ゼブラフィッシュで自動化されたハイコンテンツ炎症アッセイ：創薬を促進する

要約

ここでは、免疫調節活性物質の同定を目指した新規な高含有化学的に誘発される炎症アッセイを説明します。我々は正常、炎症反応だけでなく、さらに、データ処理、解析、マイニング、およびストレージの自動定量化を可能にするカスタム開発したソフトウェアのスクリプトで自動化された顕微鏡を組み合わせています。

要約

に投与したときにゼブラフィッシュの幼虫はその小さなサイズと相対的な操作や観察のしやすさだけでなく、化合物は、単に入浴水に添加することができ、容易に吸収されているという事実に起因する^{1,2 -}全動物の小分子の画面に特に適している<1％DMSO溶液。ゼブラフィッシュの幼虫および白血球の蛍光タンパク質を発現するトランスジェニック系統の可用性の光学的透明性のために、ゼブラフィッシュでは、in vivoでの急性炎症反応を監視するためのユニークな利点を提供します。その結果、高スループットの免疫調節化合物の同定を目指して、高含有量の小さな分子の画面のゼブラフィッシュを利用することは、炎症誘導のシナリオは、フィン組織のローカライズされたニックをEGの卵黄の表面に向けレーザー損傷を示唆する^、3-6提案されている胚⁷または尾翼の切断^3,5,6。これらのメソッドの主な欠点は、しかし、であったマニュアル幼虫操作の要件は、このようにハイスループットスクリーニングを防ぐために、負傷を誘導する。化学的に誘発される炎症（顎）アッセイ⁸の導入は、これらの障害を排除した。負傷を負わされているので、化学的に同時に扱うことができる胚の数は事実上無制限です。硫酸銅とゼブラフィッシュの幼虫の一時的な治療を選択側線系と負傷者neuromastsへの迅速な顆粒球動員の結果の有毛細胞に細胞死を誘導する。炎症反応は、化合物トランスジェニックcldnB :: GFP / lysC ::感丘細胞と同様に、赤色蛍光タンパク質標識顆粒球における緑色蛍光タンパク質を発現DsRed2の^6,9ゼブラフィッシュの幼虫を使用してリアルタイムに追跡することができる。

両方の高いコンテンツと高スループット分析を可能にするであろうスクリーニング戦略を考案するために、我々は、ロボット液体ハンドリングと組み合わせた自動化されたMICRを導入しましたカスタム開発されたソフトウェアスクリプトを使用してoscopy。このスクリプトでは、負傷した緑色蛍光neuromastsを取り巻く経験的に定義されたエリア内の赤色蛍光白血球によって占め％の領域を獲得して炎症反応の自動定量化を可能にします。さらに、自動データ処理、処理、可視化、ストレージのすべてのカスタム開発され、MATLABやPythonスクリプトに基づいています。

要するに、我々は、顆粒球の炎症反応の開始、進行や解像度への影響について化学化合物のテストを許可する自動化されたHC / HT画面をご紹介します。このプロトコルは、自然免疫応答のオーケストレーションに関与する薬物のメカニズムと経路のより詳細な分析のための良い出発点を提供しています。将来的には、創薬の初期段階では耐えられない毒性やオフターゲット効果を識別する助けとすることにより薬剤開発のための手続きのリスクとコストを減らすことができます。

プロトコル

1。動物の取り扱い

チンアッセイのためにホモ接合性の二重トランスジェニックcldnB間のグループ交配から生じる3 DPFの幼虫を使います:: GFP / lysC :: DsRed2のとAB（野生型）魚を。自然産卵による受精卵を収集し、29で、それらを上げる°ペトリ皿のE3培地中のC（5 mMの塩化ナトリウム、0.17 mMの塩化カリウム、0.33 mMのCaCl _2を 、0.33 mMのMgSO _4を 、青の0.1％メチレンブルー液、pH7.0に平衡化した）。これは、プレート当たり50から70を超えない胚の密度を維持するために不可欠である。

2。ソート幼虫

蛍光レポーターの発現、自発的な炎症と適切な年齢に関連する開発のための蛍光立体の下にあるすべての幼虫を確認してください。

3。スクリーニング培地の調製（常に新鮮な準備）

DMSO（最終1％）、MS222（0.05 g / l）を補充したメチレンブルーせずにE3培地を準備します。

4。硫酸銅準備（常に新鮮な準備）

最初のCuSO _4を量る（M _R = 159.6グラム/モル）とのdH ₂ Oでの20mMストック溶液を調製120μMのCuSO ₄の作業E3/DMSOの溶液（20 mMストック溶液から）（1％）/ MS-222を準備します。光からのCuSO ₄ソリューションを保護します。

