アルツハイマー病のマウスモデルにおける神経突起斑の検出

要約

ADの病理学的特徴の一つは、アミロイドβ蛋白質の正の神経突起斑の形成である。 ABCとDAB法とチオフラビンS染色法を用いて蛍光検出を用いて免疫組織化学的検出：このプロトコルでは、トランスジェニックADのモデルマウスの老人斑を検出するために2つの方法について説明します。

要約

アルツハイマー病（AD）は認知症につながる最も一般的な神経変性疾患である。老人斑の形成は、アルツハイマー病の病理学的特徴の一つです。老人斑の中心的なコンポーネントは、β-セクレターゼとγ-セクレターゼによるβ-アミロイド前駆体タンパク質（APP）の連続したタンパク質分解切断に由来する小さな糸状のタンパク質と呼ばれるアミロイドβタンパク質^{（Aβ）1、}です。アミロイド仮説はAD病理²の基本的な毒性機序としてプラークをAγ含有することが伴います。老人斑の存在の事後分析では、ADの診断が確定する。 ADの病因におけるAγ神経生物学の理解を促進するために、ヒトAPP遺伝子のAD関連変異を表現する様々なマウス系統を作製した。疾患の重症度に応じて、これらのマウスは、年齢別の老人斑を開発します。これらのマウスは、APPのプロセシング経路と老人斑の形成に影響を与える可能性のある病態と薬剤開発を研究するための貴重なツールとして機能します。このプロトコルでは、我々は、ADのモデルマウスの老人斑を特異的に検出する免疫​​組織化学的方法を採用しています。 ABCとDAB法とthiofalvin S染色法を用いて蛍光検出を用いて免疫組織化学的検出：我々は、特に半脳、パラホルムアルデヒド固定、cryosectioning、およびADトランスジェニックマウスに神経症プラークを検出するための2つのメソッドを抽出するから準備を説明します。

プロトコル

1。マウスの脳の固定およびcryosectioning

1. トランスジェニックマウスを断頭し、抽出された脳が続く、二酸化炭素のガスを使用して犠牲にされています。
2. 脳は、中央に縦方向に切開される。脳の半分は、生化学分析のためのドライアイスで凍結フラッシュになります。他は4℃、少なくとも48時間、4％パラホルムアルデヒド（PFA）℃で水没されます。
3. 少なくとも48時間、4％PFAで固定後、半球の脳を30％ショ糖溶液に直接転送され、4に配置℃に時点では、半球の脳は、ショ糖溶液に浮かんでされるべきである。半球の脳は通常約48時間を必要とする、底に沈んだときに、それはcryosectioning用OCTで埋め込むことができるようになります。
4. cryosectioningする前に、ノブにOCTの薄層をマウントし、-20℃で凍結することができます冷凍OCTの層の上に半球の脳と場所の他の部分から小脳を削除します。直ちにOCTで半球の脳をカバーし、徐々に-20℃で凍結することができます脳が不透明になっているのOCT包埋後は、区分する準備ができました。
5. 30μm以下の各セクションの厚さを設定します。 D' Olomosソリューションとコンテナに各スライスを収集する。

