コットンでアグロバクテリウムを介したウイルス誘発遺伝子サイレンシングアッセイ

要約

我々は、綿のアグロバクテリウムを介したウイルス誘発遺伝子サイレンシング（VIGS）アッセイの詳細なプロトコールを提示する。タバコ茎えそウイルス（TRV）由来VIGSベクターは、R​​NAが綿GrCLA1​​、C​​loroplastos alterados 1遺伝子のサイレンシング誘導するために配備されました。サイレンGrCLA1​​によって引き起こさアルビノ表現型は、接種後2週間以内に幼苗期で観察された。

要約

コットン（ チョウ目害虫抵抗性ワタ ） が世界中で最も重要な作物の一つです。かなりの努力が、新品種の分子育種が行われている。綿花の大規模な遺伝子機能解析は、ゲノム、遺伝子重複と倍数性、遺伝的形質転換^1〜長期成長サイクルと反抗のその大きさに起因する可能性が高い近代的な植物種、の中で最も遅れをとっている。綿の高スループット機能遺伝学/ゲノム研究を容易にするために、我々は、綿の遺伝子機能を評価するために迅速かつ効率的なトランジェントアッセイの開発を試みる。

ウイルス誘導ジーンサイレンシング（VIGS）は、ウイルス増殖^2,3を抑制する宿主転写後遺伝子サイレンシング（PTGS）に基づいて開発された強力な手法です。 Agrobacterium媒介VIGSが正常に様々な機能ゲノム研究の^3,4のために、広くそのようなナス科、シロイヌナズナおよびマメ科植物の種などの双子葉植物の種の範囲、及び大麦、小麦、トウモロコシを含む単子葉植物の種に適用されている。この迅速かつ効率的なアプローチは、植物形質転換を回避し、機能的な冗長性を克服するとして、それは特に魅力的と変換のための従順ではない綿のような作物種の機能性ゲノム研究に適しています。

本研究では、我々は、綿のアグロバクテリウムVIGSのシステムの詳細なプロトコールを報告する。いくつかのウイルスVIGSのベクターのうち、タバコのガラガラのウイルス（TRV）がホストの広い範囲に侵入した後、まだhosts5で軽度の症状を作り出すプラント全体にわたって精力的に感染することが可能です。サイレンシングの効率を監視するには、GrCLA1、綿のシロイヌナズナCloroplastos alterados 1遺伝子（AtCLA1）のホモログ遺伝子が、VIGSのバイナリーベクターpYL156中にクローニングし、挿入されている。CLA1遺伝子が葉緑体の開発^6、および以前の研究に関与していることはことが示されているAtCLA1の機能喪失効率を黙らせるための優れた視覚的なマーカーを提供する、真の葉⁷のアルビノ表現型をもたらした。約2週間でポストアグロバクテリウムの浸潤、アルビノ表現型はすべて反復実験で100％のサイレンシングの効率で、真の葉の上に登場し始めました。内因性遺伝子発現のサイレンシングは、RT - PCR分析により確認した。著しく、サイレンシングが強力にテキサス州の様々な商業的に栽培品種を含めて我々がテストしたすべての品種で発生する可能性があります。この迅速かつ効率的なアグロバクテリウムVIGSアッセイは、綿のゲノムワイドなレベルでの遺伝子機能の迅速な大規模解析のための非常に強力なツールが用意されています。

プロトコル

1。綿の苗を育て

1. アップランド綿（チョウ目害虫抵抗性ワタ）、様々なFibermax 832、Phytogen 425RF、Phytogen 480WRおよびメトロミックス700（SunGR、Beavile、ワシントン州）を含むポット（直径7cm）でDeltapine 90の種をまく。
2. 23℃プラスチックドームで覆われているトレイにポットを保つ成長室で12時間light/12時間暗光周期と° C、120μEM ^-2 S ^-1の光、。
3. two子葉が浮上しているドームを取り外します。
4. 約2週間後、VIGSアッセイの2つの完全に展開された子葉と植物を使用してください。この段階では、真の葉はまだ（図1）浮上していない。

2。 GrCLA1​​遺伝子を運ぶVIGSベクターを構築

1. G.のcDNAライブラリーからプライマーGrCLA1 ​​- Fを用いるPCR、5' - GCCCTTTGTGCATCTTC - 3'とGrCLA1 ​​- R、5' - CTCTAGGGGCATTGAAG - 3'で綿のCloroplastos alterados 1遺伝子（GrCLA1）を増幅するraimondii葉組織。
2. EcoRIとKpnIでGrCLA1 ​​のPCR産物を消化し ​​、ライゲーションによってpYL156（pTRV - RNA2）ベクターに挿入する。
3. カナマイシンの濃度50μg/ mLを含むLB寒天プレート上でクローンをスクリーニングする。制限酵素消化およびシーケンシングにより構造を確認してください。
4. エレクトロポレーションによってアグロバクテリウムツメファシエンス GV3101にプラスミドをトランスフォームし、28℃のLB液体培地で回復℃のLBとプレート+カナマイシン（50μg/ mlの）+ゲンタマイシン（25μg/ mLの）上で形質転換体を選択してください。バクテリアは、-80℃で長期使用のため25％グリセロールで保存することができます。