5。 384ウェルプレートの準備（グライナー384ウェルマイクロプレート）

リバースピペッ​​トで各ウェルにE3/DMSO（1％）/ MS-222の20μlを事前に追加します。増加したピペットチップの穴は、任意の負傷を負わせずに慎重に胚を処理するために必要とされる、これは内径2 mmの先端を切断することによって行われます。各ウェル（未処理コントロールの84μl）に培地74μlを単一の幼虫を転送します。必要な場合は、ウェル内の横位置で向きの幼虫は、柔軟なエッペンドルフMicroloaderピペットチップ（; 5242 956.003エッペンドルフ）を使用します。

ロボットの液体で、以下のすべての液体処理の手順を行うすべての幼虫の同時処理を確実にするためにワークステーションを処理します。

6。薬物治療

上下にピペッティングして、薬物ストックプレートの化合物を5回混ぜる。各ウェルに7.5Xの薬物ストックプレートの16μlを加え、5回混ぜる。幼虫の損傷を防止し、10μL/ sの速度で培地を分注するためのウェル内の先端の位置を調整します。ウェル内の薬剤の均一な分布を確保するため、ウェル内の培地を4回混ぜる。

7。インキュベーション

29で1時間インキュベートするスクリーニングプレート°C、光から同様のCuSO ₄などの化合物を保護するために、アルミ箔で覆われている。

8。化学傷害

ネガティブコントロール、ミックスの4倍を除き、各ウェルに120μMのCuSO ₄ワーキング溶液10μlを加え、29℃で1時間のために再度インキュベート℃に

9。洗濯

私の80μlを削除し、交換化合物及びCuSO _4を削除する各ウェルに二回（20μlのステップ）からdium。

10。画像収集

90分後の初期の銅処理：倒立自動化された顕微鏡（Olympusスキャン^ R IE）で画像取得を開始します。右と左後部側線からneuromastsが表示されるように初期のzレベルを設定します。 4倍対​​物レンズ（NA = 0.13）を使用して、4フォーカルプレーンのチャネル明、Cy3およびGFP（50μmの距離）が毎時各ウェルに一度画像。

画像やデータ処理に関する追加情報のリクエストも承ります。

11。画像処理

1。データのソート

RAW画像は、私たちのカスタムLabVIEWソフトウェアのスクリプトで処理されます。画像処理パイプライン内の最初の操作は、チャネル、よく、時間の点情報を用いて顕微鏡に生成されたデータのフォルダからRAW画像の選別されています。

ove_step "> 2。拡張焦点

その後、ソフトウェアは、チャネルごとに4フォーカルプレーンから拡張されたフォーカスのイメージを作成します。

3。 RGBオーバーレイ

最後のステップでは3つのチャネルから拡張された焦点画像は、最終的なRGB-オーバーレイイメージにつながることがマージされます。

4。自動化された感丘の検出

パターン認識ツール（LabViewのラピッドプロトタイピングIAツール）は、RGBオーバーレイ画像内neuromastsを識別し、neuromasts周りに興味のある経験的に定義された領域を作成します。

5。定量化

負傷したneuromastsを取り巻く興味のある経験的に定義された領域内に赤色蛍光白血球（赤ピクセルとして反映されています）lの eukocytes（Paol）によってccupied P ercent REA Oの主な読み出し、その結果獲得しています。平均95.27±2.11パーセント（FDA1）および95.12±でウェル（幼虫）の1.56パーセント（FDA2）が正しく検出された、その後、さらにデータ処理が施されています。生データ出力（検出された各感丘のためにPaol）txtファイルに格納され、さらに生データを処理するMATLABスクリプトのデータ入力として機能します。

12。データ処理

1。IMAPS

カラーコードの生データの出力Paolのグラフィカルな可視化によって、個々の実験の成功を評価する、いわゆる炎症マップ（IMAPS）（ 図2）を実現することができます。明るい緑色は、高い初期の炎症指数を反映して、黒は炎症がないことを示します。この簡単な概要については、さらにデータ解析から除外することができます失敗した実験の迅速な同定が可能になります。

2。コントロールのアベレージング

それぞれの実験板は、反射320の化合物が含まれています化合物と時間がポイントごとに単一のデータポイントと同様に32ポジティブコントロールとネガティブコントロールは、それぞれ。 32コントロールが複製の平均と標準偏差が計算されています。コントロール用の2標準偏差内でのみのデータポイントが含まれています。

3。正規化

正規化は、スプレッドシートの分析によって行われます。ネガティブコントロールであるDMSOの平均値は、0に設定され、銅の制御のための最高平均Paolは、正と負の制御の間の最大差は1に設定されているので、1に設定されます。各化合物のPaolは、線形補間または実験的なプレート上の各コントロールに外挿されます。

