原子間力顕微鏡を用いた肺組織のマイクロメカニカル特性

要約

細胞外マトリックスの剛性が強く、接着細胞の複数の動作に影響を与えます。マトリックスの剛性は、組織全体に空間的に変化し、様々な疾患状態の修正を受ける。ここでは、原子間力顕微鏡のmicroindentationを使用して、通常と線維化マウスの肺組織における剛性の空間的な変動を特徴付けるための方法を開発する。

要約

マトリックスの剛性が強く^1月3日接着細胞の増殖、分化および機能に影響を与えます。マクロスケールでは、人体内の組織や臓器の剛性は、大きさ⁴の数桁に及ぶ。はるかに少ないが剛性が組織内で空間的にどのように変化するかについては知られており、適用範囲および剛性の変化の空間スケールは、組織リモデリングにおけるその結果、病気のプロセスにどのようなものさ。マトリックスの剛性の変化が健康と病気の細胞生理に貢献する方法をよりよく理解するには、常在する細胞に関連する空間的なスケールで得られた組織の硬さの測定が必要である。これは、肺のためにマトリックスのリモデリングは、喘息、肺気腫、高血圧や線維症などの疾患の顕著な特徴である高度に準拠しており、弾性組織は特にそうです。常在する細胞に関連する空間的なスケールで肺実質のローカル機械的な環境を特徴づけるために、我々が直接、原子間力顕微鏡（AFM）microindentationを使用して新鮮なマウス肺組織の局所弾性特性を測定する方法を開発した。 AFM圧子、カンチレバー、インデントの深さを適切に選択すると、これらのメソッドは、位相コントラストと関心領域の蛍光イメージングと並行して地元の組織のせん断弾性率の測定を可能にする。組織片の系統的サンプリングは、剪断弾性率の局部的な空間変動を明らかにする組織の機械的特性のマップを提供しています。機械的性質と基本的な解剖学と病理学的特徴間の相関は、剛性が線維化におけるマトリックスの沈着とどのように変化するかを示しています。これらのメソッドは、ローカル組織の機械的性質は、宇宙と病気の進行によって変化するか明らかにするために、他の軟部組織と病気のプロセスに拡張することができます。

プロトコル

1。肺組織のストリップの準備

1. 肺組織は、高度に準拠しており、AFMの特性評価のための短冊状にカットすることは困難です。一時的に、切断の肺の構造を安定化させる2％低ゲル融点アガロース（PBSで調製）を50 mL / kg体重を気管内に隔離されたマウスの肺を膨らませるためには、37℃に温めた気管を結紮すると4℃のPBS槽に膨らんだ肺を冷やす° Cで60分間。アガロースはゲルと優しくこの間隔⁵の間に肺の構造を安定化する空域に固くするだろう。高いアガロース濃度、すなわち、百分の3〜4は、さらに切断の組織の安定化を高めるために使用されることがあります。
2. 長さと幅5 × 5 mmおよび厚さ400μmのストリップにかみそりや手術用メスの刃でアガロース安定化マウスの肺組織を切断、その後、37に予め温めておいたPBS浴中にストリップを洗う° C 100 mlを使用して残留アガロースを除去するために5分間のベンチトップ加熱撹拌プレート上でガラスのビーカー。大規模な気道と血管を除外するには、主茎気管支から遠い胸膜下の領域からストリップをカット。気道と大型船がイメージングされる場合、主茎気管支へより近位の肺組織からストリップをカット。