2。神経突起プラークの免疫組織化学手順（フリーフローティングセクション）

1. 15分間88％ギ酸中の各セクションを扱います。ギ酸処理した後、セクションでは、一時的に不透明に変わり、しぼむように見えることがあります。
2. 静かに撹拌しながら5分間、X 3はTx - PBS（0.3％トリトンX - 100 PBS中）を有するプレートと洗浄に各セクションを削除します。
3. ブロック内因性過酸化物は、0.5％のTx - PBS、室温でのH ₂ O ₂穏やかに振盪しながら30分をブロック。
4. 静かに振とうしながら10分X 3のTX - PBSでセクションを洗ってください。
5. 穏やかに振盪しながら1時間室温でのTx - PBSに溶解した5％無脂肪脱脂乳を持つブロックのセクション。
6. のTx - PBSで穏やかに振盪しながら℃で一晩4℃、5％の牛乳を含むで希釈した一次抗体のセクション（4G8をビオチン、1:500-1:2000、シグネット）をインキュベートする。
7. 静かに振とうしながら10分X 3のTX - PBSでセクションを洗ってください。
8. ABCのソリューションは、次の製造者のプロトコル（エリートABC、ベクターラボラトリーズ社を、）準備する。穏やかに振盪しながら30分間ABC混合物のセクションをインキュベートする。
9. 静かに振とうしながら10分X 3のTX - PBSでセクションを洗ってください。
10. 3,3' - ジアミノベンジジン四塩酸塩（DAB）（ベクターラボラトリーズ）以下の製造業者のプロトコールを準備します。 5〜10分間DABの混合物のセクションをインキュベートする。この時点で、茶色がかった色の各セクションでの開発を遵守します。
11. 静かに振とうしながら10分X 3のTX - PBSでセクションを洗ってください。
12. フリーフローティング脳切片は、組織の癒着を支援するため、ゼラチンコートしたスライド上にマウントされています。セクションは、その後、空気はキシレンのシリーズでクリアすることで、続くとEntellenにマウントされている乾燥させる。
13. プラークは、40X倍率で光学顕微鏡下で可視化し、各マウスのスライス当たりの平均プラーク数を評価することによって定量化されています。

3。神経突起プラークの検出のためのチオフラビンS染色手順

1. マウスの犠牲と脳の抽出手順は、セクション1.1から1.5に示されている。
2. スライドガラス上に4から5半の脳切片をマウントし、完全に染色する前に空気乾燥することができます。
3. 1分間70％エタノールでスライドを洗浄します。
4. 1分間80％エタノールでスライドを洗浄します。
5. 15分のためにフィルター（0.2μmのフィルター）チオフラビンS溶液（エタノールの80％で1％）でスライドをインキュベートする。 （チオフラビンS溶液は使用前にフィルタリングする必要がある）。注意：光からチオフラビンSを保護し、光から染色したスライドを保護する。
6. 1分間80％エタノールでスライドを洗浄します。
7. 70％エタノール1分でスライドを洗浄します。
8. 二回蒸留水で洗ってください。
9. 水性マウントメディアのマウントのスライドとスライドの明確なマニキュアでカバーガラスをシールに続いて、少なくとも2時間、暗所で乾燥させます。染色した切片を4℃で暗所に保管してください
10. 緑色蛍光染色されたプラークには、蛍光microscropyで可視化することができます。染色が時間とともにフェードアウトするので、一週間以内にスライドを分析する。

4。代表的な結果

老人斑の形成を抑制する抗てんかん薬や気分安定剤バルプロ酸（VPA）の有効性に関する我々の最近の研究では、我々は、ADのモデルマウス（3）の神経突起プラークを識別するために、上述の免疫染色し、チオフラビンS染色の手順を使用していました。図1は、抗Aβ使用してビオチン化4G8で染色し、ABCのメソッドを介して検出された、典型的な9ヶ月古いAPP23トランスジェニックマウスを表します。老人斑は明確抗体で標識され、白い矢印で示されている。チオフラビンS染色を使用して、我々は2ヶ月古いAPP23xPS TRA老人斑の沈着を検出nsgenicマウス（図2）。チオフラビンSバウンドAβ含有神経突起斑（白い矢印で示される）、蛍光顕微鏡下で緑色に表示されます。我々は、VPAの治療で、老人斑の形成が有意に（3）減少することを示した。別の研究では、我々は低酸素症およびADの病因の根底にある分子のリンクを学んだ。再び、4G8抗Aβ免疫組織化学染色およびチオフラビンS染色の両方を使用して、我々は低酸素症は老人斑を（4）を含むAβの形成を容易に発見。

図1。 ADトランスジェニックマウスにおける老人斑の形成の免疫組織化学的分析。9ヶ月歳の時にAPP23マウスは屠殺し、解剖した、固定し、切片。海馬での神経突起プラークは、抗Aβ抗体4G8を用いて検出したとABCとDABの方法を使用して開発されました。プラークは、40Xと光学顕微鏡により可視化した。白い矢印は、Aβ神経突起斑を指す。