4。最終的な読み出し：炎症性インデックス

十分な複製実験（すなわち15）が行われてきた後に、反復実験から正規化された生データを読み出し、最終的な結果として、平均化され - 炎症インデックス。銅コントロールの初期の炎症指数は、時間点ゼロの100％から始まり、画像取得の開始時間（初期の銅処理後90分）に相関しています。

5。単調な指数回帰の当てはめ

我々が使用して初期の炎症に向かって単調な指数関数的非線形回帰の当てはめを行う時間の経過とともに炎症の解決のために - _0は t = 0で初期応答の尺度である_、1時間以上の大きさのスロープに関連しています。

6。 2-D特徴空間プロット（ 図4）

特徴空間を生成するために、非線形回帰が適用され、クラスター分析は、このように異なる免疫調節カテゴリから興味深い候補の自動識別（抗inflammatを可能にする、特徴的な領域に特徴空間を分割するORY、抗解像度、炎症性、プロの解像度）。すべての化合物は、パラメータを₀と₁に基づいて2次元プロットに表示されます。

13。データの取り扱いと保管

ユーザ¹⁰によって要求されたときに我々のデータ処理ルーチンは、画像やデータ処理の手順"結果の概要だけでなく、詳細なビューを提供するような薬剤の画面を視覚化し表現するためにWebページを作成します。他の関連異種の生物·化学データベースへのソフトリンクは、比較と新規研究¹¹の貴重なリソースを提供するだけでなく、統合されています。これらのルーチンによって、適切なデータ標準とメタ情報がこのデータの長期保存のために設定されています。

14。代表的な結果

パイロットの画面では、640から成るライブラリを分析したFDAはgranulの開始、進行や解像度への影響について知られている生理活性物質を承認ocytic炎症反応。抗炎症薬（1）、抗分解能（2）、（3）炎症誘発性およびプロ解像度（4）：観察された効果に基づいて、我々は、アクションの異なるモードを示すことができる免疫調節表現型の4種類に分類、その単調な非線形回帰フィッティング（E ^{AO + ALX} - ）から発生するパラメータの₀と₁で記述することができます初期の炎症に向かって。 _{0 1}一方、炎症反応の大きさを表す曲線の傾きを特徴づけるため、炎症の解像度を説明しています。 2-D特徴空間プロット_（0対_1）ですべての化合物を表示すると、別の免疫調節のカテゴリからヒット候補（ 図3）の自動識別が可能になります。

640化合物のうち、45は50％以下に初期の炎症性インデックスを減らすことによって、有意な抗炎症効果を発揮。 THI内でのカテゴリは、我々は、6の化合物は我々のアプローチの妥当性を確認した非ステロイド性抗炎症薬（NSAIDs）の薬理学的クラスに属するが見つかりました。しかし、NSAIDは最も強力な抗炎症薬の中ではないランクインしています。別に我々はこのような例では、アンジオテンシン受容体拮抗薬（ARB）、抗生物質とプロトンポンプ阻害剤のようないくつかの追加の薬理学的薬剤クラスを発見した非ステロイド性抗炎症薬から。

7の化合物は潜在的なプロの高解像度薬の経験的に定義されているしきい値基準を満たしていた。

18薬は、陽性対照に比べて負傷したneuromastsに誇張された白血球動員の結果、炎症性効果を発揮する。

唯一の2化合物は、炎症反応のタイムリーな解決を妨げた。

パイロット画面coulからいくつかのヒット候補の抗炎症作用（上記の薬理学的薬剤クラスからの典型的な候補者）dは、後続の二次チンアッセイ（データは示さず）で用量依存的に確認することができます。主画面に加わるように4潜在的なプロ解像度薬の再テストは、アクションの指定されたモードを確認していませんでした。薬の2が高濃度（20μM）で若干の抗炎症の可能性を持っていた。 20μM - 第三薬剤は5に至るまでの薬物濃度限界以外の用量依存性の抗炎症効果を示した。第四の薬剤は、試験した濃度で炎症反応に影響を及ぼさなかった。

図1。チンアッセイのワークフロー。個々の化合物トランスジェニックcldnB :: GFP / lysC :: DsRed2の幼虫（3 DPF）は、手動で384ウェルマイクロタイタープレートで配布されています。薬はよくゼファー小型液体ハンドリングワークステーションを使用して、それぞれに同時に追加されます。アッセイプレートを29℃で1時間インキュベート℃でのCuSO ₄を用いた治療 - 負傷を与え、1時間溶液（1​​0μM最終濃度）と急性炎症反応を開始します。最後に、銅溶液や薬剤が洗い流され、自動化された画像の取得は（初期の銅処理後90分）に開始されます。