2。 AFMのMicroindentationと蛍光イメージング

1. AFMのmicroindentationのための関心の領域を分離するために、組織は、位相差顕微鏡により可視化した、または免疫染色および蛍光顕微鏡により可視化することができます。室温で固定または透過せずに免疫染色のため、2時間、目的の二次抗体（PBS中）のソースから5％の血清でブロックの組織ストリップ。
2. 適切な一次抗体で組織のストリップをインキュベートする（例：ウサギ私は基底膜を可視化する間質コラーゲン（1:250希釈）、ウサギ抗ラミニン（1:250希釈）を可視化するために、抗コラーゲン）12ウェルプレートのウェルに1時間穏やかに振盪しながらロッカーに、1の蛍光タグ（例えばのAlexa Fluor ® 546ヤギ抗ウサギ二次抗体（1:250希釈））に結合した適切な二次抗体、続いて5分間PBSで各サンプルを3回洗浄室温で1時間。
3. 4℃でPBSでPBSに保存して広範囲に組織片を洗う° C
4. すぐにAFMの特性評価の前に、組織のストリップは、カバーの表面に均一に広がることを確認して、フローティング組織下からカバーを持ち上げて、ポリ- L -リジンコートした15mmのカバースリップに組織のストリップを取り付けます。必要に応じて、サンドイッチストリップ場合第二クリーン、コーティングされていないカバー付きとポリ- L -リジンコートしたカバースリップに組織のアタッチメントを支援するために穏やかな圧力を適用する。
5. microindentation実験の各ラウンドの直前に製造の命令を以下のAFMシステムを校正。 、実際のカンチレバーのたわみの距離にフォトダイオードの出力信号をスケーリングするために使用されるパラメータであり、2）カンチレバーの偏向感度、、Δdを1）カンチレバーの空気⁶の熱ゆらぎの方法を使用してバネ定数：2つの重要なパラメータを決定する。その後、力 - 変位曲線（図1b）の傾きを計算する清浄なガラススライド上にPBSで標準的な力 - 変位曲線を取得することにより、偏向感度を校正します。先端の変位、ΔZの関数として監視カンチレバーのたわみ、ΔD、と、力 - 変位曲線の測定では、AFMの先端が向かって拡張され、単一の場所で試料表面（XY方向にラスタなし）から退避。

我々は、5μmの直径ホウケイ酸球状の先端（Novascan）と窒化ケイ素の三角形カンチレバーを使用することをお勧めします。 0.06 N / mのばね定数と原子間力顕微鏡のプローブを使用して、我々は機械的に100〜50,000 Paをスパニングせん断弾性率と柔らかな素材を特徴付けている。

6. ティッシュペーパーとサンプルのカバーグラスの底部表面を拭く、真空グリースを標準ガラススライドに固定し、AFMの試料ステージ上にスライドガラスをマウントし、そして500μlのPBS（室温）を有する組織をカバーしています。
7. 顕微鏡の試料ステージを調整することによって、視野の中心にAFMの先端を揃えるために表示するアイピース用の顕微鏡を設定します。 AFMの試料ステージを移動させることにより、組織上の関心領域を選択し、必要に応じて、位相コントラスト画像および/または組織の蛍光画像を記録するための表示CCDカメラに切り替えます。
8. それがサンプルと接触するまでゆっくりと下方向にAFMチップを移動することによって、標準的なAFMの婚約の操作を実行します。
9. 柔らかい試料の正確なAFMのmicroindentationの特性評価は、小さな字下げの深さは弾性率の計算に使用ヘルツモデルを無効に大きな局所ひずみを避けるために必要です。大きなひずみを避けるために、500nmのカンチレバーの最大たわみ（トリガーポイント）を設定することにより、トリガモードでインデントを行います。このたわみの制限は抑制される最大押込み力に30未満NN（F =カンチレバーのバネ定数*の変位、またはF _最大 = 0.06 NN / nmの*は500nm = 30 NN）。

インデントの速度は、柔らかい試料⁷の弾性ではなく、粘弾性特性を探求するために十分に遅くなるように選択されるべきである。毎秒20から20程度の速度の範囲は、肺組織に適しています。

