、ゲル電気泳動のステップが実行されます。

1. 1X TAEバッファーを50 mLのアガロース粉末を0.8gとアガロースゲルを準備します。かき混ぜるとアガロースが完全に溶解するまで〜1分のための電子レンジで溶かす。
2. SYBR Safe染色ゲルと混合する渦の6μLを加える。
3. ゲルトレイにソリューションを注ぎ、そしてPCR井戸の数を収容するのに十分なゲル櫛を追加。
4. ゲルが乾燥したら、櫛を削除し、ゲルの装置にゲルを置き、それは完全に、1 × TAEバッファーに沈めていることを確認して。
5. 10μLのマルチチャンネルピペットを用いて、ゲル内の独自のウェルに各PCRサンプルの8μLを追加します。増幅がゲルに追加された後のPCRプレートをカバーしています。
6. 行ごとに少なくとも一つのウェルにDNAラダーの6μLを加える。
7. バンドがゲルをオフに実行しないことを確認して、〜10分間〜100Vでゲルの装置を実行します。
8. UVトランスイルミネーターにゲルを置き、ゲルの写真を撮る。
   PCR -増幅DNAをウェルの中には、良好な増幅を示し、光が表示されます。
9. three増幅が成功したすべてのサンプルをメモしておきます。必要に応じて、3つより少ない増幅を持つこれらのサンプルについてRT - PCRを繰り返す。

シーケンスに進む

5。シーケンシング：

cDNAのウイルスの増幅した後、サンプルは配列決定のために調製することができる。シーケンシング反応は、増幅後の部屋で行われるべきである。

1. 冷蔵庫から冷凍庫とシーケンシングプライマーからBigDyeを削除します。 1時間以上、もはやため、室温でBigDye解凍してみましょう。
2. 実行するサンプル数に必要な試薬量を計算します。 1反応のために試薬の量を示す下の表に従ってください。
   

   試薬	体積（μL） （1X反応）
   BigDye	0.3
   BigDyeバッファ	2.1
   プライマー	2.6
   合計	5.0

   シーケンス1反応に必要な、表3。試薬量。
   *注意：各プライマーのための別個のミックスを準備する。
   **注意：シークエンス反応で使用されているBigDyeバッファは次のように調製することができます。ミックスTrizma塩酸緩衝液（1 M）液（pH9.0）と塩化マグネシウム中に0.125 mLの（1 M）の17.5 mLの。試薬グレード水で100mlに最終的なボリュームをもたらす。これは、2〜8℃で保存してください。
3. 3.3からの計算を使用して、シーケンシング反応を準備する5秒以内のための各プライマーと渦のためにミックス。 0.2mlのストリップチューブに分注し。
4. マルチチャンネルピペットを使用して適切なプレートのウェルに反応ミックスをシーケンシングのアリコートを5μL。キムワイプとシーケンシング反応ミックスの入ったプレート（s）をカバーし、脇に置きます。
5. 残りのPCR産物にバクスター滅菌水180μLを加えることにより増幅されたPCR産物の1時15倍希釈を準備します。
6. 適切なプレートのウェルの底に希釈サンプルのピペット1μLは、ピペットチップを変更してください。
7. サンプルの転送が終了したら、1秒間のストリップキャップと渦とのプレートをシール
8. 遠心機でプレートを置きます。 145グラムに速度を設定し、回転速度が145グラムに達すると、スピンを停止する。
9. 次のプログラムに設定されてサーモ（s）でプレートを置きます：25サイクル（10秒@ 96℃、5秒@ 50 ° C、55秒@ 60 ° C。。。）ボリュームがあるべき少なくとも6μL 。サイクルは約1.2時間を取る必要があります。

