多重経皮電気化学センシングのための中空マイクロニードルベースの​​センサ

要約

この資料では、詳細多重ニードルベースの​​センサの構築を。デバイスは、迅速かつ選択的に複数の分析物のin situ電気化学的サンプリングと分析のために開発されています。臨床医学と生物医学研究は、これらのマイクロニードルベースの​​センサに使用する私たちは想像する。

要約

生体関連分子の迅速分析のための低侵襲多重監視システムの開発は、慢性疾患から彼らの即時の生理学的状態の容易な評価をしている個体を提供することができます。さらに、複雑な、多因子の医学的状態の分析のための研究ツールとして役立つかもしれません。実現するなどmultianalyteセンサーのためには、ユーザーへの痛みや害がなく発生する必要があります間質液のサンプリング、低侵襲である必要があり、分析が迅速なだけでなく、選択的でなければなりません。

最初は痛みの薬物送達のために開発され、マイクロニードルが皮膚を通してワクチンや薬理学的薬剤（例えば、インスリン）を提供するために使用されている^1-2これらのデバイスは格子間空間をアクセスするので、微小電極と統合されているマイクロニードルは、経皮として使用することができます電気化学センサー。グルコース、グルタミン酸、乳酸の選択的検出、Hydrogen過酸化水素、アスコルビン酸が伝達要素として、炭素繊維、変性されたカーボンペースト、白金コーティング、ポリマーマイクロニードルと統合されたニードル電極デバイスを使用して実証されている^。3-7,8

このニードルセンサー技術は、複数の分析物のin situ同時検出のための小説と洗練された分析的なアプローチを可能にしました。多重化は、特に迅速かつ低侵襲な方法で特徴づけることが困難な複雑な微小環境を監視する可能性を提供しています。たとえば、この技術は、グルコース、乳酸およびpHの細胞外レベルの同時モニタリング、疾患状態^7,10-14（例えば、癌の増殖）および運動誘発性アシドーシスの重要な代謝指標である⁹のために利用される可能性があります^。15

プロトコル

1。マイクロニードル作製

1. 三次元モデリングソフトウェアSolidworksで（Dassault SystemesのSA、ツィー、フランス）を使用して、ピラミッド状の中空マイクロニードルアレイを設計する（ 図^{1）。3 月5日}
2. Magicsは、RP 13ソフトウェア（マテリアライズNV、ルーベン、ベルギー）を使用してマイクロニードルアレイのための支持構造を設計します。支持構造は、樹脂製造時にデバイスからドレインすることができ、マイクロニードルが構築されている基盤を提供しています。例の支持構造は、 図1に示されています。
3. リンクされているサポートとマイクロニードルアレイのファイルは、製造プロセスを制御するPerfactory RPソフトウェア（EnvisionTEC GmbHは、Gladbeck、ドイツ）にアップロードされます。このソフトウェアパッケージ内に、作製するマイクロニードルアレイの数を選択し、製造プレート上のデバイスの配置を決定します。
4. Perfactory迅速なPRは180 mWで紫外線モードでキャリブレーションを実行します。ototyping製造システムとエネルギーのずれを確認して±2 mWの範囲内である。
5. 製作が完了したら、15分間イソプロパノールでベースプレートからマイクロニードルアレイを削除して開発しています。圧縮空気を持つ配列を乾燥させ、完全な重合を確実にするためにOtoflash Postcuringシステム（EnvisionTEC社、Gladbeck、ドイツ）で50秒間室温でマイクロニードルを治す。
6. 顕微鏡を介してマイクロニードルの製造を検証し、各マイクロニードルの穴は​​中空と障害物がないことを確認してください。完全に製作されたマイクロニードルは、 図2に示されています。