10. 関心の領域から単一の測定では、興味のある場所にAFMプローブを移動し、標準的な力 - 変位曲線を（プローブがXYスキャンすることなくZ方向にのみ移動する）を収集するために、単一の字下げを行います。
11. 関心領域の自動マッピングについては、フォースマップのモードに切り替え、選択した領域内にスキャンサイズとサンプルポイントを選択します。フォースマップモードでは、AFMチップの字下げの動きとの間の試料表面間のラスタ、および、定義されたサンプルの格子内の各ポイントで個々の力 - 変位曲線を収集します。より多くのサンプリングポイントは、より高い空間分解能を提供しますが、マッピングに必要な時間が長くなります。我々は、それが実用的〜10分で完了することができる1秒間に20μmのインデントの速度で80 ×80μmの領域をマップするために16 × 16サンプルのグリッドを使用することがわかった。

3。 AFMデータの抽出

1. ヤング率を計算するには、非線形曲線を描くフィッティング^8（図1、C）最小二乗法を使用してヘルツ球状インデントのモデルへの力-変位曲線を近似します。
   
   ここで、F = K _C *Δdが 、カンチレバーを曲げる力であり、k _cは定数カンチレバーのバネであり、Rは球の先端の半径、δ=ΔZ - Δdは字下げで、υは、サンプルのポアソン比（ですυ=肺組織⁹の0.4）。
2. フィットの質を評価するために、非線形カーブフィッティング中に、SSRの値、またはデータと近似値の差の二乗和を計算する。大規模なSSRの値を持つ"悪い"の曲線からのデータを廃棄によって信頼性または非解釈測定値を排除する。
3. 必要に応じて、弾性率（E）は関係がE = 2 ×（1 +υ）× G.、等高線マップのプロットの係数データを強制的にマップモードで収集された剛性の空間パターンを可視化するために使用して、せん断弾性率（G）に変換する（16 × 16サンプルのグリッドの例は、80 ×80μmの領域をカバーする）。
4. フォースカーブの大量のデータ、カスタムのアルゴリズムを処理するために自動的に力 - 変位曲線に合うように書き込まれる可能性がある、3.2と3.3（例：Matlabの）で概説と同じ手順とパラメータを使用して弾性率、および/またはプロットelastographsを抽出する。

図1（a）球状プローブを（Dimitriadis E.、ら、2002 Biophys J ⁸から許可を得て複製）を使用してリジッド基板上に柔らかい試料のAFM microindentationの回路図。 （B）代表の力 - 変位曲線は、カンチレバーの偏向感度を決定するためにPBSで清浄なガラススライドから収集。 （C）代表の力 - 変位曲線は、（）から対応するパラメータを示す（青）、ソフトと硬い（赤）のサンプルから収集。

4。代表的な結果：

図2Aは、直接関心領域上記の代わりにAFMプローブを含むPBSでポリ- L -リジンコートしたカバースリップに接続されているとmicroindentationマッピングの準備ができて肺実質のストリップを示しています。図2Bは、適切にカットし、染色された組織で、肺実質の肺胞のマイクロアーキテクチャは、同様に固定または透過せずに基底膜成分のラミニンのための免疫蛍光染色によって観察、保存されていることを示しています。コラーゲン線維症^10を誘導するために以前にPBS（図2C）で処理したマウスから採取、またはブレオマイシン（図2D）で治療された新鮮な未修正の肺で、私は図2のCDショー免疫蛍光染色。

図3Aは、AFMのmicroindentationから得られた試​​料の力 - 変位のプロットを示しています。同じ応用力と、探針は小さいインデントと硬めの地域のための"急"の力 - 変位曲線に対して相対的に"平坦な"力 - 変位曲線で、その結果、ソフトな地域（青線）に大きなインデントを生成します（赤の線）。クリーンなフォースカーブを得るために、各インデントの後に探針は、次のインデントの前に試料表面との接触の無料から完全に退避する必要があります。この非接触状態では、先端がカンチレバーのたわみなしで変換する図3A、の曲線の平坦な領域に対応しています。図3Bは、先端が完全に試料表面から退避されていない場合（例えばソフトのサンプルが発生した平坦な領域がない典型的な偽の曲線を示しています。それが不可能な接触点を決定すること）の先端にttaches。先端が完全にソフトなサン​​プルの中に閉じ込めている場合は、図3Cに示すように、曲線は、明確なたわみが小さく、ノイズなし、見える​​場合があります。