降水量に進んでください

6。降水量：

シークエンシング反応後のウイルスのcDNAを" - クリーンアップ"に、95％エタノールを用いてエタノール沈殿を行う。

1. クラーからプレートを取得し、ポストアンプにもたらすficationの部屋。
2. ストリップのキャップを取り外し、きれいなペーパータオルまたはキムワイプ上の順序で配置。
3. よく各試料の側面にワーキングEDTA -酢酸ナトリウム溶液のピペット4μL。やさしくEDTA -ナトリウム溶液がウェルの底面に収まること板をタップします。彼らは井戸の底に試料を接触しないように同じヒントを限り使用することができます。
   *注：作業EDTA -酢酸ナトリウム溶液は次のように調製することができます。
   1. 試薬グレードの水の1 Lの酢酸ナトリウムの246.1グラムに溶解して3M酢酸ナトリウムを準備します。 0.45マイクロフィルターを通してソリューションをフィルタリングし、50mLのアリコートを準備。
   2. 酢酸ナトリウム（3 M）とEDTAの溶液（500 mM）をpH8.0の等量を混合することによって株式EDTA -酢酸ナトリウム溶液（1.5 M NaOAc、250mMのEDTA）を準備する。
   3. 試薬グレードの水（10mL + 30mL）中の三つの部分でEDTA -酢酸ナトリウム溶液の一部の株式を混合することにより、EDTA -酢酸ナトリウム溶液を作業の準備。
4. ピペットでサンプルウェルの反対側に上に冷やした95％エタノール40μlのとストリップのキャップを交換してください。
5. キャップと渦10秒間プレートをシール。気泡を取り除くために、プレートをタップします。
6. 30分、2時間の最大値の最小値まで-20℃で冷凍庫にプレートを置きます。
7. 1. 降水量が発生した後、3700 rpmで20分間遠心分離機に冷凍庫や場所からプレートを取り外します。
   2. それが変性する前に解凍できるように、冷凍庫からこんにちは - ジホルムアミド（アプライドバイオシステムズ社）の適切な量を削除します。
   *注：完全な96ウェルプレートの変性は、HiDiホルムアミドの960μLが必要ですので、それは事前に〜1.1mLアリコートを準備するのが有利である。
8. プレートを回転した後にストリップのキャップを取り外して廃棄します。廃棄物の容器（例えば、ごみのビン）を介してプレートを逆さにして上清をデカントする。ペーパータオル上で逆さプレートをブロッティングにより、残りの上清を取り除く。
9. プレートの表面に紙タオルや場所の2枚を折る。それは145グラムに達したときにスピンを停止、145グラムで遠心し、スピンのプレート下向きに置きます。
10. 遠心機からプレートを取り外し、井戸が空であるかを確認してください。井戸に冷やした95％エタノールをピペットで155μL。
11. 廃棄物の容器とペーパータオルの上でブロットに上清を捨て、4.10に遠心操作を繰り返します。
12. 遠心機からプレートを取り外す際に、使用されてペーパータオルを破棄し、プレートが残っているエタノールが蒸発するように2〜5分間顔を放置。

変性に進んでください

7。変性

1. マルチチャンネルピペット用の十分な大きさの容器に融解HiDiのホルムアミドをデカントを取得、
   *注：として6.7bに記載され事前に分注し、対策を使用する場合は、つのチューブが実行されるように各96ウェルプレートが必要です。
2. マルチチャンネルピペットを使用して、空のものも含め、プレート上のすべてのウェルにHiDiホルムアミド10μlを配布する。
3. シールを形成する隔壁のマットとプレートをカバーしています。
4. 2分間90℃でサーモにプレートを置きます。
5. 変性に続いて、シーケンサにロードして、プレートホルダーにプレートを配置。準備シーケンスのレイアウトをアップロードします。プレートは、シーケンシングの実行を実行する前に最大1週間までは-20℃に保つことができる。