2。カーボンペースト電極アレイの作製

1. 穴をカットしてあったフラットフレキシブルケーブル（21039から0249）で、基礎となる個々にアドレス指定接続する銅線を露出する60 Wモデル6.75 CO ₂ラスター/ベクトルレーザーシステム（ユニバーサルレーザーシステムズ社、スコッツデール、アリゾナ州）を使用して、商業的供給源（Moから得られたlexのコネクタ（株）、リール、イリノイ州）（ 図3（AとB））。適切にレーザーアブレーションプレート上に配置する治具でフラットフレキシブルケーブルを配置します。フレキシブルケーブルの絶縁部に500μmの直径の空洞を作成するラスタアプローチを使用します。アブレーション用のパターンはCorelDRAWの作成（コーレル、オタワ、オンタリオ州）とレーザーシステムに送信されます。
2. 40 psiでエアブラシそのスプレーのアセトンで変更されたフラットフレキシブルケーブルをきれいにします。イソプロパノール、脱イオン水で洗浄して、それらを洗浄終了します。ない絶縁膜が露出した銅ストリップの上に残っていないことを顕微​​鏡下で確認してください。
3. 次のステップでは、カーボンペーストの梱包の保持キャビティを作成することです。メリネックステープ（粘着アクリル粘着剤を片面にコーティングされた0.002 "厚さ）は2分間の適切な接続を確保するためにアブレーション電極ストリップの上に配向し、電極ストリップと同じパターンでアブレーション、3000 psiで圧縮されています。でこのCASEは、空洞の直径は750μmである。
4. メリネックステープ（粘着アクリル系粘着剤の2つの両面に塗布0.004 "厚さ）の追加の層は、その後、片面粘着テープと同じパターンでアブレーションされており、債券に整列した後にカーボンペースト電極アレイのマイクロニードルアレイに使用されます。

3。機能性カーボンペーストの合成と電極キャビティのパッキング

1. グルコース敏感カーボンペーストは、以前のレシピのオフに基づいており、均一な混合物が得られるまでグルコースオキシダーゼおよびポリ（エチレンイミン）の2.2 mgの10mgを混合することによって得られる。この混合物に^16、ロジウム60 mgのカーボン粉末上に（ 5パーセントの負荷）が追加されます。 40 mgのミネラルオイルを添加し、続いて混合される。ペーストを調製後1週間まで使用されます。ペースト°C使用時まで4℃で保存されています。
2. pH感受性カーボンペーストは、混合30％（w / w）の鉱物油と70％（w / w）の黒鉛pによって得られたowder。セクション3.4で説明したように電極の空洞に貼り詰める。 ^、17の10mMファーストブルーRRジアゾニウム塩（4 -ベンゾイルアミノ-2,5 - dimethoxybenzenediazonium塩化ヘミ（塩化亜鉛）塩）0.5 Mリン酸の溶液を作るためにパックされたペースト電極上にこの溶液20μl滴を置きます自発的にファーストブルーPRのジアゾニウム塩を化学吸着すること30分。緩衝液または脱イオン水使用しないで脱イオン水や店舗で洗い流してください。
3. 乳酸敏感カーボンペーストは、以前のレシピをベースにしていますと、炭素粉末と乳酸オキシダーゼ2.5mgのにロジウムの2.5 mgを混合することによって得られる、5回転のために超音波5分、ボルテックスの5分の間で交互に^18。
4. 準備されたフラットフレキシブルケーブルに変更されたペーストの梱包は、電極の空洞を介してそれぞれのペーストを適用することによって達成されます。こてとパックtとしてプラスチックの薄い部分を（例えば、プラスチック重船のエッジ）を使用して、滑らかな表面が得られるまで、彼は貼り付けます。過剰なペーストが削除されるまで、2番目のきれいな秤量ボートで繰り返します。脱イオン水で洗い流して下さい。カーボンペーストの充填キャビティ、およびマイクロニードルの統合を（セクション2で説明した、3）を作成するレーザーアブレーションを示す模式図を図3に示されています。

4。検出とセンサの校正

1. 乳酸の検出は、-0.15 Vでセンサのクロノアンペロメトリ応答を測定し、0.1 Mリン酸緩衝液（pH = 7.5）で15秒後に電流を記録することによって達成されます。 図4（）は乳酸を検出するための電極触媒反応の模式図が含まれています。
2. グルコースの検出は-0.05 Vでセンサのクロノアンペロメトリ応答を測定し、0.1 Mリン酸緩衝液（pH7.0）で15秒後に電流を記録することによって、同様の方法で実行されています。 図4（b）のための電極触媒反応の模式図が含まれていますDグルコースのetection。
3. pHは、100 mVの/ sで-0.7 Vから0.8 Vにサイクリックボルタンメトリーのスキャンを実行すると酸化ピーク電位の位置を記録することによって監視されています。 pHの検出のための酸化還元反応の模式図を図5に示されています。
4. グルコースと乳酸センサーのキャリブレーション曲線は、それぞれの検体の連続添加することによって作成することができます。セクション5.1と5.2で説明したようにクロノアンペロメトリ測定は、各検体の添加後、実行している。また、固定電位クロノアンペロメトリ測定は、現在の安定化のため各検体の添加の間に十分な時間を（〜10から100秒）ながら攪拌下に行うことができます。
5. pHの検量線は1.0 pH単位の増分で5〜8に知られているpH値は、一連の上に酸化ピーク電位の位置を測定し、セクション5.3で説明したようにサイクリックボルタモグラムを記録することによって作成することができます。

