3'UTR -レポーターコンストラクトとマイクロRNAを使用してLightSwitchルシフェラーゼアッセイシステムによるヒトマイクロRNAの識別対象は付着細胞へのミミック

要約

マイクロRNA（miRNA）は遺伝子発現の重要な調節因子であり、多くの生物学的プロセスにおいて役割を果たすことが示されている。より良いmiRNAの- UTRの相互作用を理解するために、我々は新たなルシフェラーゼ遺伝子およびアッセイ試薬、LightSwitchのシステムと対になって3 UTRルシフェラーゼレポーターのゲノムワイドなコレクションを作成している。

要約

マイクロRNA（miRNA）は遺伝子発現の重要な調節因子であり、多くの生物学的プロセスにおいて役割を果たす。 700以上のヒトmiRNAは、それぞれがユニークな標的mRNAの数百にまでなると、これまでに同定されている。計算ツール、表現およびプロテオミクスアッセイ、およびクロマチン免疫沈降法に基づく技術は、特定のmiRNAの直接の標的であるmRNAを同定するための重要な手がかりを提供しています。彼らはのための機能的な証拠を提供し、セルベースの​​システム内の特定のmiRNA - 3'UTRの相互作用の効果を定量化するために加えて、3'UTR -レポーターアッセイでは、徹底したmiRNAのターゲットの研究の重要な要素となっている。活用3'UTR -レポーターアッセイにより多くの研究者を有効にして、スケールアップ高スループットのレベルにこのようなアッセイのをサポートするために、我々は高度に最適化されたLightSwitchのルシフェラーゼでは人間の3'UTRルシフェラーゼレポーターのゲノムワイドなコレクションを作成しているアッセイシステム。システムはまた、ポジティブコントロール、様々な内因性の3'UTRのレポーターコンストラクト、および標準化された実験的な一連のプロトコルとして使用するための合成miRNAのターゲットのレポーターコンストラクトを含みます。

ここでは、miRNA、効率的で再現性、およびハイスループット解析に従順であることを模倣するとともに、個々の3'UTR -レポーターコンストラクトのコトランスフェクションのための方法を説明します。

プロトコル

はじめ

マイクロRNAは、多くの重要な生物学的プロセスの活性を調節する遺伝子発現の重要な調節因子として浮上している。 700以上のヒトmiRNAがこれまでに^1を同定して、それは突然変異とmiRNAの不適切な規制は、がんや心臓病^2,3などの生理障害の多様にリンクされていることは驚くべきことではない。最近の研究では、miRNAの規制結合部位の大部分は3'UTRs ^4,5に見られることが示されている、と一部の研究者がセル⁶でのmiRNAごとに目標が何百もあると推定している。 miRNAの生物学的重要性を考えると、存在のmiRNAとそれらのそれぞれに対して膨大な数のターゲットの多くは、それが研究者は確実に好ましくは高スループットの研究の影響を受けやすいプラットフォーム上でのmiRNAの内因性のターゲットを識別することができることが重要です。

miRBase、TargetScan、およびPicTar ^1,6,7のような計算ツールを利用してもmiRNAの推定標的mRNAのリストを生成する強力な方法ですが、予測はまだ一人で⁸に依拠するのに十分正確ではありません。したがって、研究者はまた、ターゲットのde novoを識別するために、または予測されたターゲットを検証する実験的なアプローチの数を強化。多くのチームは、式がmiRNA活性が^4,9,10を摂動されたときに変更される遺伝子を同定するために、定常状態のmRNAまたはタンパク質のレベルの高スループットの措置に頼ってきた。このような変化は、しかし、成績証明書および間接的または下流のシグナル伝達効果にmiRNAの直接の効果を区別していない全体の発現の変化を測定し、間違いなく生物学的に意味のあるものであり、重要な最初のステップを表しています。直接のmiRNA - mRNAの相互作用のために証拠を提供する他の強力なツールは、miRNAとmRNAへのクロスリンクのアルゴノート蛋白質は（したがって、RISC複合体）、相互作用パートナーを同定するのに、すぐに機能的な効果を示しているわけではクロマチン免疫沈降（ChIP）戦略であるこのような結合事象^5,11の。従って、特定のUTR上のmiRNAの効果は機能的な証拠を提供する3'UTR -レポーターアッセイでは、徹底したmiRNAの研究の重要な要素となっている。計算対象の予測または発現とプロテオミクスのデータと一緒にこのようなセルベースアッセイのデータは、特定の3'UTRが直接関心のmiRNAによって調節されていることの強い証拠を提供しています。