8。ベースコールソフトウェアを使用して結果のデータを分析する。

1. 人の手を介さずに呼び出す自動ベースを実行するリコールを使用して、単一のプライマーの適用範囲は、許容範囲です。リコールは、次のURLで見つけることができるカスタムベースコールソフトウェアです。http://pssm.cfenet.ubc.ca/
   *注：アカウントはログインが必要です。アカウントを設定するには、ログインページで"登録"ボタンをクリックしてください。一度アカウントがアップロードページにアクセスすることが作成されています。
2. ログインしているときは、アップロード用のサンプルファイルを選択することができます。最大20MBのアップロードとアップロードのために、あなたの生の配列データを見つけることができるBrowse]オプションを使用。
   *注：。。。ウェブリコールのみZIP、tarやtar.gzファイルにABIとSCFファイルとしてデータファイルを受理する
3. アップロードするファイルを選択したら、あなたの参照のシーケンスを選択してください。このケースでは、参照配列に設定されていることを確認"V3。"これで、クリックする準備が整いました"プロセスデータを。"
4. 処理されたデータは、見出しの下にページの右側に表示されます。"過去のサンプル。"処理された各実行したり、サンプルセットは、日付のラベルが付いたフォルダに配置されます。これらは、"名前の変更"ボタンをクリックして、再度ラベルを付けることができます。
5. フォルダをクリックすると、サンプルの一覧が表示されます。赤いされているものは、失敗している。緑色であるものが経ちました。特定のサンプルと、"View"ボタンをクリックすることで、シーケンスを確認することができます。 throuをナビゲートするページの右側に表示される指示に従いますGHシーケンス。
   *注意：この方法では、それは、手動による介入なしで、自動的に（緑で表示）のリコールを渡すシーケンスをエクスポートすることは可能です。
6. 結果に満足している場合はクリックして、渡して配列をダウンロードすることを選択できます"ダウンロードを。"ファイルはzip形式のフォルダにダウンロードされます。
   *注意："設定"の下に、ファイルタイプなどのダウンロードや電子メールのオプションを、選択することができます。
7. きれいな三連のシーケンスを生成するために失敗したサンプルは、抽出物から三重に再増幅されるべきである。 RePCRがきれいなシーケンスを提供するために失敗した場合は、2配列の最小値は、親和性の推論に使用するために許容される。

9。 Geno2pheno共同体のアルゴリズムを使用して、人口ベースのシークエンシングによって生成されたシーケンスからウイルス親和性の推定。

1. http://coreceptor.bioinf.mpi-inf.mpg.de/index.php：シーケンスは次のURLでgeno2phenoコレセプターのサービスを介して実行することができます。
2. アップロードするサンプルを見てフィットのようにラベルを付けることができます。重要性の設定のドロップダウンメニューから、"（2％と5.75パーセントのFPR）動機から臨床データの分析に基づいて最適化されたカットオフ"を選択します
3. 分析のためのシーケンスをアップロードまたは貼り付けを選択し、FASTA形式のファイルは許容です。
4. geno2pheno FPRは、次のように解釈することができます。G2P FPRは> 5.75は、R5 -用いたウイルス集団の代表である、CCR5拮抗剤に反応する可能性G2P FPR <5.75、非R5ウイルス集団の代表である、CCR5拮抗剤に反応性は低い。 G2P <2 CCR5拮抗薬への応答を持つことはほとんどありません。サンプルからの3つのシーケンスのいずれかが非R5ように推論される場合は、患者はCCR5拮抗薬に反応する可能性はありません。

10。代表的な結果

プロトコルが正しく実行される時に、ひとつは正常にシーケンスに2または3の各サンプルのreplicateを期待してください。サンプルと一緒に実行ネガは、RNAの兆候はないはずです。シーケンスの大半は、リコールによってbasecalling"渡す"必要があります。

コミュニティウイルス集団内のR5と非R5の分布に基づいて、ランダムに選ばれた患者の試料の大部分はウイルスをR5 -使用していると予想される。プロジェクトの設計が特に示唆するそのため場合を除き、一つは非R5のサンプルよりもR5を持っていることが予想されます。

