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Method Article
我々はマウス胚組織における組織特異的遺伝子発現の開始中または後に組織特異的遺伝子に要因の相互作用を識別するために、クロマチン免疫沈降(ChIP)法を示しています。それは正常な胚発生時に発生するとして、このプロトコルは、組織特異的遺伝子の活性化の研究に広く適用可能であるべきである。
クロマチン免疫沈降(ChIP)はタンパク質を識別するための強力なツールです:1-3生きた細胞のコンテキストで発生するクロマチンの相互作用。この手法は、広く一次組織で、組織培養細胞の中で利用し、より少ない程度にされています。特に開発の早い時間にげっ歯胚組織、チップのアプリケーションは、組織の限られた量と胚の細胞と組織型の不均一性によって複雑になる。ここでは、解離胎生8.5(E8.5)の胚を用いてChIPを行うための方法を提示する。クロマチンの相互作用:単一のE8.5胚からの断片化クロマチンは、コントロールおよび特定の蛋白質の調査のための調査員に十分な材料を可能にするfiveアリコート、するに分けることができます。
組織特異的遺伝子発現プログラムの仕様中にクロマチンの相互作用:我々は、タンパク質を文書化し始めるためにこのテクニックを利用してきた。すべての相互作用が発生するかどうかといった区別なく、クロマチンの相互作用、のサブセット、または単セルのタイプ(S):結果は、タンパク質の検出であるため、胚の細胞型の不均一性は、必ずしもこの手法の適用を制限する。しかし、組織特異的遺伝子発現の開始時または、以下の組織特異的遺伝子の検査は、2つの理由で実現可能です。最初に、組織特異的因子の免疫沈降は、必ずしも要因が発現する細胞の種類からクロマチンを分離します。遺伝子の活性化に関連付けられている第二に、コアクチベーターとヒストンの免疫沈降を含む翻訳後修飾は、遺伝子と遺伝子がされているか、アクティブ化された細胞のタイプの遺伝子調節配列で発見されるべきである。テクニックは、ほとんどの組織特異的遺伝子の活性化のイベントの調査に適用可能であるべきである。
後述の例では、我々は、骨格筋特異的遺伝子のプロモーターにおける結合因子を調べるためにE8.5及びE9.5のマウス胚を利用した。体幹と四肢の骨格筋が形成する元となる前駆組織である体節は、、E8.5 - 9.5 4,5で存在している。 Myogeninは、骨格筋の分化6月9日に必要な調節因子である。データはmyogeninがE8.5とE9.5の胚においてそれ自身のプロモーターに関連付けられていることを示しています。 myogeninが唯一の開発6,10のこの段階で体節で表されているため、データはそれ自身のプロモーターとmyogeninの相互作用は既にE8.5胚における骨格筋の前駆細胞で発生したことを示している。
1。胚の単離
注 :マウスを含むすべての操作が適切な動物のケアと使用ポリシーとプロトコルに従い実施すること
2。隔離された胚の均質化
3。クロスリンクしたクロマチン
4。超音波処理
5。事前にクリアし、免疫沈降
6。クロマチンタンパク - ビーズ複合体を洗う
バッファ1:低塩の洗浄緩衝液(20mMトリス- HCl(pH 8.1)、2mMのEDTA、1%トリトンX - 100、
150mMのNaCl及び0.1%SDS)、1ミリリットル× 2回洗浄。
バッファ2:高塩の洗浄緩衝液(20mMトリス- HCl(pH 8.1)、2mMのEDTA、1%トリトンX - 100、
500mMのNaCl及び0.1%SDS)、1ミリリットル× 2回洗浄。
バッファ3:塩化リチウム(LiCl)の洗浄緩衝液(10mMのトリス- HCl(pH 8.1)、1mMのEDTA、1%IGEPAL - CA630、
0.25 M塩化リチウム、1%デオキシコール酸(ナトリウム塩))、1ミリリットル× 1洗浄。
バッファ4:TE緩衝液(10mMトリス- HCl(pH 8.1)、1mMのEDTA)、1ミリリットル× 2回洗浄。
7。クロマチン - 抗体複合体の溶出
8。クロスリンクを逆にしてDNAを回収する
9。回収したDNAの解析
10。代表的な結果
我々は、E8.5とE9.5の胚(図2)の両方からChIPを行うためにこのプロトコルを使用している。結果はmyogeninがE8.5とE9.5の胚におけるmyogeninプロモーター上に存在していることを示している。沈降精製DNAは、従来のPCR(図2A)および定量的リアルタイムPCR(図2B)によって分析した。これとは対照的に、myogeninが発現していない卵黄嚢、のmyogeninプロモーターへの結合myogeninの兆候はなかった。インターフェロン-γ(IFNγ)myogenin結合部位に一致するシーケンスが含まれているプロモーターは、負のシーケンス制御として使用された。予想通り、myogeninは、テストされた組織サンプルの任意のIFNγプロモーターに結合されていませんでした。骨格筋の前駆体である、、E8.5および9.5胚では、myogeninは、特に体節(6,10図3)で表されます。したがって、結果はmyogeninがE8.5とE9.5での体節にmyogeninプロモーターに結合していることを示している。
