血液培養から細菌性病原体の検出および抗菌剤耐性テストのための一日のワークフロースキーム

要約

細菌性病原体診断のための簡単​​な一日のワークフロースキームの設計は、血流感染症の迅速な認識を可能にします。 8臨床的に関連する細菌の目標とそれらの抗生物質耐性プロファイルの包含は、より適切な治療につながる可能性が同じ日に医師初期洞察を提供しています。

要約

血流感染症があるため、敗血症の可能性の症状、重症敗血症や敗血症性ショックの¹の高死亡率に関連付けられています。したがって、適切な抗生物質療法の急速な投与は、血流感染症の治療における第一に重要である。このプロセスで重要な要素は、細菌の同定と抗生物質感受性試験の結果に大きく依存するタイミングです。これらのパラメータの両方が定期的に時間がかかり、平均24〜48時間^、2、4にかかる文化ベースのテストによって得られる。研究の目的は、血流感染症の迅速な同定と同様に、迅速な抗菌薬感受性試験のためのDNAベースのアッセイを開発することでした。第1のアッセイは、種または属特異的プローブ⁵を補完する真正細菌16S rDNAのベースのリアルタイムPCRアッセイである。これらのプローブは、 シュードモナス属を含むグラム陰性菌を使用して、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）は、と大腸菌と同様にブドウ球菌属を含むグラム陽性菌、黄色ブドウ球菌、腸球菌属、レンサ球菌属、肺炎球菌とは区別することができます。このマルチプローブアッセイを用いて、病原微生物の最初の同定は、2時間後に与えられた。

第二に、我々はS.の抗生物質感受性試験のために半分子アッセイを開発しました黄色ブドウ球菌、腸球菌属。と（通性）好気性グラム陰性桿菌^6。このアッセイは、PCRは、細菌⁷の成長を測定するために使用された研究に基づいていた。血液培養から直接採取し細菌が抗生物質の選択で6時間インキュベートし、SYBRグリーンベースのリアルタイムPCRアッセイに続くのは、成長の阻害を決定しています。これら2つの方法の組み合わせは、同じ日（ 図1）適切な抗生物質療法の選択を指示することができます。結論として、同定および抗生物質感受性の両方の分子の分析は、病原体を検出するための高速な代替手段を提供し、血流感染の診断を向上させることができます。

プロトコル

PART I：病原体同定

1。試料調製

注：以下のプロトコルに記載されているように全体の分子のワークフローは、分子診断の品質保証³の推奨に従って実行する必要があります。

1. 10倍希釈サンプルになるように1.5 mlの反応チューブにNaClを0.9ミリリットル0.9％に血液培養の0.1mlのアリコートを追加します（定量PCR阻害を防ぐために希釈）。
2. ペレット細菌DNAの5分間13400×gでサンプルを遠心分離します。
3. 100μlの滅菌脱イオンH _{2 O}の細菌ペレットを再懸濁し
4. 4°Cまで、さらに使用時にDNAサンプルを格納します。

2。同定アッセイ：リアルタイム16S rDNA塩基PCR

1. 次のように反応混合物を準備します。アッセイは、サンプルごとに4つの別個の反応で構成されています。各混合物は12.50μlのマスターが含まれていますミックス、0.9μMフォワードプライマー^{（5-TCCTACGGGAGGCAGCAGT-3）7、0.6μM}リバースプライマー^{（5-GGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTT-3）8}およびプローブのパネル。プローブの量は、以下の4つの別個の反応のそれぞれに対して与えられます。
2. 最初の反応は含まれています。
   • 0.2μMユニバーサルプローブ^{（5-FAM-CGTATTACCGCGGCTGCTGGCAC-3-BHQ1）8}
   • 0.2μMP.緑膿菌プローブ （5-JOE-CCAAAACTACTGAGCTAGAGTACG-3-BHQ1）
3. 第二の反応は含まれています。
   • 0.2μME.大腸菌プローブ（5-JOE-GGAGTAAAGTTAATACCTTTGCTCATT-3-BHQ1）
   • 0.2μM、シュードモナス属。プローブ（5-NED-CCTTCCTCCCAACTTAAAGTGCTT-3-MGBNFQ）
4. 第三の反応は含まれています。
   • 0.2μM ブドウ球菌属。プローブ（5-NED-AATCTTCCGCAATGGGCGAAAGC-3-MGBNFQ）
   • 0.2μMS.黄色ブドウ球菌のプローブ（5-FAM-AGATGTGCACAGTTACTTACACATAT-3-BHQ1）
   • 0.2μM エンテロコッカス属。 （5-JOE-TCCTTGTTCTTCTCTAACAACAGAG-3-BHQ1）
5. 第四反応が含まれています。
   • 0.2μMユニバーサルプローブ（5-FAM-CGTATTACCGCGGCTGCTGGCAC-3-BHQ1）
   • 0.3μM 球菌属。プローブ（5-NED-CCAGAAAGGGACSGCTAACT-3-MGBNFQ）
   • 0.2μMS.肺炎プローブ（5-JOE-CCAAAGCCTACTATGGTTAAGCCA-3-BHQ1）
6. 20μlの合計体積に到達するために、滅菌脱イオンH ₂ Oを追加します。 96ウェルPCRプレートのウェルに各反応混合物の20μlを追加します。
7. 各ウェルにサンプルの5μlを追加します。
8. 96ウェルPCRプレートをシールする接着フィルムを使用しています。
9. 以下の最適なサーマルサイクリング条件を用いてABI PRISM 7900HTのリアルタイムPCRシステムでプレートを実行します。
   • 10分間50℃で予備加熱
   • 15分間95℃での初期変性
   • の42サイクル
     • 15秒間、95℃で変性
     • 1分間60°Cでアニール