3。 VIGS接種を行います

1. カナマイシンの濃度50μg/ mLを含むLB寒天プレート上RNA2 - GrCLA1：接種の3日前、pYL192（TRV）を保持するアグロバクテリウムツメファシエンスの縞凍結グリセロールストック：RNA1、pYL156（TRV）：RNA2（ベクターのみ ​​）とpYL156（TRV）と25μgの/ゲンタマイシンのmLの。 24時間、28℃で培養する。
2. VIGSの浸潤への2日前には、上記のプレートから各構成要素のために単一コロニーを採取し、カナマイシン50μg/ mLのとゲンタマイシンの25μg/ mLのを補充したLB培地5mLにそれを接種する、28で細菌培養を育て° 50rpmの速度でローラードラムで一晩のためのC。
3. と20μMのアセトシリンゴン - カナマイシン50μg/ mLのとゲンタマイシンの25μg/ mLの、プラスの10mM MES（（4モルホリノ）エタンスルホン酸2）を補充したLB培地50mLでフラスコに、上記の文化を移す。 ° C〜50 rpmの速度でシェーカーで一晩のために28で文化を育てる。
4. 次の日に、5分間4000rpmでアグロバクテリア細胞をスピンダウンし、10mMのMgCl _2、10mMのMESおよび200μMのアセトシリンゴンを含む浸透バッファに文化を再サスペンド。 1.5文化のOD 600を調整します。
5. 3時間室温でベンチに文化を残す。
6. Agrobacterial浸潤に先立って、パンチ子葉を通して貫通せずに25 Gの針を持つ綿の植物の子葉の裏面。一つまたは二つの穴は、（組織の柔らかさに依存する）子葉の各セクション（図2）にパンチした。
7. 1:1の比でRNA2 - GrCLA1、手には1を使用して負傷サイトを通じて子葉の下側から混合物を浸透させる：RNA1とpYL156（TRV）：：RNA2またはpYL156（TRV）pYL192のAgrobacterial培養懸濁液（TRV）を混在させるmLの無針注射器（図3）。
8. プラスチックドームで植物をカバーし、一晩薄明かりの状態で、室温で浸透した植物を残す。
9. 12時間の明/ 12時間暗のサイクルで23℃、120μEM ^-2 S ^-1の光の温度と成長のお部屋に植物を移す。

注：VIGSは、植物が23 ° Cまたは温室（25〜28 ° C）のどちらか下にあるときに動作する。温度が比較的低い場合（23〜25℃）、それは接種と表現型のためにより高い（28-30 ° C）または変動温度に比べてより均一であるほうが簡単です。ドームで植物を覆うこともVIGSがより効率的になります。

10. 7〜8日後の浸潤におけるサイレンシング表現型を調べます。 pYL156（TRV）によって沈黙植物の真の葉：RNA2 - GrCLA1 ​​はアルビノ表現型（図4）を表示するために始めた。アグロバクテリウムキャリングpYL156（TRV）を浸透植物：RNA2はコントロールとして使用。
11. コントロールと沈黙綿の植物から単離されたRNAを逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT - PCR）を用いて内在性遺伝子の発現レベルを調べることにより、遺伝子サイレンシングの効率を確認してください。

注：TRVは広い宿主範囲を持っていると届出病原体であるとしてVIGS - edの植物が含まれている検疫条件および植物の下に保持されるべきは、適切にオートクレーブし、アッセイ後に廃棄する必要があります。

4。代表的な結果：

約2週間Agrobacterial混合物と手浸潤した後、GrCLA1 ​​サイレンシングによって引き起こさアルビノ表現型が明らかに本当の葉で観察された。サイレンシングの効率は50以上の植物を使用して複数の実験でほぼ100％に達する。沈黙の植物は、新たに兄の葉（図4）上にモザイクの葉を開発する上で均一に分布し、非常に強力なアルビノの表現型を表示します。

図 Agrobacterial浸潤のために使用される2つの完全に展開された子葉と約2週齢の段階で1。綿の苗。

図2。Agrobacterial浸透を容易にするために、25 Gの針を使用して綿の植物の子葉の下側に小さな穴をパンチング。

無針注射器を使用して傷のサイトを通じて、綿の子葉にAgrobacterial混合物の図3。ハンドの浸潤

図4。アルビノの表現型は、綿の植物を沈黙さVIGSに登場。四品種が表示されます。 A）Fibermax 832、B）Phytogen 480WR、C）Phytogen 425RF、D）Deltapine 90。

ディスカッション

VIGSは、一時的に内在性遺伝子の発現をノックダウンにより、機能的なゲノミクス解析の強力なツールであることが証明されています。本研究では、我々はTRV -ベースのバイナリーベクターを利用することにより、アグロバクテリウムを介したVIGSを開発した。綿CLA1（GrCLA1）遺伝子サイレンシングの効率を監視するための視覚的なマーカーとして開発されました。我々は一貫して取得し?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
試薬と機器の名称	会社	カタログ/シリアル番号	コメント
ローラードラム	グラス=コル、LLC。	099A TC108	アグロバクテリアの培養
インキュベーター	シェルドンマニュファクチャリング株式会社	01046209	アグロバクテリアの培養
UV / VIS分光光度計	ベックマンコールター	モデル：DU530	測定OD
ジーンパルサー	BioRad社	モデル：1652076;シリアル：154BR3880	エレクトロポレーション
パルサーコントローラ	BioRad社	モデル：1652098;シリアル：232BR4833	エレクトロポレーション
Micropulserエレクトロポレーションキュベット	BioRad社	165-2081	エレクトロポレーション
1 mlのシリンジ	BDバイオサイエンス	30962	アグロバクテリアの接種
メトロミックス700	SUNGR	SKU＃553001	成長する苗
テラコッタポット	TOPlastics	GPS 3001B2	成長する苗
MES一水和物	USB	18886	浸潤のバッファ
アセトシリンゴン	シグマ	D134406	浸潤のバッファ