3'UTR -レポーターアッセイでは、目的の遺伝子からの3'UTRは、ルシフェラーゼレポーター遺伝子の末端に融合される。 3'UTRは、miRNAのターゲットである場合は、レポーターの転写産物の安定性および/またはその翻訳効率は、機能的なmiRNAの濃度の変化と変更されます。ので、トランスクリプトのみのベースのアッセイとは異なり、レポーターアッセイでは、定常状態のmRNAとタンパク質レベルの両方の影響を識別するのに役立ちます。レポーターシステムもそれが本当にinteraction8ために必要であることを確認するために3'UTR推定上のmiRNAの結合部位を突然変異の機能的効果を研究するために使用することができます。発現アレイ、プロテオミクス技術、そしてアルゴノートチップを用いた大規模な研究は、実験条件、細胞ベースのレポーターアッセイの数が少ないため貴重なゲノムワイドなデータを提供しながらとmiRNA - 3'の研究のためのスケールアップに最も適していますなどの条件の数百または数千のUTR相互作用が小分子または他のライブラリベースエフェクターのハイスループットスクリーニングのために必要になることがあります。

多くの科学者たちは、miRNA - 3'UTRの相互作用の研究にレポーターアッセイ技術を適用している。しかし、異なる転写産物の多くのmiRNAは、それぞれのターゲットは何百ものそのアイデアと、それは別の何千も作成するための研究者がクローン作成、検証、および最適化のステップためのハイスループットスケールでこの強力なアプローチを利用するのは困難であった3'UTRをレポーターベクターは、しばしば法外なコストです。小規模および大規模3'UTR -レポーターの研究あらゆる研究者にアクセスできるように努力において、我々は人間3'UTRs高度に最適化されたLightSwitchルシフェラーゼアッセイシステムに事前にクローン化されたのゲノムワイドなコレクションを作成している。レポーターシステムは、検証コントロールベクター、ポジティブコントロールとして使用するための700以上の合成miRNAのターゲットのレポーターコンストラクトのセット、および標準化の実験プロトコルのシリーズを含んでいる。

次のプロトコルを使用して、特定の人間の3'UTRが興味のあるmiRNAのターゲットであるかどうかを尋ねることができます。このワークフローで重要なステップは、実験デザイン、レポーターコンストラクトとmiRNA模倣のトランスフェクション、ルシフェラーゼレポーターアッセイ、およびデータの分析です。実験的なデザインの場合、それは思慮深くtransfectable細胞株、実験群とコントロールレポーターコンストラクト、およびmiRNAを模倣と非ターゲットのコントロールを選択が重要です。一般的な高transfectable ADHHT1080、HepG2細胞のようなerent細胞株は、HCT - 116、ヒーラ、293、および他の多くの場合、このプロトコルで良好に動作。

実験的な設計上の重要な注意事項

LightSwitchルシフェラーゼアッセイシステムは、RenSPルシフェラーゼ遺伝子とLightSwitchルシフェラーゼアッセイ試薬を利用したGoCloneコンストラクトを含む完全に最適化されたレポーターシステムです。最適なレポーターアッセイの結果を得るために推奨されているようLightSwitchシステムのすべてのコンポーネントを使用してください。

開閉装置GoCloneのレポーターコンストラクトを持つ任意のオリゴ/プラスミドのコトランスフェクションは、非固有の方法で全体的なルシフェラーゼのシグナルが減少します。したがって、次のトランスフェクションの組み合わせを実行することが重要です：唯一の記者、レポーター+コントロールmiRNAを非ターゲット、およびレポーター+特異的なmiRNA。