3。結果の分析

1. タブの分析の設定で0.1のCT解析のしきい値を調整します。 6エンド（サイクル）：15開始するベースラインの構成（サイクル）を絞り込むことができます。

2. すべてのサンプルのサイクル閾値（Ct）値を記録します。正のようにPCRの結果を考慮するカットオフ値は35のCt値に設定することができます。血液培養中に存在する細菌の量は、35の下にCT-値を生成する、CFU / mlで10月^11日から^7月 10日までの範囲であった。

PART II：抗生物質感受性試験

4。血液培養陽性⁹から細菌の分離

1. 血液培養陽性ボトルから培養液5 mlを吸引し、血清セパレータチューブにそれを転送します。
2. 10分間2000×gで血清セパレータチューブを遠心します。
3. 血清セパレータチューブから上清を捨てる。
4. 転送BAC0.9％食塩水に滅菌綿棒でチューブのゲル層からteria 0.5マクファーランド標準懸濁液が得られるまで。

5。ミクロ力価プレートの接種

1. ^5×10 5 CFU / mlの懸濁液を形成する二重濃縮されたミューラーヒントンIIブロス中の0.5マクファーランド濁液を希釈する。
2. 抗生物質（ 表1）の選択を含むマイクロタイタープレートのウェルに、この懸濁液を追加します。
3. 6時間37℃でマイクロタイタープレートをインキュベートします。
4. 4℃（マイナス成長コントロールなど）懸濁液のアリコートを格納します。
5. インキュベーションの6時間後、滅菌チューブに各ウェルの内容を転送するだけでなく、マイナス成長のコントロールサンプル4℃で保存された
6. 5分間16000×gでチューブを遠心します。
7. 慎重に、細菌ペレットを乱すことなく、上清を除去します。
8. 滅菌脱イオンHにペレットを再懸濁し _{2 O}
9. 滅菌脱イオンH ₂ Oで10倍のサンプルを希釈する

6。リアルタイム16S rDNA塩基PCR ¹⁰

1. 次のようにPCR混合物を準備します。
   • 12.50μlのiQ SYBR Green Supermixを
   • 前方に0.5μMプライマー^{16S-1（5-TGGAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3）11}
   • 0.25μMリバースプライマー^{16S-2（5-TACCGCGGCTGCTGGCAC-3）11}
   • 20μlの合計体積に対する滅菌脱イオンH ₂ O
2. 96ウェルPCRプレートのウェルにPCR混合物の20μlを追加します。
3. 各ウェルにサンプルの5μlを追加します。
4. 96ウェルPCRプレートをシールする接着フィルムを使用しています。
5. 以下の最適なサーマルサイクリング条件を用いて、MyiQシングルカラーリアルタイムPCR検出システム上でプレートを実行します。
   • 4分間95℃での初期変性
   • 初期には、°C 30秒65℃アニーリング
   • 35サイクル
     • 9時変性15秒間5°C
     • 1分間60°Cでアニール
   • （°C 0.57°C刻みで20分で60から95から）曲線解析を溶かす