図4は、剛性のマップ（elastographs）、せん断弾性率を有するカラースケールとして空間的に表示された力 - 変位曲線から抽出されたせん断弾性係数のデータを示しています。 Elastographsは特に線維化肺のサンプル内で印象的な正常の範囲と組織の剪断弾性率の分布の違い（図4A）と線維化（図4B）肺実質、およびせん断弾性係数の大きな空間的変動を、示す。

図2マウスの肺実質のストリップ上のAFMプローブを示す（A）位相差顕微鏡写真。スケールバーは50μm。 （B）正常マウスの肺組織におけるラミニンの免疫染色は、正常な肺実質の肺胞マイクロアーキテクチャを示している。白いボックスは、典型的な80で-80μmの弾性マッピング領域を示します。スケールバー：20μmである。生理食塩水（C）およびブレオマイシン（D）処理したマウスの肺実質におけるI型コラーゲンの（CおよびD）免疫染色。スケールバーは、100μmである。

図3（A）代表解釈力-変位曲線はそれぞれ、生理食塩水（青）とブレオマイシン処理した（赤）マウス肺実質から収集した。黒い線は、球状のヘルツのモデルに起因する最適であり、それらに対応する計算されたヤング率で標識されています。 （B、C）代表非解釈力 - 変位曲線。

図4。生理食塩水（A）およびブレオマイシン処理した（B）マウス肺実質から採取した代表elastographs。カラーバーは、キロパスカルのせん断弾性係数を示している。軸ラベルは、マイクロメートルの空間スケールを示している。スケールバー：20μm以下

ディスカッション

AFMのmicroindentationを使用して肺組織の機械的特性は、組織の硬さのマイクロスケールの変動にユニークな視点を提供する、前例のない空間分解能（図4）を提供しています。そのユーティリティの例として、正常および線維性肺組織のストリップで以前のマクロスケールの測定では、線維症^11,12とエラスタンスのおおよその2-3倍の増加を示した。対照的に、AFMのmicroindentationは、正常な肺組織¹⁰に観察された中央上の剪断弾性率の約30倍に増加するまでの展示の一部の地域で、その組織の硬化が高度にローカライズされて明らかにする。マトリックスの剛性が今批判的に細胞機能に影響を与えることが知られているように、これらのローカルの測定は、肺の細胞の細胞培養研究のbiofidelityを高めるために貴重なパラメータを提供します。

いくつかの実用的な問題は、肺組織の薄いストリップの使用によって生じる。組織プロファイルが基本的な肺胞のアーキテクチャを次のようにストリップの表面は、完全に平らではありません。試料表面の高さの変動がこの課題を克服するため、15ミクロンよりも小さい場合にAFMシステムが自動的にインデント時に、Z -方向の先端の位置を調整します。測定は室温ではなく37℃で行われているので、それらはマイナーであることが予想されるものの、温度のこの変化によって引き起こされる機械的特性の偏差は、評価できません。観測された機械的性質に関する基本的な肺胞の壁のアーキテクチャの影響は、現在の光学顕微鏡のセットアップを決定することは困難である。例えば、それはと整列または壁の面に対して横方向にインデントするときに肺胞壁の異方性とは異なる機械的性質を示すかどうかを判断することが望ましい。しかし、現在の標本は、厚さであり、イメージングシステムは、それが接触の各点で局所肺胞の壁の方向を決定することは不可能ですので、3D機能を持っていません。最後に、測定された機械的性質に及ぼす細胞成分の影響が完全に解明されていない。ここに詳述した方法では、何の努力は、特に組織の細胞成分を除去するために行われません。しかし、インデントに使用できる表面に存在する細胞は、組織の収穫と肺胞へのアクセスを得るために組織を切断する必要性からの経過時間が与えられれば生きていけることはほとんどありません。細胞を除去、または生存細胞を持つ行列を再設定、および組織の硬さで行われた変更を評価するために、特定の実験では、保証されているようだ。