図2。 ADモデル化されたマウスにおける神経突起斑のチオフラビンS染色。8週齢でAPP23xPS45ダブルトランスジェニックマウスを屠殺し、解剖した、固定し、切片。海馬での神経突起の災害は、チオフラビンS蛍光染色を用いて確認して40Xの倍率で顕微鏡により可視化されたされています。白い矢印は、チオフラビンS染色された神経突起斑を示している。

ディスカッション

ビオチン標識された4G8抗体の染色特異性を有するADモデル化されたマウスでは老人斑を用いて免疫組織化学。染色の結果は、定量化し、異なる治療群間でプラークの負荷の比較が可能になります。結果に影響を与える可能性があるいくつかの重要なステップがあります。半球の脳が頭蓋骨から抽出する前に潅流されていないため、注意が半球の脳への損傷を防止するために、抽出プロセス中に使用する必要があります。半球の脳が受動的に灌流されているのでまた、私たちは4で、少なくとも48時間を4％PFAでそれをインキュベート勧め° C前の30％ショ糖溶液中で水没する。また、transcardial灌流は脳を抽出する前に行うことができる。脳が正しく固定されている場合、それはゴムのような質感を持つ必要があります。脳が正しく固定されていない場合には、セクションでは、簡単にD' Olomosの溶液中でまたは染色手順の間に引き裂くだろう。

4G8モノクローナル抗体は、アミノ酸残基Aβの17から24への反応性であり、コア配列（VFFAE）のエピトープを認識した。 4G8はマウスの種から派生しているので、それはより高いバックグラウンド染色を与える傾向にある。従って、我々は、バックグラウンド染色を最小限に抑えながら、考慮事項は真の信号を達成するために指示された希釈でセクションをインキュベートすることを選んだ。

4G8抗体を用いて神経突起プラーク検出のための免疫染色に加えて、チオフラビンS染色法は、プラークを識別するために使用されます。チオフラビンSは、均質な染料の混合物であるスルホン酸とdehydrothiotoluidineのメチル化の結果である。チオフラビンSの非選択的にそのようなアミロイドのオリゴマーにあるような蛋白質のβシートの内容を、結合する。結合すると、チオフラビンはその発光スペクトルの特徴的なブルーシフトを受ける。逆に単量体の形態にチオフラビンS結合はブルーシフトを誘発せず、蛍光顕微鏡で検出することができませんでした。蛍光の強度は、アミロイド沈着物の少量の良好な可視化を可能にするとしてチオフラビンS染色ではアミロイドのための画面への迅速な代替手段を提供します。しかし、チオフラビンS染色に関する一つの欠点は、特異性の欠如です。このようなfibrinoids、硝子、ケラチン、などなどを含む広範なβシート、を含む他の多くの組織成分には、この色素のためではなく、親和性を持っている。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
試薬と機器の名称	会社	カタログ番号
パラホルムアルデヒド	シグマアルドリッチ	P6148 - 1KG
Polyvinylpyrrolidene	シグマアルドリッチ	PVP40 - 100G
スクロース	フィッシャーサイエンティフィック	S5 - 3
エチレングリコール	シグマアルドリッチ	324558 - 2L
組織- Tek社のOCTコンパウンド	桜	4583
88％ギ酸	フィッシャーサイエンティフィック	A118P - 500
トリトンX - 100	ICNのバイオメディカル	807426
H2O2	シグマアルドリッチ	H - 1009
ビオチンは、4G8抗体を標識	Cedarlane	SIG - 39240 - 500
エリートABCキット	ベクトル	PK - 6100
イムPACT DAB	ベクトル	SK - 4105
キシレン	フィッシャーサイエンティフィック	X4 - 4
Entellan	EM科学	65037〜71
Superfrost * Plusの顕微鏡スライド	フィッシャーサイエンティフィック	12-550-15
クライオスタット	ライカ	CM - 3050 - S
MX35プレミアミクロトーム刃	サーモサイエンティフィック	3052835
チオフラビンS	シグマアルドリッチ	T1892 - 25G