私たちのempty_3UTRベクトル（強力なプロモーター、無UTR）はルシフェラーゼシグナルの非常に高いレベルを提供し、トランスフェクション効率のためのポジティブコントロールとして機能し、合成miRNAのターゲットのレポーターベクターは、活性を模倣するためのポジティブコントロールとして機能することができる。さらに、我々は正確に配列特異的対非固有の効果を分離するためのGoClone 3'UTRのハウスキーピングのコントロールとランダムコントロールを使用することをお勧めします。

あなたのプロトコルと、可能な限りマスターは、ピペッティングエラーまたは蒸発による、データのばらつきを減少させるためにミックスできるように勉強する。

このプロトコルは、DharmaFectデュオのトランスフェクション試薬（Dharmacon）を使用しています。

日1

重要なヒント：賢く細胞株を選択してください。最良の結果を得るには、transfectableであることが知られている細胞株を使用してください。我々はまた、miRNAの3'UTRのレポーターの測定可能な応答は、その特定のmiRNAの高感度内在性レベルを持つ細胞株における減衰する模倣することを見出した。あなたがどれだけあなたの細胞株では発現しなmiRNAわからない場合は、間接的にセル内の特定のmiRNAの豊富なだけでなく、アッセイのダイナミックレンジのようにことを知らせるを測定するSGGの合成microRNAのターゲットを試してみてください。

1。種子の細胞はトランスフェクション時の≥80％コンフルエントを得た。

1. 100μlの総体積の96ウェル白色TCプレートでシード細胞。
2. パラレル、種子の合流点を評価するための明確な96ウェルプレート中の細胞の適切な数。

重要TIP 1：Confluenceは模倣実験で良い結果を達成するための鍵です。最適なノックダウンの場合、細胞はトランスフェクション時の100％コンフルエントにする必要があります。

の重要なヒント2：最良の結果を得るために低継代数の細胞を使用してください。何度も継代された細胞は、ノイズの多いトランスフェクションのデータを得るために傾向がある。

日2

GoClonereporter構造とmiRNAを準備し、コンフルエントな細胞にトランスフェクト。

2。コンストラクトを準備

1. 室温で融解GoCloneコンストラクト（プラスミドDNA）。よく混ぜる。
2. キャップからの結露を除去する遠心する。

3。マイクロRNAを準備します

1. 室温とキャップの結露を除去する遠心分離機で融解マイクロRNA（特定のミミックと非ターゲットコントロール）。
2. RNaseフリー水で2μMの作用濃度に希釈する。

実験的なmiRNAに加え、常に非標的miRNAの制御を含んで模倣する。プラスミドを共トランスフェクトし、小さなRNAオリゴは、単独でプラスミドをトランスフェクトよりも低い信号につながります。

一つ以上の陽性コントロールが含まれています。 SGGのカタログで合成miRNAのターゲットのレポーターベクターの数百のいずれかを使用することを検討してください。

一つ以上の負または非特異的コントロールが含まれています。 SGGは3'ハウスキーピング遺伝子のUTRs、ランダムフラグメントおよび/または空（なしUTR挿入）コントロールを含むコントロールの範囲を持っています。 experimental構造と一緒にこれらのコントロールのいずれかまたは複数の使用は、あなたの特定のmiRNAまたは非標的制御の過剰発現に起因する非特異的効果のために正規化することができます。

4。トランスフェクションを準備

1. 各トランスフェクションのために単一のアッセイのための以下の試薬を組み合わせる。

混合物1

個々のGoCloneレポーター：	3.33μL
マイクロRNA：	*は異なります。
無血清培地：	10μLの

miRNAの*効果的な濃度は10 nMの100 nmから変えることができます。適切な濃度のためのmiRNAの製造元に問い合わせてください。

重要なヒント ：あまりにも多くの模倣を追加しないでください。濃度を模倣するための合理的な範囲は、最終100uL反応10〜50 nmである。

少なくとも三つの複製を実行TEは、各治療/ UTRの組み合わせのためのトランスフェクションし、エラーをピペッティングを可能にするために追加のボリュームが含まれています。

例えば、エラーまたは蒸発をピペッティングするための余分を含む3回の反復トランスフェクションの井戸のための十分なトランスフェクション混合物を得るために3.5で単一の反応容量を掛ける。