7。結果の分析

1. 下記式（抗生物質の種類によって異なります）のいずれかを使用してカットオフCt値を計算します。
   • 一般的には：
     カットオフのCt値= Ct値プラス成長制御+ 0.5×（Ct値のマイナス成長制御- Ct値プラス成長制御）
   • ピペラシリン、グラム陰性桿菌でピペラシリン/タゾバクタムとセフタジジム、 黄色ブドウ球菌のアモキシシリン、オキサシリン及びトリメトプリム/スルファメトキサゾール、 エンテロコッカス属にアモキシシリン： カットオフのCt値= Ct値プラス成長制御+ 0.25×（Ct値のマイナス成長 。 コントロール- Ct値プラス成長制御）
2. プラス成長コントロールとして滅菌脱イオンH ₂ Oと共にインキュベートしたサンプルを使用します。
3. 微生物に応じて、適切なマイナス成長のコントロールを使用します。
   • 抗生物質の混合物とともにインキュベートしたグラム陰性桿菌のサンプル
   • エンテロコッカス属のサンプルは4℃で保存
   • 黄色ブドウ球菌のサンプルは4℃で保存
4. 次のようにテストされ抗生物質のために株の感受性（S）または抵抗（R）を決定します。
   • カットオフCt値よりも高いCt値は感受性を示します。
   • カットオフCt値よりも低いCt値は、抵抗を示します。

8。代表的な結果

二つのモデル生物、すなわちグラム陰性菌E.大腸菌とグラム陽性球菌黄色ブドウ球菌は 、細菌性病原体とその抗菌性プロファイルの決定の検出および同定のための結合された手順を視覚化するために選択されています。プロトコルの最初の部分では、病原体の識別を含んでいる。 SPEcificプローブは、8つの臨床的に関連する微生物の検出用に設計されています。細菌のパネルに含まれるターゲットの存在下で、増幅曲線が生成され、Ct値（ 図2）が計算されます。正のようにPCRの結果を考慮するカットオフ値は35のCT値に設定されています。 図2Aでは、 大腸菌に感染した血液培養の同定のプロファイルが表示されます。 16Sユニバーサルプローブは2つの独立した反応混合物に含まれており、その結果、2つの増幅曲線（25.20と25.95のCt）を生成しています。第3の信号は、E.のプローブ特定の場所から誘導される大腸菌 （27.04のCt）。 S.の識別黄色ブドウ球菌に感染した血液培養は、 図2Bに示されています。 16Sユニバーサルプローブは、33.35と33.71の増幅信号を持っています。残りの2つの信号が黄色ブドウ球菌属に特異的なプローブから派生しています。とS.黄色ブドウ球菌 （32.48と30.59のCt）。

プロトコルの最初の部分は後に、原因となる微生物は知られており、抗菌薬のプロファイルを決定することができます。 図3にも示された大腸菌株を表す抗生物質感受性試験の増幅プロットの例です。 図2Aインチ各行には、細菌のサンプルをインキュベートしたことが1つの抗生を表しています。低CT値を持つサンプルでは、​​成長がテストされた抗生物質に対する抗生物質、を示す抵抗の存在下で発生したサンプルです。逆に、高いCt値は、試験した抗生物質に対する感受性を示す、全く成長が原因抗生物質の効果的な作業から発生していたサンプルを表しています。表1は、E.の抗菌プロファイルの測定を示しています大腸菌およびS.黄色ブドウ球菌分離株。すべてのCt値が報告され、プロトコル·テキスト（7.1）に記載されている数式を使用して、2つのカットオフのCt値が計算されています。抵抗性と感受性を区別するために分離されています。報告されたCt値が計算されたカットオフCt値（およびその逆）よりも低い場合株は抗生物質に耐性があります。

rDNAのPCRリアルタイム16Sを使用して、病原体の同定と抗生物質感受性試験手順の図1のフローチャート。

図2識別アッセイ：。増幅プロットとサイクル閾値（Ct値）は、特定のプローブが原因病原体の同定に使用されている間、血液培養陽性は、普遍的な16S rDNA塩基プローブによって検出される。 E.を含む血液培養のA.増幅プロット大腸菌 、B. S.を含む血液培養の増幅プロット黄色ブドウ球菌 、Pseu AE、Pseudomon緑膿菌として、UNI、16Sユニバーサルプローブ、Ecoli、 大腸菌プローブ; Pseu SP、 シュードモナス属。プローブ、S.肺炎、 肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）プローブ、連鎖球菌属、 レンサ球菌属。プローブ、腸、 腸球菌属。プローブ、黄色ブドウ球菌、 黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）のプローブと、黄色ブドウ球菌属、 ブドウ球菌属。プローブ。

E.の抗生物質感受性試験の図3の増幅プロット大腸菌 （サンプル1）を分離 。各曲線は歪みがでインキュベートしたもの抗生物質を表しています。早い信号はひずみがテストされた抗生物質の存在下で培養し、抗生物質に耐性があるので、したことを意味します高い細菌負荷によって引き起こされる。遅い信号はひずみが抗生物質の存在下で成長していないことを示している、言い換えれば、それは影響を受けやすくなります。