図2。 Raw画像の概要画像図4の焦点面（Z = 0から3）のRAW画像が表示されます。それぞれ、チャネルCy3標識（左）とGFP（右）で50μmの距離であります。矢印は、（Z = 1,2）の例示的なneuromasts、neuromasts周りにクラスタ化された白血球の矢印（Z = 1,2）の点を示しています。

図3。炎症マップ（IMAPS）個々の実験の成功はカラーコードで炎症反応（生データ）を反映しIMAPSで評価することができる。明るい緑は高い初期インフレを反映している mmatory応答;。黒はなく、炎症がないことを示しタイムポイント0でIMAPS（左）とタイム·ポイント5（右）がはっきりと実験は、さらにデータ処理に含まれるべきであるかどうかを示します。 DMSO対照ウェル（1行目と12）は暗い緑または黒で表示され、一方銅コントロール（行13および24）は、緑の色合いを変化させるに表示されます。時間点5で、炎症はほとんどが緑色または黒の暗い色合いに示すように、銅コントロールで解決されています。 拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。

図4。 FDAの320化合物の2次元特徴空間のプロットは、ライブラリとそれぞれのコントロールを承認したすべての化合物の井戸が非直線に起因するパラメータは₀と₁に基づいて2次元特徴空間プロットで表示することができます回帰継手（d/4203/4203eq1.jpgの "alt ="初期の炎症に向かって/式（1） ">）が、この特徴空間のプロットは、薬物を示すことができる次の4つの免疫調節のいずれかのカテゴリに属する​​興味深い候補の自動識別することができますアクションの"モード：抗炎症作用（1）、抗分解能（2）、（3）炎症誘発性およびプロ解像度（4） 拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。

ディスカッション

ここでは、全体の動物のコンテキスト内で免疫調節化合物の同定を可能にする完全に自動化されたハイスループットスクリーニング戦略を提示します。したがって、急性炎症反応のモニタリングを可能にするとリアルタイムインチ

我々は、傷への白血球動員に対する薬物の影響が完全に機能する自然免疫系の文脈で比較的容易に学ぶことができるので、創薬や薬物再利用の取り組みのための貴重なモデル生物としてゼブラフィッシュを適用するプロトコルを提供しています。我々のアプローチのユニークな利点は、化学負傷はこのように高スループット形式で自動化し、スクリーニングを可能にして、廃止されたマニュアル幼虫の操作をレンダリングするという事実である。

さらに、有害または有毒な薬剤の効果と同様に強力なオフターゲット効果を簡単にセットアップ提案と評価することができる。 FDA承認されたライブラリは、しかし、与えられたスクリーニング濃度での毒性化合物を含んでいませんでした。それにもかかわらず、我々は、テストライブラリの同じ薬理物質のクラスに存在するメンバー間で利用可能なデータ（例えば、免疫調節表現型、薬物濃度）を比較することが明らかに毒性の化合物について提案する。あるが必要な場合は、それ以外の有望な免疫調節表現型を発揮する物質ファミリーの毒性メンバーは、より低い濃度で再テストすることができます。

私たちは彼らの働く免疫調節効果に応じて自動的に分類する治療薬の可能性を実証した。抗炎症性化合物のカテゴリに属する​​薬剤は、独立した実験では、用量依存的にその効果を発揮する化合物の大部分で検証することができます。潜在的なプロ解像度の薬物として同定され、4つの化合物は、これまでのように確認することができませんでした。それはまた、単に解像度に影響を与えない薬はこれまで文献に記載されていないので、この特定の免疫調節カテゴリは、説明するのは困難であることを示しています。しかし、4再テスト薬の3は、高いモル濃度で抗炎症傾向を示した。経験的に定義したしきい値条件を最適化する偽陽性の数を減らすことに役立つはずです。

また、紹介したテクニックは、白血球遊走動作に影響を与える遺伝子の突然変異の同定に利用される可能性を提供しています ⁸。

結び、提案手法では薬剤耐性、毒性、用量ならびに潜在的なオフターゲット効果で容易に入手可能な情報を潜在的な新たなリード構造をもたらす努力を転用、創薬や薬剤を容易にし、加速することができます。したがって、医薬品開発の初期段階で、シンプルでコストと時間を節約する戦略として機能します。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
試薬の名前	会社	カタログ番号	コメント
ジメチル·スルホキシド	カール·ロート社＆株式会社KG	A994.2
銅（II）硫酸塩、無水	カール·ロート社＆株式会社KG	PO23.1
FDAは薬のライブラリを承認	エンツォ生命科学	BML-2841-0100
384ウェルプレートの非結合、μClear	グライナー	781906	黒
オリンパススキャン^ R	オリンポス
ゼファー小型液体ハンドリングワークステーション	キャリパー