表1。）ワンステップRT - PCRおよびRT - PCR反応を行うために必要なB）サーマルサイクラーのプログラムの1反応に必要な試薬容量。

A）

試薬	体積（μL） （1X反応）
DEPCは水を扱わ	10.56
2 ×反応バッファー	20
50％のスクロース及び0.04％ブロモフェノールブルーミックス	4
フォワードプライマーSQV3F1	0.32
プライマーCO602を逆に	0.32
酵素 - スーパースクリプトIIIワンステップRT - PCRシステムプラチナTaq DNAポリメラーゼと	0.8
合計	36

*注：
SQV3F1プライマー配列：5'GAG CCA ATT CCC ATA CAT TAT TGT 3'
CO602プライマー配列：5'3 GCC CAT AGT GCT TCC TGC TGC TCC CAA GAA CC'

B）

サイクル数	タイム	温度
1	30分	52 ° C
1	2分	94 ° C
40	15秒	94 ° C
	30秒	55 ° C
	1.5minutes	68 ° C
1	5分	68 ° C

表2）1回目のPCRの反応と第二ラウンドのPCR反応を行うために必要なB）サーマルサイクラーのプログラムに必要な試薬容量。

A）

試薬	体積（μL） （1X反応）
DEPCは水を扱わ	13.45
60％ショ糖、0.08％クレゾールレッドミックス	2
ロシュHiFiシステムバッファ2	2
のMgCl 2	0.8
のdNTP	0.16
フォワードプライマーSQV3F2	0.15
リバースプライマーCD4R	0.15
ハイファイ酵素を展開	0.29
合計	19

*注：
SQV3F2プライマー配列：5'3 AT TGT GCC CCA GCT GGT TTT GCG"
CD4Rプライマー配列：5'TAT AAT TCA CTT CTC CAA TTG TCC 3'

B）

サイクル数	タイム	温度
1	2分	94 ° C
35	15秒	94 ° C
30秒	55 ° C
1分	72 ° C
1	7分	72 ° C

表3。）1シークエンシングの反応やシークエンシング反応を実施するために必要なB）サーマルサイクラーのプログラムに必要な試薬容量。

A）

試薬	体積（μL） （1X反応）
BigDye	0.3
BigDyeバッファ	2.1
プライマー 前方にV3FO2F 逆SQV3R1	2.6
合計	5.0

*注意：プライマーを結合しないでください。別個のミックスはそれぞれのプライマーのために準備する必要があります
V3O2Fプライマー配列：5'AAT GTC AGY ACA GTA CAA TGT ACA C 3'
SQV3R1プライマー配列：5'GAA AAA TTC CCT TCC ACA ATT AAA 3'

B）

サイクル数	タイム	温度
25	10seconds	96 ° C
5秒間	50 ° C
55seconds	60 ° C

ディスカッション

ここで紹介する方法は、トロピズムのテストに適用される標準的なシーケンシング法です。ウイルス親和性を予測するための順序HIVエンベロープV3ループの臨床応用は遅れて限定されているまで。このメソッドは、最低でも臨床的に使用される他、検証アッセイと比較してウイルス親和性を予測することも同様にできるように、マラビロック（Viivソフトウェアヘルスケア）の臨床試験のレトロスペクティブ分析では、示されている。

親和性の予測のためのV3ループの遺伝子型解析を行うために多くの利点があります。まず第一に、この手順を大幅にアクセシビリティを向上させ、親和性のテストの所要時間を削減、運用シーケンシング装置でどんな施設で行うことができます。比較では、親和性試験のためのゴールドスタンダードとなってきた表現型の強化された感度のTrofileアッセイ（ESTA）（モノグラムバイオサイエンス）は、南カリフォルニアに1拠点で実施される。その他の利点は、以下の出発材料と500copies/mLの最低限必要な血漿中ウイルス量の要件が含まれています。同様に、遺伝子型分析を実行するの運用コストは、表現型アッセイのものに比べて相対的に低くなっています。特にリコールのソフトウェアの使用は、遺伝子型解析の労働集約的な部分になりがちマニュアルシーケンスの見直し、必要がなくなります。