新鮮未固定組織がこれらの測定に必要なため、測定するために組織の収穫からの経過時間を最小限に抑える必要がありますし、サンプルは℃で機械的性質の変化を避けるために、4℃で保存する必要があります。組織片を洗浄または最小の歪みや損傷が生成されるように染色中にコンテナ間で転送されるたびに特に注意を払う必要があります。液体のAFMアプリケーションの場合、重要なステップはできるだけフラット組織を切断し、サポートしているカバースリップ上で試料を固定化することです。利用可能な場合、ビブラトームまたは組織スライサーなどの自動切片マシンは非常に均一な厚さのスライスをカットするために使用することができます。 AFM測定の直前に組織片を接続し、サンプルが最終的にはカバーガラスからデタッチされるようにAFM測定のために経過時間を最小限に抑えることが重要です。一つの有用な観察は、より大きなストリップがスリップをカバーし、小さいストリップよりPBSでより長い時間のための場所にとどまることをより安定して取り付けるように見えるということです。

AFMのmicroindentationは5μm径の球状の先端が標準で0.06 N / mのカンチレバーを使用時は、100 Paから50kPaに（せん断弾性係数）に広い範囲にまたがるサンプルを特徴付けることができる。この範囲は、異なるばね定数とプローブを使用して拡張することができます0.01〜0.58 N / mの範囲の直径と春の定数で0.6から12ミクロンの範囲の球状のガラスの先端を持つAFMプローブは、市販されている（例えばNovascan）と一般的に^3を使用。 5μmの球状の先端に、先端部と組織の間に理論的な接触面積は、400から700 nmのインデント（図1A）のための5-9程度²です。小規模または大規模なヒントは、空間分解能の小さいまたは大きいスケールを提供するために使用することができます。ピラミッド型のヒントも小さい接触領域を提供するため、データのフィッティングは、このチップ形状のため、より複雑ですが、マッピングの空間分解能を高める、AFMのmicroindentation ^13-16使用されている。

この方法にはいくつかの制限に注意する必要があります。肺は、伝統的に機械的に圧力-体積の解析¹⁷または全体の肺のパンチ-インデント^19,20を使用してインスタンスのために、非侵襲的に特徴づけられている。そのような空気 - 液体intの損失によって重要な方法で肺のアーキテクチャを変更するここで説明したように侵襲的な方法通常は空気で満たされた肺と呼吸筋の弛緩により肺部分的インフレを維持するプレストレスの損失に存在erface。これらの制限は、肺組織のストリップ¹⁸に行われたすべての測定に共通です。注目すべきことに、しかし、正常な肺組織の実質（せん断弾性係数〜0.5kPa）で測定した中央値剛性は、安静時のボリューム^19,20における無傷の肺のパンチ-字下げに基づく推定値と大きく異なることはありません。肺組織が増加する変形と非線形硬化を示すことが知られているが、このプロパティは、ここで用いられる方法で、マイクロスケールにダウン続くかどうかを厳密な方法でテストすることは不可能です。ヘルツのモデルは、サンプルの均質性を前提としています。しかし、肺実質を含むほとんどの生物学的材料は、空間スケールを減少でますます不均一である。サンプルの不均一性は、すなわち変形さ層またはコンポーネントに応じて、インデントの深さに応じて、ヤング率の変化のようなアーチファクトが生じることもできます。 xy平面内の不均一性は、慎重にDimitriadis EK らが提案した生体材料の微細構造に応じて、適切な球状の先端のサイズを選択することによって制限することができます^。8これは、材料に起因するヘルツモデルのエラーを予測したり訂正したり、はるかに困難であるz方向の不均一性。 Azelogluら。最近、離散埋め込 ​​まれた介在物²¹で異種基板の弾性特性を特徴付けるためのハイブリッド計算モデルを提案した。彼らの新しい技術はヘルツ解析の限界を克服異種材料の包接特性を計算するために潜在的な手段を提供します。

