骨再生のための人間の血管周囲の幹細胞の使用

要約

人間の血管幹細胞（PSCの）間葉系幹細胞（MSC）に似た骨格組織再生のための新しい幹細胞のクラスです。 PSCのは、標準的な脂肪吸引の手順中に調達脂肪組織からFACS（蛍光活性化セルソーティング）で単離することができるし、骨形成を達成するために骨誘導足場と組み合わせて。

要約

人間の血管幹細胞（PSCの^）1-3骨格組織工学の目的のために複数の組織から十分な数で分離することができます。 PSCは '周皮細胞 "（CD146 + CD34-CD45-）、我々は以前に間葉系幹細胞の性質を有することが報告されているそれぞれの"外膜の細胞 "（CD146-CD34 + CD45-）のFACSソート集団である。 PSCは、MSCのように、骨分化と同様に、分泌するプロ骨形成サイトカイン^1,2を受けることができます。現在のプロトコルでは、SCIDの筋肉ポーチの注入を含むいくつかの動物モデルにおいて、PSCのosteogenicityを実証する（重症複合免疫不全）マウス、SCIDマウス頭蓋冠欠損と胸腺ラットの大腿骨分節性欠損（FSD）を。大腿筋ポーチモデルは、異所性骨形成を評価するために使用されています。頭蓋冠の欠陥は頭頂骨を中心に標準で直径4ミリメートル（非常にサイズ^）8であるされています。 FSDにはbicorticalあるとして安定化されているポリエチレンバーとK-ワイヤ^4。説明したFSDも大幅に独自の⁴に治らない臨界サイズの欠陥です。幹細胞や成長因子が欠損サイトに追加されている場合とは対照的に、有意な骨再生が理解することができます。 PSCのxenograftingの全体的な目標は、異所性と同所両方骨再生モデルでは、このセル型の骨形成能力を実証することである。

プロトコル

1。血管幹細胞の分離

これはM. Corselli らによって、隣接した記事"ヒト白色脂肪組織からの血管周囲性幹細胞の精製"で詳細に説明されています。

2。足場の作成

1. 足場は、ポリ（乳酸-コ-グリコール酸）（PLGA、Burminghamポリマー）ハイドロキシアパタイトコーティング^4-6から以前に発行されたプロトコルごとにカスタムメイドされています。アパタイトコーティングPLGA足場は溶媒キャストと粒子浸出プロセスによってPLGA 15分の85から製造される。足場は、筋肉の袋注入、大腿骨分節性欠損のために円板状頭蓋冠注入の形状（直径4ミリメートル）、または円筒形（直径4mm、長さ6ミリメートル）の球形（直径2mm）で作成されます。
2. 簡単に言えば、PLGA /クロロホルムソリューションは、カスタムメイドの短所を作成するには、200から300μmの直径のテフロン型にキャストされ、ショ糖（高分子/スクロース比5/95、w / w）のと混合truct。一晩凍結乾燥した後、足場は、テフロン製の型から削除され、ショ糖を溶解するためのddH ₂ O中に浸漬した。足場は、DDH _{2 O} 3のリンスに続いて、30分間70％エタノールに浸漬して消毒されている
3. アパタイトコーティングのために、擬似体液（SBF）溶液を順次のCaCl _2、MgCl 2を溶解して調製します。•6H ₂ O、飽和NaHCO _{3、K 2} HPO ₄のddH ₂ Oの•3H ₂ O溶液のpHは、溶解性を高めるために1M塩酸を加えて6に低下します。のNa ₂ SO ₄は、KClおよびNaClが追加され、最終的なpHは6.5（SBF 1）に調整されます。
4. Mg2 +とHCO ₃ -無料のSBF（SBF 2）CaCl ₂とのddH ₂ O中のK ₂ HPO _{4•3H 2} Oを添加し、pHを6に下げられることにより調製される。 KClおよびNaClを添加して最終pHを6.8に調整されます。すべてのソリューションは、0.22μmのPES membrに通して濾過滅菌していますANE（ナルゲン）。コー​​ティングプロセスの直前に、乾燥したPLGA足場は濡れおよびコーティングの均一性を向上させるためにグロー放電アルゴンプラズマエッチング（Harrickサイエンティフィック）に供されています。
5. エッチングされた足場は、その後12時間SBF 1でインキュベートし、Mg2 +とHCO ₃に変更されます- 37で別の12時間無料のSBF 2°C穏やかに撹拌下に。コーティングされた足場は、過剰なイオンを除去するためのddH ₂ Oで洗浄し、事前の詳細な検討を行うために凍結乾燥されています。