5。代表的な再sults

修飾カーボンペースト充填ニードルを静止溶液中でのクロノアンペロメトリ曲線を（例えば、グルコースの検出または乳酸を検出するための）取得する場合、電流はすぐにそれぞれの検出電位の印加により減少します。それは最終的に定常状態の値に減衰します。代表的な結果を図6に示されているが、この結果は、乳酸マイクロニードルで乳酸や記録の2mMの追加から得られた。ソリューションは、簡単にそれぞれの乳酸を添加した後攪拌しなければなりません。 15秒後に電流が乳酸の濃度を増加させる時に上昇し、現在の応答は、未知の溶液中での乳酸の濃度を決定するために使用することができます。また、継続的な監視は、増加するグルコース濃度（ 図5）で解決策を示すように撹拌した溶液（または流れる溶液中）で使用することができます。再び、時の電流の増加は、tを増加させる彼のグルコース濃度が未知のソリューションへのグルコース応答を標準化するために使用することができます。十分な時間は、溶液を安定させるために、各スパイクの後に許可する必要があります。 0.1 Mリン酸緩衝液のpHに敏感なマイクロニードルでのサイクリックボルタモグラムを図6の1のpH単位の増分で5から8までの4つの異なるpH溶液を介して表示されます。 pHの上昇による酸化ピーク電位のシフトが、この現象は、pH値の指標として使用されています。

SolidWorksで作成したマイクロニードルアレイ（）のSTLファイルのサポート体制（B）を示し、印刷画面の図は、1。画像。

図2マイクロニードルアレイ（A）と、この配列内の単一のマイクロニードル（B）の走査型電子顕微鏡写真。

図3：フラットフレキシブルケーブルアセンブリの模式図。手順は、フラットフレキシブルケーブル（）を変更（B）パターン化され、円を切除、カーボンペースト（C）で満たされたと同様に、第二アブレーションメリネックス層を追加し、交配された当初はアブレーションメリネックス層を追加、含まれていマイクロニードルアレイ（D）が。 拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。

図4。0.1 Mリン酸緩衝液（pH = 7.5）で-0.15 Vで15秒クロノアンペロメトリスキャンと乳酸敏感なペーストのキャリブレーション。乳酸の2mM加えて、現在対応しての各増加。

図5。 キャリブレーションをtrong。 0.1 Mリン酸緩衝液（pH = 7.0）は、キャリブレーション中に攪拌した。外部Ag / AgCl電極とPt基準と対向電極は、本研究で使用されていた。

図6 1。pHの単位の増分（緑青= pHが8.0、緑= pHは7.0、紫= pHが6.0、赤= pH 5.0）でのpH 5から8以上0.1 Mリン酸緩衝液に貼り付けpH感受性炭素のサイクリックボルタモグラム（CV）。第五CVはAg / AgCl参照とPt線カウンター電極対分析のために使用されていました。

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ディスカッション

このニードルベースの​​センサの設計の複数の側面は、デバイス製造の前に考えられた。リアルタイムの検出のため、このセンサーを使用するために、センサの応答時間は、低でなければなりません。このプロトコルでは、各テストセンサーが15秒未満の応答時間を示した。このプロトコルで使用されているペーストは、電極の応答を妨げる可能性が電気の生体分子を含む生体内環?...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
試薬の名前	会社	カタログ番号
フラットフレキシブルケーブル	モレックス	3302/10SF
0.003 "サイド両面テープ	メリネックス
0.004 "両面テープ	メリネックス
乳酸オキシダーゼ	シグマ	L0638
ブドウ糖酸化酵素	シグマ	G7141
炭素上のロジウム	シグマ	206164
黒鉛粉末	シグマ	385031000
ポリ（エチレンイミン）	アクロス	178570010
鉱油	シグマ	M5904
グルコース	シグマ	G8270
乳酸塩	シグマ	L1750
ファーストブルーRR塩	シグマ	F0500
電子シェル300	EnvisionTEC
電子シェル200	EnvisionTEC
Ag / AgCl参照電極	バシ	MF-2052
Pt線	バシ
PGSTAT12 AutolabPotentiostat	EcoChemie
Perfactory RP	EnvisionTEC
Ottoflash Postcuringシステム	EnvisionTEC
リン酸	フィッシャー	A366-4
60Wモデル6.75 CO 2ラスター/ベクトルレーザーシステム	UniverSALレーザーシステム	PLS6.75
CorelDrawに	コー​​レル
SolidWorksの	ダッソー·システムズ	2009
魔法RP13	マテリアライズ