各レポーターの場合は、以下の用に複製を設定：レポーターのみ、レポーター+非標的制御のmiRNAとレポーター+特異的なmiRNA。

非標的制御の場合と同時にターゲットにマイクロRNAのためのトランスフェクションを設定します。

2. DharmaFECT DUO（Dharmacon）混合物は、各トランスフェクションのために、次のメイク：

混合物2

DharmaFectデュオ：	0.15μL
無血清培地：	9.85μL

追加するDharmaFECTデュオの量が依存する細胞株である可能性があります。

金額は上記のHT1080細胞に適しています。

あなたの細胞株に対して適切な量を決定するために、製造元のマニュアルを参照してください。

ヒント：記者の数で上記の量を乗じて大規模なトランスフェクション混合物を作る、の数は複製とmiRNAの数をテストする。準備するためにトランスフェクション混合物の量を計算するとき、エラーや蒸発をピペッティングするためのアカウントに追加の少量を含めるようにしてください。

3. DharmaFECT Duoの混合物を室温で5分間インキュベートすることができます。
4. 5分後、10uLプラスミドおよび/またはmiRNA（混合物1）の各準備チューブにDharmaFECTデュオの混合物（混合物2）の10μLを加える。各チューブは、複製トランスフェクションあたり20μLのボリュームが含まれている必要があります。
5. 室温で20分間、各混合物をインキュベートする。
6. 20分後に、複製するトランスフェクションあたり100μLの合計を各チューブには、replicate当たり予め温めておいた（37℃）、抗生物質を含まない、完全なメディアの80μLを加える。ディープウェルブロックを同時に複製する多くのと試料の調製のために使用されることがあります。ピペッティングにより溶液を混ぜる。
7. インキュベーターからシードプレートを取り外します。細胞が少なくとも80％コンフルエントであることを確認してください。
8. 各ウェルから培地をオフにピペット。
9. 各ウェルにトランスフェクション混合物（20uL DNA /試薬ミックス+ 80uLメディア）100μLを加える。
10. 一晩インキュベーター内でプレートを置きます。

オーバーインキュベートしないでください。ほとんどの模倣は、24時間以内に善意の目標に重大な結果を生成します。 48時間で測定可能な抑圧のレベルが大きくなることがありますが、とてもよく変動によくはなります。

ミミックの実験は、阻害剤の実験よりも簡単です。ほとんどの模倣が大幅に24時間以内に真の目標を、抑制しますが阻害に起因するデ弾圧重要なのは、測定可能であることが48時間を取ることができ、ほとんど常に模倣の効果よりも顕著になります。

日3

注：ルシフェラーゼアッセイは、直ちに実施することができるまたはプレートは-80 ° C（凍結は、一般的に細胞を溶解し、ルシフェラーゼシグナルを増加させる）で凍結されることがあります。最良の結果をアッセイする前に、あなたの細胞をフリーズとアンフリーズ。

LightSwitchアッセイ試薬を追加する前に室温に凍結細胞の融解を聞かせすることを忘れないでください。

5。 LightSwitch AssayReagentsでルシフェラーゼ活性を測定する

1. インキュベーターからプレートを外し、室温にもたらす。
2. LightSwitchのアッセイ試薬を（LS010キットのため、他のサイズのキットのプロトコルがオンラインで見つけることができる）を準備します。
   1. 凍結乾燥アッセイ基質のチューブに溶剤基質100μLを加えることによって再構成100X基板。 光から保護し、室温で時間を最小限に抑える。 100X基質が2 - 3週間のために- 20Cで保存されることがあります。最良の結果を得るには、新鮮な再構成された基板を使用してください。
   2. 室温の水浴にアッセイ緩​​衝液10mlのボトルを融解することによってアッセイ溶液を調製し、使用前に再構成された100X基質100μLを加える。よく混ぜる。
3. 細胞が別のプレートまたはフラスコ形式で栽培された場合 。白色96ウェルプレートに各ウェルのサンプルに直接添加すべてLightSwitchアッセイ溶液（バッファ+基板）を追加するには、マルチチャンネルピ ​​ペッターを（100uL細胞+メディアを含む）を使用して、転送のサンプル100μLの総体積（メディアまたはPBS）で白色96ウェルプレートへ。
4. プレートをカバーする、光から保護し、そして室温で30分間反応させます。 複数のプレートをアッセイする場合、各プレートを読む前に30分間incubatesようにアッセイ溶液の添加をずらす。
5. プレートルミに2秒間各ウェルを読むnometer（SpectraMax Lまたは同等品）。
6. （発光=特異的なmiRNA /非標的制御）コントロールを非標的上の特定のmiRNAの各構成要素のためにルシフェラーゼシグナルの比を計算することでノックダウンを計算する。非UTR特定の治療効果を制御するためのハウスキーピング、ランダム、および空の構造からのデータを使用してください。