3。筋肉ポーチモデル注入

1. PBSでPSCの懸濁液（リン酸緩衝生理食塩水）100μlを静かに注入する直前に球状PLGAベースのインプラントの上にドロップされます。細胞は、in vivo追跡後注入で許可するように、ホタルルシフェラーゼのレンチウイルス挿入によって事前に標識されています。細胞密度は、インプラントあたり2.5×10 ⁵である。
2. SCID（重症複合免疫不全）マウス6週齢で使用されます。動物はanesです。イソフルラン吸入thetizedとブプレノルフィン（ベッドフォードラボ）とpremedicated。標準Betadine準備した後、後肢の二国間切開（長さで縦2 mm）を作られています。
3. ポケットは筋線維長軸に平行な鈍的切開により大腿二頭筋の筋肉にカットされています。各マウスについては、PSCのとPLGAベースのインプラントが挿入され、筋肉を覆う筋膜は、5から0 Vicryl（エチコン）で縫合されています。
4. 皮膚は、次のクチクラパターンで5から0 Vicrylで閉じられます。 10日間、動物は48時間とTMP / SMX（Qualitestトリメトプリム/スルファメトキサゾール）のブプレノルフィンと術後に扱われます。

4。頭蓋骨欠損モデル注入

1. SCIDマウス（12-14週齢）のイソフルラン麻酔した後、髪が切り取られ、皮膚は、プロトコルごとにbetadineで消毒。
2. 8 mmの皮膚切開は、マウスの頭蓋冠の中央矢状縫合に沿って行われます。次に、calvArialの骨膜は優しくQ-Tipのアプリケーションによって削除されます。
3. 次に、高速歯科用ドリルのダイヤモンドコーティングされたトレパンビットを使用して、4 mmの頭頂骨欠損が作成されます。欠陥は、完全な厚さである - しかし、ケアは、基礎となる硬膜を傷つけないように注意されています。
4. 移植されたPSCのとカスタムメイドのPLGAベースのインプラントは、その後、欠陥部位に優しく置かれます。細胞密度は、インプラントあたり2.5×10 ⁵である。最後に、皮膚は6から0 Vicrylで縫合されています。動物は、10日間の48時間とTMP / SMX用のブプレノルフィンと術後に扱われます。

5。大腿骨部分欠損モデル注入

1. 無胸腺ラット（12-14週齢）は、イソフルラン吸入麻酔下にあります。大腿骨は、スクラブとbetadine（ 図1）標準プロトコルごとに用意されています。
2. 27から30 mmの縦切開を大腿骨の前外側面を介して行われています。大腿骨骨幹部は、その後広LATを分離することによって公開されているeralisと大腿二頭筋の筋肉（ 図2）。
3. 骨再生の一貫性を最大限にするために、大腿部の欠陥を覆う骨膜が完全に切除大腿セグメントで削除されます。
4. ポリエチレン板（長さ23ミリメートル、幅4ミリメートル、高さ4 mm）の大腿骨の前外側面に配置されます。プレートは0.9 mm径のねじキルシュナー鋼線（ジマー）を収容するために6つのプレあけられた穴を含んでいます。テンプレートとしてプレートを取って、6スレッドのキルシュナー鋼線は、プレートの両方野（ 図3）を介して掘削されています。
5. 次に、小さな振動鋸刃（ストライカー、MI）で、6 mmの半ば骨幹欠陥が作成されます。分節欠陥は、プロトコルに従って細胞（ 図4）を積んであったPLGAベースのインプラントを挿入することにより処理されます。
6. 覆っている筋肉や筋膜が所定の位置にインプラントを確保するために4から0 Vicryl吸収性縫合糸で閉じられており、皮膚を縫合しています。

