ラットの脳から脳表面血管系および関連髄膜の解剖と脈絡叢のビジュアル解説

要約

このビデオプレゼンテーションは、前脳機能をサポートする2つの最も重要性の高い血管構造を収穫する方法を示しています。彼らは、関連付けられている髄膜（MAV）と脳血流と脳脊髄液（CSF）の恒常性に必要である脈絡叢と一緒に脳表面（表層）血管系である。

要約

このビデオプレゼンテーションをサポートしている前脳機能は、適切な脳内に存在しない、最も重要な2つの高度に血管構造を収穫する方法を示すために作成されました。彼らは、関連付けられている髄膜（MAV）と脳血流と脳脊髄液（CSF）の恒常性に必要である脈絡叢と一緒に脳表面（表層）血管系である。採取された組織は、生化学的および生理学的解析に適しており、MAVはアンフェタミンおよび温熱^1,2によって生成される損傷に対して敏感であることが示されている。頭部外傷の震とうの種類を調査する際にも、MAVで収穫されたメジャーとマイナーの脳血管系は、潜在的に高い関心が持たれている。このプレゼンテーションで解剖しMAVは髄膜とメジャーとマイナーの脳表面血管系の軟膜とクモ膜の一部（少なく硬膜）から構成されます。叢は解剖脈絡膜は、lに常駐する構造ですオールドフィールドとマッキンリー^3,4,5,6に記載されているようateralは、心室。これらの二つの組織を採取するために使用される方法はまた、髄膜および大きい脳の表面の血管系を欠いた地域の皮質組織の採取を容易にし、等かかる二つの組織の解剖などの線条体、視床下部、海馬、などの他の脳組織を採取すると互換性があります5から10分の合計から。図に示すように、このプレゼンテーションに記載されて解剖し、MAVと脈絡叢の遺伝子発現レベルは、NCBI GEOのリポジトリでGSE23093（MAV）とGSE29733（脈絡叢）で見つけることができます。このデータにはなっている、とは、MAVと脈絡叢の機能を理解し、それらの機能に悪影響を及ぼすような重篤な神経毒性方法温熱療法とAMPHなどのイベントをさらに支援するために使用されています。

プロトコル

ビデオには示されていないが、ラットは最初3分以内で麻酔で、その結果、ペントバルビタールの300 mg / kgの過剰摂取を与えられ、その後断頭により殺された。自分の脳は急速にその後あったが、慎重に頭蓋骨から削除し、5分間氷冷生理食塩水で冷却。前MAVが皮質（層の上部I）の表面から分離することができるようにMAVを解剖するのにこの時間のために、脳は冷ましておくことが重要です。脳は、その後、氷冷生理食塩水または0.1 Mナトリウムリン酸緩衝化生理食塩水のpH = 7.4の（1 cm深い）でいっぱいでした氷の上で休んでいるガラスシャーレの底に置かれた。すべての解剖は、生理食塩水に浸漬し、ほとんどの部分は脳内で行われます。

1。松果体の除去

1. 脳背側を上（ペトリ皿の底からの相対位置）に置きます。松果腺は、tにちょうど吻側両半球間の最も尾側の腹側領域に位置しています彼は小脳（松凹部）と、ちょうど下またはcolliculusの複数形の上髄膜の表面である。二つの小さな曲がった先端の鉗子を使用して、最初の松果腺を削除します。それは、皮質のような色のピンクですが、多くの場合、血液や脳の除去からの残留血管系の残骸に囲まれています。