生物学的材料は、通常、時間に依存する粘弾性挙動を表示しながらヘルツのモデルはまた、絶対的な弾性挙動を想定しています。組織の完全な粘弾性特性は、使用される字下げの速度を変化させることによって得ることができます。重要なのは、正常および線維性肺組織の以前のマクロスケールの機械試験は、肺組織の機械的特性の弱い周波数依存性を示し、そしてすべての周波数で正常および線維性組織の機械的性質の違いの保全は^、11をテストした。これらの知見は強くAFMを持つ単一のインデントの速度を用いて機械的性質の測定は、線維化に伴う組織の機械的特性の変化の本質的な側面を捉えたことを示唆している。

本研究で使用した肺組織のための0.4のポアソン比は、巨視的な測定⁹からです。残念なことに、ポアソン比のマイクロスケールでと疾患状態の下ですべての変更は文献では利用できません。 E、E /（1 ^-υ2）または（1 ^-υ2）/πEへの代替（弾性定数kを示す）として^、22は AFMのmicroindentationから計算し、ポアソン比が不明な場合に報告することができます。ほとんどの生体材料のためにポアソン比は、高含水率のために0.4から0.5の範囲である。範囲0.3から0.5の中で、係数1 /（1 ^-υ2）ポアソン比の合理的な変動が報告された係数でわずかな効果を発揮するように、唯一の1.10から1.33から異なります。我々は正常組織への相対的な線維性組織のために報告することの剪断弾性率の増加は、ポアソン比の変動に関連するエラーが観察された機械的性質の変化にマイナーな相対的であることを意味し、大きさの数倍です。

力 - 変位のデータの分析に使用できる実際のアルゴリズムとコードが特定のアプリケーションの状態と力 - 変位曲線の多様な集団のその後の特性の対象となります。より高度な分析に関心がある場合、一方はLinらの作品を協議することができる^。23。著者らは以前にインデントのデータのヘルツモデルのフィッティングを自動化するための努力を妨げて合併症の多くを克服するアルゴリズムに相乗戦略のシリーズをコンパイル。

他のいくつかの分野では、この方法のさらなる開発と搾取のために用意されています。いずれかの抗体標識なしで肺胞の壁を可視化に興味を持っているケースでは、エラスチンとコラーゲンの両方が緑のスペクトルにおける彼らの自家蛍光信号から可視化することができる。一方、薄い組織切片を、3次元イメージング技術、あるいはその両方を使用してより良いイメージングは​​、機械的性質を基礎とした組織構造を相関させる能力を高めることができる。現在の方法は、コラーゲンやラミニンなどの細胞外マトリックス成分の染色と可視化を可能にする一方、追加的な努力は、特定の細胞集団を特定し、そのような集団の近くで機械的な微小環境を特徴づけるために細胞表面マーカーを染色することを目的とすることができます。 Altキーernatively、組織が同じ目標を追求するためにマーカーや細胞特異的タンパク質リネージュ蛍光タグを発現するマウスから収穫することができます。最後に、このメソッドはここにもそのような改造喘息の改造高血圧における血管、気道として、肺の他の解剖学的特徴を特徴付けるために適して表示される詳細。さらなる強化のための開発と可能性の現在の状態に基づいて、AFMのmicroindentationは、肺に疾患の進行に伴う組織の硬さの変化に貴重な洞察をもたらすために態勢を整え表示されず、間違いないだろうにおける空間的および時間的変化を特徴づけるには有用である他の軟組織の様々なの剛性。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
試薬の名前	会社	カタログ番号	コメント
AFMチップ	Novascan	PT.GS	5ミクロンホウケイ酸ビーズ、0.06 N / mを
ポリ- L -リジンのカバースリップ	VWR	354085	BDアンジオジェネシス12ミリメートル丸1号ガラス
アガロース、低ゲル化温度	シグマ	A0701
ウサギ抗コラーゲンI（RB PAB）抗体	アブカム	ab34710 - 100
のAlexa Fluor ® 546ヤギ抗ウサギ抗体	インビトロジェン	A11010
ウサギ抗ラミニン	シグマ	L9393