のRNAの単離緑膿菌マウス消化管に定着

要約

のRNA単離のための信頼できる方法緑膿菌マウスcecumsから回収記述されています。回収したRNAは、その後の定量PCR、転写プロファイリング、およびRNAのSeqの実験のための十分な量と品質です。この手法は、他の腸内微生物のRNAの単離のために適応させることができます。

要約

白血病などの患者、重症のやけどの傷、または臓器移植¹と免疫力、を持つホストでの重要な罹患率と死亡率における緑膿菌 （PA）感染症の結果。 PAの血流感染症を開発するためのハイリスクの患者では、胃腸（GI）管は、植民地化²の主な貯留が、mechanismsはどのによって無症候性の植民地支配を微生物から浸潤し、しばしば致命的にPAの遷移は、病原体は不明である。以前、我々は、宿主の免疫状態の変化の間に細菌の遺伝子発現の変化を識別するために、マウスの³植民地のcecumsに常駐している細菌細胞からのPAのmRNAを回収することによりin vivoで転写プロファイリング実験で行った。

任意の転写プロファイリング実験と同様に、律速段階は、高品質のmRNAの十分な量の分離です。酵素、破片、食物残渣、および消化管における粒子状物質の豊富さを考えると、RNAの分離の課題は困難です。ここで、我々はマウスの消化管から回収した細菌のRNAの信頼性と再現性の分離のための手法を提案する。このメソッドは、PA GIの植民地化と好中球減少症誘発性の普及⁴の十分に確立されたマウスモデルを採用しています。 PAで一回GI植民地化が確認され、マウスを安楽死と盲腸内容物を回収し、フラッシュが凍結されています。 RNAは、その後、機械的破砕、沸騰、フェノール/クロロホルム抽出、DNase処理、およびアフィニティークロマトグラフィーの組み合わせを使用して抽出されます。量と純度は、分光光度計（㈱エルの技術）とバイオアナライザ（アジレントテクノロジー）（図1）によって確認されています。 GIの微生物のRNA単離のこの方法は簡単だけでなく、他の細菌および真菌に適応させることができます。

プロトコル

1。 P.のマウスモデル緑膿菌 GI植民地化と普及

1. C3H/HeNマウス（雌、6〜8週齢の古い、ハーラン）が共生細菌叢を破壊する経口抗生物質で処理し、以前に^4を説明するようにしてPAとのモノは、植民地化されています。

2。ネズミ盲腸管腔内容物を収穫

1. 液体窒素槽に洗浄ステンレス鋼モルタルを浸す。
2. 二酸化炭素の窒息によりマウスを安楽死させる。
3. 発泡スチロールのボードおよび95％エタノールでシャワー上のセキュリティで保護されたマウスの死骸。胸骨から会陰部への皮膚を通して正中縦切開を加えます。腹腔を露出する皮膚と腹膜を反映している。
4. 全体盲腸を切除する。ステンレス鋼モルタル以上鉗子で盲腸を保持する。解剖はさみで盲腸の両端をスニップ。
5. 盲腸の近位端に盲腸flushate緩衝液（10mM TrisHCl、1mMのEDTA、200 mMの^NaCl）5 1mlで満たしたP1000ピペットの先端を挿入します。ステンレス製の乳鉢に盲腸flushateバッファおよび盲腸内腔の内容をフラッシュします。盲腸flushate緩衝液1mlは、盲腸内容物のすべてをフラッシュするための十分です。盲腸flushateの内容は、モルタルと接触した時点で直ちに凍結されます。
6. 滅菌乳棒で盲腸flushateの内容を挽く。
7. 場所の地面には、ドライアイス/エタノール浴に浸漬50 mlのポリプロピレンコニカルチューブに盲腸管腔内容物を凍結。
8. 繰り返して、各追加のマウスは2.7を介して2.2を繰り返します。
9. -80℃で保存する