代表的な結果

標的miRNAの存在下で3'UTRの目標は、ルシフェラーゼノックダウンを示しています。

せ- 7Aによって3'UTR -ルシフェラーゼレポーター活性のノックダウンは、発光レポーターを読んで、24時間インキュベート、20nmののlet - 7aを模倣したり、非標的制御で構築各レポーターの共トランスフェクトする100ngでHT1080細胞中で測定したLightSwitchルシフェラーゼアッセイ試薬を用いて信号。

図1。 PUNCとARID3B人間3'UTRsは、let - 7aのmicroRNAのターゲットです。PUNCとARID3Bの遺伝子のための人間の3'UTRの記者からの信号が大幅にlet - 7aのマイクロRNAの存在下でノックダウンされているハウスキーピングとランダムシーケンスのための信号間に模倣するUTRsはない。

ディスカッション

私たちは、生きた細胞でのmiRNA - 3'UTRの相互作用の研究を可能にするプリクローニングされたヒト3'UTR -レポーターコンストラクトのゲノムワイドなコレクションを作成している。ここでは、ルシフェラーゼレポーターシステムを用いて3'UTR -記者との共同トランスフェクトするmiRNAを模倣するための再現性とハイスループット法を示している。

このメソッドは、高transfectable細胞株を使用し、過剰発現技術でmiRNA活性を乱す研究者に依存しています。悪いtransfectable細胞株を用いて研究者は、シグマ（ミッション3'UTRレンティGoClones）と連携して作成された私たちのコンパニオンレンチウイルス3'UTR -レポーターのコレクションの使用を検討することができます。 miRNAの細胞を扱うことは過剰発現型の実験で結果を模倣し、そしてそのような研究で、研究者は、これがまたは実際の生理的条件を表していない場合がありますことを考慮する必要があります。過剰発現の懸念に対処するために、研究者は、摂動^12-14つの異なるタイプの相互作用を研究するために、模倣に加えて、miRNAの阻害剤を使用することができます。

一回性のmiRNA標的が同定され、研究者は、サイトが機能的な相互作用のために必要であるかどうかを判断するために推定されるmiRNAの結合部位を突然変異を起こさせるためかもしれません。また、さまざまな潜在的なターゲットUTRs（Boutz）数百のテストにスケールアップすることもできます。研究者はmiRNAが転写の安定性や翻訳効率に影響を与えているかどうかは興味があればさらに、、ルシフェラーゼレポーターのデータは、定常状態の転写レベルの対策と比較することができる。転写レベルでの比例変化に関連付けられていないルシフェラーゼシグナルの変化は、翻訳効率に影響をポイントします。最後に、研究者は、レポーターベクターはmiRNAの濃度¹⁴の変化に異なるUTRsの相対感度を比較するために用量応答曲線を作成し使用することができます。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
	ベンダ	カタログ番号
白色組織培養プレート（96ウェル固体底）	VWR	82050-736
ふたが付いている透明な組織培養プレート（96ウェル）	VWR	353072
LightSwitchルシフェラーゼアッセイ試薬	開閉装置	LS010
DharmaFECTデュオトランスフェクション試薬（0.75mL）	Dharmacon	T - 2010から02
箔のプレートシーリングテープ	E＆Kサイエンティフィック	T592100
通気性のプレートシーリングテープ	E＆Kサイエンティフィック	T896100 - S
プレートルミノメーター	分子デバイス	SpectraMax L