（6） 生体内評価では

1. X線評価は高解像度XRと高解像度μCT（マイクロコンピュータ断層撮影）分析の両方によって長手方向の方法で実行されています。 μCT解析（Skyscan 1172F）の場合、画像は、19.73μmの（100 kVおよび100 mAの放射線源、0.5ミリメートルアルミフィルターを使用）の解像度でスキャンされます。画像はDataViewer、偵察、CTAN、とCTVolソフトウェアを用いて分析されています。
2. 生物発光イメージングは​​、細胞の生着、生存、増殖を評価し、インプラントのサイトの移行を除外するには、シリアル方法で行われます。生物発光イメージングは​​、IVISルミナIIデバイス（キャリパーライフサイエンス）を使用して実行されます。光出力は、リビングイメージのソフトウェア（Xenogen）を用いて定量されています。全光出力が光子/平方/秒CM /ステラジアンに記録されます。
3. 組織学的および組織形態分析は、事後に実行されます。採用ルーチン汚れマッソントリクローム、アニリンブルー、pを含むentachrome、とPicrosirius赤。組織形態計測学的分析は骨は、それぞれ青と黄色の暗い表示される、アニリンブルーまたはpentachrome汚れのいずれかで容易に実行されます。ハイパワーフ​​ィールドあたりのピクセル数は、Adobe Photoshopの魔法の杖ツールを使って計算されます。

7。代表的な結果

頭蓋骨と大腿部の欠陥の両方が重要なサイズであるため、有意な治癒は、増殖因子または外因性幹細胞を治療せずに期待するべきではありません。

手術手技の面では、筋肉の袋郭清は、筋膜面に沿ってなければならないため、最小限の出血が発生する必要があります。筋肉のポーチモデルは両側実行されているにもかかわらず、マウスは術後1日目で容易に歩行する必要があります。頭蓋冠の欠陥のために、出血が発生しているが、Q-ティップに浸漬させたことができます。細心の注意は、基礎となる硬膜を傷つけないように注意すべきである - これが干渉しますので正常な治癒である。 FSDモデルでは、注意が神経学的損傷を防ぐために、過度の出血や大腿神経を引き起こすことがないように主要な血管を傷つけないように注意されています。キルシュナー鋼線はようにプロセスの皮質骨を損傷しないように穏やかな圧力で掘削されています。

図1。無胸腺ラットの大腿骨部分欠損に対する術前準備（FSD）。雄性ラット（12-14週齢）は、イソフルラン吸入麻酔下にあります。大腿骨は、スクラブでbetadine標準プロトコルごとに整形処理。

図2。大腿骨分節障害（FSD）を作成するための外科的露出 。 27〜30ミリメートル縦切開を大腿骨の前外側面を介して行われています。大腿骨軸の外側面は、その後外側広筋を分離することによって公開されていると大腿二頭筋の筋肉。

図3。大腿骨分節障害（FSD）を作成するための固定 。ポリエチレン板（長さ23ミリメートル、幅4ミリメートル、高さ4 mm）の大腿骨の前外側面に配置されます。プレートは0.9 mm径のねじキルシュナー鋼線を収容するために6プレあけられた穴を含んでいます。テンプレートとしてプレートを取って、6スレッドのキルシュナー鋼線は、プレートの両方野貫通されています。次に、6ミリメートル半ば骨幹欠陥が作成されます。これが実行されると、カスタムメイドの足場を直接正確に欠陥部位（図示せず）を嵌合する挿入されます。