3。細菌のRNAの単離

1. 65にパラフィルムで固定されたキャップで50mlオークリッジ遠心管に含まれる酸の暖かい1ボリューム（二盲腸内腔の内容を、約3 mlの最終容量に基づいて）フェノール/クロロホルム（5:1、v / v）を℃の水浴。
2. 溶解バッファーの沸騰0.5体積（2％SDS、16 mMのEDTA、200 mMの^{NaCl）6は、5}分間に50 mlのポリプロピレンコニカルチューブに含まれています。
3. 盲腸内腔の内容に沸騰溶解バッファーを追加します。ホモジナイズ。周期的にボルテックスしながら5分間沸騰させます。
4. 65 ° Cの酸オークリッジ遠心管にフェノール/クロロホルムを100 ° C盲腸内容物/溶解サンプルを追加。パラフィルムでシールキャップ。
5. 65℃でインキュベートC定期的なボルテックス（2分毎）で10分間。
6. 15分間4℃で2500グラムで、サンプルを遠心する。
7. 慎重に新鮮な50ミリリットルオークリッジ遠心機に水相を（白のインターフェースのいずれかを避けて）転送する。水相の体積は、盲腸内容物、溶解バッファー、および酸性フェノール/クロロホルムの総体積の約50％になります。フェノール酸/等量のクロロホルムを追加。
8. シールは、パラフィルムでキャップとハイスピー​​ドでボルテックスでよく混ぜる。
9. 15分間4℃で2500グラムで、サンプルを遠心する。
10. 水相および有機相の間に目に見える白のインタフェースがなくなるまで3.9から3.7までのステップを繰り返します。
11. 慎重に新鮮な50ミリリットルオークリッジ遠心機に水相を移す。クロロホルム/イソアミルアルコール（24:1、v / v）の等量を追加。
12. シールは、キャップとボルテックスでよく混和する。
13. 15分間4℃で2500グラムで、サンプルを遠心する。 15 mlのポリプロピレンコニカルチューブに水相を（ボリュームは総反応容量の約50％となる）を外し、イソプロパノールの等量を追加。
14. 少なくとも2時間または一晩のために-20℃でインキュベートする。
15. 45分間、4℃で2500グラムで、サンプルを遠心する。ペレット状のゲルは、チューブの底に形成されます。上清を取り除く。
16. 氷冷70％エタノール1mlでペレットを洗浄します。渦。 5分間、4℃で10,000 gででサンプルを遠心分離します。
17. 上清を除去し、室温で10分間ペレット乾燥をさせるためにチューブを反転させる。
18. RNaseフリー水200μlのRNAペレットを再懸濁します。

4。 DNase処理（ターボDNA -フリー、アプライドバイオシステムズ）

1. 10XターボのDNaseバッファーおよび2μlのターボのDNase20μlを加え、穏やかに混ぜる。
2. 20分間37℃でインキュベートする。
3. 再懸濁したのDNase不活化試薬20μlを加え、よく混ぜる。
4. 時々混ぜ、室温で5分間インキュベートする。
5. 1.5分間、室温で10,000 gで遠心し、新しいマイクロ遠心チューブに上清を移す。
6. フェノール/クロロホルム冷（4℃）酸の1つのボリュームを追加し、1分間ボルテックスでよく攪拌します。
7. 2分間、室温で12500グラムで遠心。
8. 新しいチューブに水相を移し、クロロホルム/イソアミルアルコール（49:1 v / v）で、渦の1ボリュームを追加します。
9. 2分間、室温で12500グラムで遠心。
10. 新しいチューブに水相（総反応容量の約50％）を譲渡。
11. 3Mの酢酸ナトリウムの0.1倍量、pHが5.5を追加します。氷冷100％エタノールを2.5倍量。渦。
12. -20℃で少なくとも2時間または30分間-80℃でインキュベートする。
13. 4℃で30分間12,000 gで遠心する°
14. 上清を取り除く。
15. 4℃で10,000 gで5分間、遠心分離することにより、氷冷70％エタノール1mlでペレットを洗浄します。
16. 10分間上清と空気乾​​燥を取り外します。
17. RNaseフリー水100μlにペレットを再懸濁します。懸濁するために65℃の水浴中に配置し、ペレットを溶解するために必要な場合があります。
18. DNase処理の有効性をテストするには、リボソームタンパク質（または他の参照の遺伝子）の増幅のための標準的なRT - PCR反応は、RTはコントロールを使用しないで、処理および非処理サンプルに対して実行される可能性があります。

5。 RNAのクリーンアップステップ（キアゲン、RNeasyキット）

1. キアゲン社RNeasyミニハンドブック（ ^第 4版、2006年4月）のページ56から57を参照してください。示されているように従ってください。

6。代表的な結果

このプロトコルを使用して、復元された細菌のトータルRNAの量は、2つのcecumsから約2〜3μgのです。回収したRNAは、その後の定量PCR、転写プロファイリング、およびRNAのSeqの実験のための十分な量と品質です。 RNAの純度は、日常的にサンプルの260nm/280nm比^7を測定することにより評価、まだこの方法では、RNAの完全性に関する情報を提供されていません。アジレントバイオアナライザは、サイジング、定量化とDNA、RNA、タンパク質や細胞の品質管理のためのマイクロ流体ベースのプラットフォームであり、RNAの完全性番号^（RIN）8として知られているRNAの完全性のメトリックを利用しています。このプロトコルで抽出されたRNAは、280分の260 1.7から2.0に至るまでの比率とRINの値≥7.0を生成します。このプロトコルによって回復細菌のRNAのアジレントバイオアナライザ分析の一例を図1に示されています。