サンプル1：E.大腸菌			サンプル2：S.黄色ブドウ球菌
AST	CT	R / S	AST	CT	R / S
アモキシシリンは8mg / L	16,83	R	アモキシシリンは0.25 mg / L	21,03	R
アモキシシリン - クラブラン酸8月4日mg / Lで	17,36	R	オキサシリン2 mg / Lで	25,80	S
ピペラシリン16 mg / Lで	16,67	R	バンコマイシン2 mg / Lで	25,20	S
ピペラシリン - タゾバクタム16 /4 mg / Lで	24,15	S	ゲンタマイシンが4mg / L	25,86	S
シプロフロキサシンは1 mg / L	29,72	S	トリメトプリム - スルファメトキサゾール38分の2 mg / Lで	24,62	S
セフタジジムは1 mg / L	24,03	S
セフタジジムは8mg / L	26,58	S
ゲンタマイシンが4mg / L	29,83	S
トリメトプリム - スルファメトキサゾール38分の2 mg / Lで	27,60	S
マイナス成長制御（抗生物質の混合物）	30,41		マイナス成長制御（サンプルは4℃で保存）	27,42
プラス成長制御	16,90		プラス成長制御	20,22
カットオフ値は、CT-1 *	21,76		カットオフ値CT-1 ***	23,82
カットオフ値のCT-2 **	18,75		カットオフ値のCT-2 ****	22,02
*アモキシシリン、アモキシシリン - クラブラン酸、シプロフロキサシン、gentamicについてトリメトプリム - スルファメトキサゾール、で **ピペラシリン、ピペラシリン - タゾバクタム、セフタジジムについて			バンコマイシンとゲンタマイシンのために*** ****アモキシシリン、オキサシリンおよびトリメトプリム - スルファメトキサゾールについて

表1。つのサンプル （ 大腸菌や黄色ブドウ球菌 ） の抗生物質感受性試験の定量 。 PCRアッセイのCt値は、自動的にプロトコルのテキストに示すように、数式を使用して、正と負の成長制御から2つのカットオフのCt alues​​を計算することができるように、このExcelファイルにコピーされています。抗生物質がカットオフCt値よりCt値低く表示されている場合はCt値がカットオフよりも高かった場合には、株は、抗生物質に耐性のある、ひずみが影響を受けやすくなります。

ディスカッション

ここで説明するプロトコルは、病原体の迅速な同定を可能にし、それによって血流感染症患者の予後を改善する適切な抗生物質の早期投与につながる可能性があり機能的な抗菌性プロファイルを提供します。テスト、すなわち低コスト、高スループット、最小のターンアラウンド時間の要求条件に応じて、試験条件を調整することができます。全体の手順は、1営業日以内に行うことができます。また、プロトコルの2つの部分が大幅にターンアラウンド時間を短縮され、同時に実行することができます。ここで提示されるように、識別パネルには、私たちの病院の中で最も臨床的に関連する細菌の選択である。主な原則は、16S遺伝子領域を標的としているので、他の微生物に特異的なプローブの設計と分析を追加することができます。完全なアッセイは、もともと血液培養の迅速分析のために意図されていたが、Oの処理にも使用できます。熱のサンプル材料。また、これは抗生物質感受性試験のために使用された抗生物質の場合である：詳細やその他の抗生物質は地元の抵抗パターンとガイドラインに基づいて、追加することができます。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
試薬の名前	会社	カタログ番号	コメント
塩化ナトリウム（NaCl）	メルク化学品	106404	水で0.9％
バキュテイナSST血清セパレータチューブ5ミリリットル	BD診断システム	367986
ミューラーヒントンIIブロス	BD診断Dystems	212322	水に44グラム/ L
Rotixa 50 rsを遠心分離	アンドレアスHettich GmbH＆Co。KG社	4910
遠心分離機5415 D	エッペンドルフ	中止
プライマー	シグマアルドリッチ	NA
プローブ	Sigma-Aldrich/Appliedアプライドバイオシステムズ	NA
TaqManEnvironmentalマスターミックス2.0	アプライドバイオシステムズ	4396838
iQはSYBRGreen Supermixを	バイオ·ラッドラボラトリーズBV	170-8880
アンペア光学96ウェル反応プレート	アプライドバイオシステムズ	N8010560
アンペア光学接着フィルム	アプライドバイオシステムズ	4311971
iQは96ウェルPCRプレート	バイオ·ラッドラボラトリーズBV	223-9441
マイクロシールB粘着シール	バイオ·ラッド労働党atories BV	MSB-1001
リアルタイムPCR検出システム	アプライドバイオシステムズ	ABI PRISM 7900HT
リアルタイムPCR検出システム	バイオ·ラッドラボラトリーズBV	MyiQシングルカラー