ここで紹介する方法は重要で、別のoutweighingなく特定のステップで、非常に簡単です。我々は、PCRを実行すると、サンプルのウイルス集団内でのキャプチャ少数の種のオッズを向上させるために三重にシーケンシングを示唆している。 3以上がしかし、私たちが発見した、実行可能な複製は、効率的で信頼性の両方に三連。我々はまた、高い感度と特異性を維持しながら、同じ反応で、RT - PCRと第一ラウンドのPCRの両方を実行するワンステップ逆転写PCRキット（キアゲン）を使用することをお勧めします。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
RNA extraction using NucliSens easyMAG version 1.0
NucliSens easyMAG Magnetic Silica	bioMerieux	cat. # 280133	(48 x 0.6 ml)
NucliSens easyMAG Lysis Buffer	bioMerieux	cat. # 280134	(4 x 1000 ml)
NucliSens easyMAG Extraction Buffer 1	bioMerieux	cat. # 280130	(4 x 1000 ml)
NucliSens easyMAG Extraction Buffer 2	bioMerieux	cat. # 280131	(4 x 1000 ml)
NucliSens easyMAG Extraction Buffer 3	bioMerieux	cat. # 280132	(4 x 1000 ml)
NucliSens easyMAG version 1.0	bioMerieux
Class II A2 biological safety cabinet
One-Step Reverse Transcriptase PCR and Second Round PCR
DEPC-treated water	Ambion	cat. # 9922
SuperScrip III One-Step RT-PCR System with Platinum Taq High Fidelty	Invitrogen	cat#12574-035	Kit components used: - SuperScript III RT/ Platinum Taq High Fidelty Enzyme Mix - 2X Reaction Mix (a buffer containing 0.4mM of each dNTP, 2.4mM MgSO4)
Expand High Fidelity PCR System	Roche Group	cat. # 1 759 078	Kit components used:- Expand High Fidelity Buffer 10X conc. with 15 mM MgCl2 (lids labelled 2)- Expand HF PCR Enzyme Mix (3.5U/μl)- MgCl2 Stock Solution (25mM) (lids labelled 4)
dNTPs: dATP, dGTP, dCTP, dTTP	Roche Group	cat. # 11969064001	(100 mM)
Sucrose	Sigma-Aldrich	cat. # S0389-500G
Bromophenol blue sodium salt	Sigma-Aldrich	cat.# B5525
Cresol Red	Sigma-Aldrich	cat.# 114472-5G	indicator grade
Thermocycler
Gel Electrophoresis
50X TAE buffer	Invitrogen	cat. # 24710030	(1000 ml)
SYBR Safe DNA gel stain	Invitrogen	cat. # S33102
Agarose (ultra pure)	Invitrogen	cat. # 15510-027
E-Gel Low Range Quantitative DNA Ladder	Invitrogen	cat. # 12373-031
Reagent Grade Type II water
Gel apparatus
Sequencing
ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit	Applied Biosciences	cat. # 4337458	(25000 reactions)
Hi-Di Formamide	Applied Biosciences	cat. # 4311320
Sodium Acetate (NaOAc)	Sigma-Aldrich	cat. # S-2889
EDTA	Sigma-Aldrich	Cat.# 03690-100ML	0.5M, pH=8.0
TRIZMA Hydrochloride Buffer Solution	Sigma-Aldrich	cat. # T-2819	1 M, pH 9.0
Magnesium Chloride (MgCl2)	Sigma-Aldrich	cat. # M-1028	1 M
95% Ethanol
Running Buffer (10X) with EDTA	Applied Biosystems	cat. # 4335613	500 mL
Polymer Pop-7 (25mL) Or Polymer Pop-7 (10mL)	Applied Biosystems	cat. # 44363929 or cat. # 4352759
3700/3730 BigDye Terminator v3.1 Sequencing Standard Kit	Applied Biosciences	Cat# 4336943
Thermocycler
Centrifuge with plate holders
3730xl DNA Analyzer	Applied Biosciences