図1。アジレントバイオアナライザ電気泳動図と緑膿菌のトータルRNAサンプルのゲル状のイメージが分離し、マウス盲腸内容物から回収。 RIN 8.0。

ディスカッション

RNAの抽出方法は、ここで説明すると、マウスの消化管から採取した高品質の緑膿菌の全RNAの十分な量の回復が可能になります。このメソッドは、P.に限定されるものではありません緑膿菌とは、潜在的に他の細菌に適用することができます。腸から十分な微生物の生物の回復は、生物から生物に大きく変化します。私たちのマウスモデル、P.で緑膿菌は、通常、5 × 10 ^7〜5 × 10 ⁸ CFU / gの糞便⁴の間のレベルでマウスの消化管に定着。回収した盲腸内容物は約0.5グラム、Pの推定数であるため、 two cecumsから回収された緑膿菌は、5 × 10 ^7〜5 × 10 ⁸ CFUの間です。他の微生物が使用されている場合、それはGI植民地化のレベルを確認してから、CFUのターゲット数を回復するために必要なcecumsの数を計算するのが賢明だろう。この特定のマウスモデルを使用する場合は、ペンシルバニア州に感染していない抗生物質で処理したマウスは、自分の盲腸内容物から単離されたRNAのない定量的な量がないことに注意することも重要です。

緑膿菌胃腸の植民地化とP.の病因をエミュレートするために普及の試みの私達のマウスモデル癌と幹細胞移植患者における菌血症緑膿菌 。この患者集団では、共生細菌叢は、多くの場合、病原性微生物（例えば、 緑膿菌によるモノ協会）の繁茂をもたらす抗生物質や化学療法（GI共生細菌叢の抗生物質の枯渇など）への二次枯渇している免疫抑制後、その後の普及。このマウスモデルの利点と制限は、すでに以前に⁴対処されています。この現在の研究の目的は、消化管からの微生物の全RNAを単離するための方法論を提供することです。このプロトコルは、容易に消化管における微生物の病原性の他の側面（すなわち、共生細菌叢の作用、炎症性腸疾患、などの細菌の影響）を調べる他のマウスモデルに適合させることができます。

この方法の1つの利点は、凍結/融解を含む複数の溶解ステップの導入、機械的破壊（乳鉢/乳棒で粉砕、均質化）、沸騰、および化学的溶解（例：SDS）です。溶解ステップの多数にもかかわらず、一部の微生物（特にグラム陽性細菌及び真菌/酵母）追加の機械的破砕が必要な場合があります。溶解/酸性フェノール-クロロホルムインキュベーション（ステップ3.5）、ビーズの追加（細菌や酵母のための/または0.5〜0.7ミリメートルを0.1 mm）およびそれに続くビーズビーティングステップホットした後^、これらの生物^9を溶解するために十分なはずです^10。

マウス盲腸、繰り返し冷たいacid-phenol/chloroformの抽出（ステップ3.7から3.9）から回収された材料の複雑な性質を考えると絶対にさらに下流の反応の許容RNAの品質と整合性を達成するために必要とされています。水溶液と有機相との間の白いのインターフェイスが除去されるまでの間に3月5日冷acid-phenol/chloroform抽出が必要になることがあります。最後に、DNase処理（ステップ4）とRNeasyクリーンアッププロトコル（手順5）の両方の組み合わせは、DNAのコンタミと非発現小（5SとtRNA）を除去するために不可欠です。前述したように、このプロトコルを利用して回収したRNAは、その後の転写プロファイリング^3、定量PCR（未発表）、およびRNAのSeq（未発表）の実験のための十分な量と品質です。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
試薬の名前	会社	カタログ番号
臼と杵	フィッシャー	12-947-1
ホモジナイザー	オムニ	TM - 125
オークリッジ遠心管（50ml）を	Nalgene	3119-0050
酸フェノール/クロロホルム	アンビオン	AM9720
クロロホルム	シグマアルドリッチ	C2432
イソアミルアルコール	シグマアルドリッチ	W205702
イソプロパノール	シグマアルドリッチ	190764
ジエチルピロカーボネート（DEPC）	シグマアルドリッチ	40718
DNase処理	アンビオン	AM2238
RNeasyキット	キアゲン	74104
3M酢酸ナトリウム	アンビオン	AM9740
100％エタノール	シグマアルドリッチ	E7023