図4。術後頭蓋骨欠陥の例を示します 。 4ミリメートル、円形の頭蓋骨欠損は無胸腺マウスの右頭頂骨に作成されます。ここでイメージングを移植した欠陥サイトです。術後8週でのPSC。欠陥サイト内の新生骨の存在を注意してください。

ディスカッション

PSCsの分離がよく、特にPSCの分離プロトコルとメソッドを扱う別々に提出されJoveの出版物を含め、他の^1から3に記載されています。この記事の特定の目的は、骨形成/再生のためのin vivoでのアプリケーションで PSCの3プロトコルを記述し、実証することである。 SCIDマウスの筋肉のポーチは異所性ヒト骨形成の⁷の一般的に説明したモデルです。重要な違いは、ホストの骨形成細胞⁸と同様に骨格欠陥の微小環境に存在する骨形成シグナル伝達因子の豊富とのパラクリン相互作用を含む、骨の異所性及び同所性（欠陥）のモデルの間に存在しています。 2つの欠陥は、ここでは頭蓋骨defect8と大腿骨分節性欠損⁴表示されます。両方が（つまり、自分自身で治癒されません）サイズ重要であることがよく記載されています。

興味深い違いは、頭蓋骨や大腿骨の欠陥との間に存在する。最初に、セル：異種移植のPSCと内因性の細胞間の細胞の相互作用は非常に異なっている。頭蓋冠の欠陥の面では、PSCは、基礎となる硬膜（髄膜の最外層）と同様に、欠陥サイトに外接するそれらの骨芽細胞および骨膜細胞と相互作用します。重要なのは、移植細胞と周囲の骨芽細胞^8、または移植細胞とその下の硬膜（レビら 、印刷中）の間の相互作用が進行し骨形成を媒介し、通常の幹細胞のために重要である。大腿骨分節性欠損（FSD）の面では、異種移植PSCのは非常に異なる細胞とサイトカイン環境にさらされています。たとえば、FSDサイトは骨髄とそれに付随する間葉系幹細胞と同様に、骨内膜、骨膜および長期の骨芽細胞で構成されています。理論的には、各セルは損傷への独自の反応があり、各セルを持つことができます。PSC異種移植と細胞の相互作用。

他の明確な違いは、頭蓋冠の間に存在すると大腿骨の欠陥。長い骨は軟骨中間体（軟骨内骨化）を介して形成しながら頭蓋冠の骨は最初に、膜内骨化によって形成されます。また、修復過程の損傷後も、これらの発達の起源を模倣しています。ない軟骨中間体が頭頂骨欠損内に形成されていないのに対し、後のFSD、軟骨カルス形成が観察される。最後に、頭蓋骨の胚起源は長骨のそれとは異なる場合があります。頭蓋骨（ -周皮細胞-血管周囲の細胞を含む全体の頭部領域における）の大部分は四肢の骨格が沿軸中胚葉誘導⁹であるが、神経堤（外中胚葉）から派生しています。すべてのこれらの違いはPSC媒介骨修復の面で有意な差になることがあります。

PSCの使用は、従来の脂肪由来間質細胞（ASCS）に比べていくつかの利点があります。 PSCは文化を必要とし、精製した細胞集団WHIではありません。とにも悪影響を調節することができます- -骨分化、例えば¹⁰血管内皮細胞などのchはに参加していない他の間質細胞が含まれていません。対照的に、例えば、ASCのクローン分析は、唯一の集団は 、in vitro ¹¹ の骨分化を受けることができることを示している。最終的に、骨格組織工学への取り組みは、おそらく最高の骨格欠陥を癒すように、外因性増殖因子とosteocompetent幹細胞（例えば、極成層圏雲など）と骨伝導足場（例えば、HA-PLGAとして本発明の方法で使用される）が組み込まれています。