図1。E8.5胚の解剖。 ()絶縁子宮角(上部パネル、下部のパネルに示すように高い倍率)。 (B)子宮角は、個々の胚を含む個々の着床部位を分離するためにはさみで切る。 (C)胚は、解剖時の子宮組織から突出。矢印は、まだ余分な胚組織で覆われた胚をマーク。同じごみから(D)二E8.5胚。左の胚は回転のプロセスを開始していません。右側の胚は回転を受けています。右端 - 代表E9.5の胚。
図2。ChIPアッセイがE8.5とE9.5の胚におけるmyogeninプロモーターへの結合myogeninを示す。 myogenin抗体や非特異的IgGは転写の開始部位に-79から69の相対的にmyogeninプロモーターの部分を増幅するプライマーを使用して実行されたを使用してChIPの実験から精製したDNA5μlの中(上)従来のPCR解析その-12転写開始部位の〜1075塩基対上流に位置するmyogenin結合部位に一致するシーケンスが含まれているIFNγプロモーターの部分を増幅するプライマーに位置するmyogenin結合部位が含まれています。使用されるIFNγのプライマー配列は、5' - GCT GAC TCA AGA CCC CGA GGC - 3'および5' - TGA GGA TGG GGC AGG AGG CC - 3'であった。 ()で使用したのと同じサンプルの(下)定量的リアルタイムPCR解析。市販標準偏差 - データが入力+ /の%としてプロットされます。
図3。Myogeninが特にE8.5及びE9.5の胚の体節に発現している。 myogeninのin situハイブリダイゼーション全体のマウントは、体節内の特定のmRNAの発現を示しています。 200μm程度 - E8.5画像のサイズのバー。 E9.5画像のサイズのバー - 500μmの。
説明したChIPのプロトコールでは、我々は、筋原性レギュレータmyogeninが単一のE8.5及びE9.5の胚に存在する骨格筋の前駆体の組織におけるmyogeninプロモーターに関連付けられていることを示している。先行研究では、広範囲にin vitroでのゲルシフト実験の初期にはin vitroで翻訳や細菌生産myogeninと11月20日標的遺伝子の調節配列の該当する部分をコードする放射性標識DNA...
この作品は2009年のアメリカの回復と再投資法を通じて授与資金を含むANI、、とNIH R01 GM87130でたたくのNIH R01 GM56244によってサポートされていました
Name | Company | Catalog Number | Comments |
ChIP Assay Kit | Upstate, Millipore | 17-295 | |
Collagenase Type II | Invitrogen | 17101015 | Dilution by 1 x PBS |
Dulbecco’s modified eagle medium (DMEM) | GIBCO, by Life Technologies | 12100-061 | High glucose content |
Dulbecco’s phosphate buffered saline 1X (DPBS) | GIBCO, by Life Technologies | 14190-144 | Calcium chloride free, Magnesium chloride free |
Fetal bovine serum (FBS) | Mediatech, Inc. | 35-010-CV | |
Gel extraction kit | QIAquick | 28704 | 50 reaction kit |
Penicillin/streptomycin stock solution | GIBCO, by Life Technologies | 5000 μg/ml concentration | |
Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | |
Salmon sperm DNA /Protein A agarose | EMD Millipore | 16-157 | |
myogenin antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-576 | |
Normal rabbit IgG | EMD Millipore | 12-370 | |
Platinum PCR Supermix | Invitrogen | 11306-016 | |
GoTaq Q-PCR master mix | Promega Corp. | A6001 |
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