2。 MAVの除去

1. "逆さま"の上に脳を裏返し、椎骨動脈、前脳の髄膜と血管から橋をカバー小さい動脈および髄膜を分離します。前脳MAVの除去が開始されます。
   これは、解剖の過程で腹開始することが重要です。ウィリス動脈輪の大きな主要な動脈、中大脳動脈（MCA）と前方動脈最強であり、それによって"足場"として機能軟膜の小さい浅動脈および細動脈次いで、膜を髄膜の残りと皮質から削除することができます。 mのScremin ⁷によるレビューを見る脳の表面の血管系の鉱石を視覚的に表現し、詳細を表示します。
2. どちらの半球で始まる、内頸動脈付け根までちょうど後部後交通動脈を切断するために、小さな曲がった先端の鉗子を使用しています。したがって、前脳の多くの前部と後部動脈木を分離する。対側半球の同じプロセスを繰り返します。
3. MCAとピンセットで前方動脈握る、腹前部皮質（梨、嗅結）をカバーMAVが嗅索上と周囲に持ち上げられるように、前方 - 背側方向に慎重に引き抜いてください。これは、はるかにMAVの前部皮質（帯状と軌道）をカバーを取り除きます。
4. ペトリ皿に45から90°の角度で脳を回します。横方向の皮質領域（粒状島国、二次体性感覚と聴覚野）周辺のMAVの横、より前方の領域は、MCAおよび関連arterを把持することにより皮質から解放することができますIEは、ゆっくりと皮質に沿って背側に引っ張る。必要な場合は、鉗子の端部は、解剖時に大脳皮質からの主要な動脈を持ち上げ、解放するために使用することができます。
5. 今すぐMAVのより後部側方領域を削除します。 （注、これはMAVが寒さと水和したままであることを確認するために、この収穫プロセスの間にもう一方の半球から切り替えるのが最善の方法です。また、皮質からMAVを解放するの抵抗が一時的に反対側の半球に一方の半球スイッチ上で検出された場合し、その後、元の半球に戻ってください。）
6. 一次体性感覚を取り巻くMAVの最も背側領域を削除して、運動皮質は脳背側を上（ペトリ皿の底からの相対位置）に回します。ついに脳からMAVを解放するには、矢状静脈洞に沿って鉗子の先端を使用しています。
   収穫MAVのこの部分は、どちらのテストおよび分析まで氷冷生理食塩水で一時的に保持されるか、または後で処理するために凍結することができる。しばしば皮質のほとんど後部/尾側領域（、嗅内視覚と最も尾側の聴覚野）をカバーするMAVは皮質に接続されたままである。その除去はretrosplenial皮質とcolliculusの複数形を覆う間にMAVを解剖しているビデオの後半で示されています。

3。脈絡叢の除去

1. アップポジション脳背側と半球の間の正中線を通って小さな鉗子を押し下げ、その後の頂部に皮質と脳梁（ブレグマから≈-3.3ミリメートル）を通して穿刺に端を使う大きなピンセットで所定の位置に保持する海馬の正中線。
2. 側脳室の大部分を露出させ、背側海馬および中隔から梁と皮質を引っ張るためにピンセットを使用しています。脈絡叢が位置し、その長さを実行して主要な動脈を画定赤い波線によって識別することができます。第三VENの横方向の壁をこじ開け鉗子の両端を使うtricle、最も尾側（ブレグマ⁸から≈-4.3ミリメートル）で拡大します。
3. 小さなピンセットを使用して、脈絡叢無料のこの端を引き出します。次にセプタムおよび尾状​​核/被殻の間には非常に前歯部（最も吻側程度、ブレグマから≈1.6ミリメートル）に移動し、鉗子は、心室のこのセクションを拡大し、脈絡叢フリーを引っ張ると。第二残りの脈絡叢を得るために反対側の半球に同じ手順を実行します。
   もう一度、この組織はどちらのテストおよび分析まで氷冷生理食塩水で一時的に保持されるか、または後で処理するために凍結することができる。

4。 Retrosplenial、聴覚と視覚野を含む皮質のより尾地域でだけでなく、その視床とcolliculusの複数形の上を覆う第³脳室に残っているMAVの除去

1. 視床とcolliculusの複数形の上MAVをさらす両半球から海馬全体を削除します。の除去MAVのこの部分は皮質上にMAVの除去よりもはるかに少ないことは困難である。
2. 視床の前方部分を覆う大きな血管を把持し、静かに尾側に引いて、MAV無料のこの部分を引き出します。この血管系は、前掲のcollicularネットワークに接続され、背側海馬と背側視床網に血液を供給しています。尾動脈輪の血管系の最後の部分に到達するまで尾と徐々にフリーsupracollicularネットワークを引き離します。
   この時点で、それ以上のケアが粒状retrosplenial、一次聴覚と視覚野の表面に残っている後部腹MAVを除去するために注意しなければなりません。皮質のより前方の部分を覆うMAVの他のセクションと同様に、この組織はどちらのテストおよび分析まで氷冷生理食塩水で一時的に保つことができるか、後で処理するために凍結した。この第二のMAVのセクションで集め、残りの後部腹MAVを削除する必要があります彼らは別々に分析される場合は、dは、皮質を覆う第解剖MAVセクションに追加。

5。代表的な結果

解剖が正しく実行されると、結果として、MAVの組織は、45〜約35mgの総重量2無傷のエンティティである必要があります。皮質の大部分を取り囲む最初に解剖したMAVが約25mgと視床をカバーMAVを比較検討する必要があり、colliculusの複数形と後頭葉皮質は、約15 mgを比較検討する必要があります。これは、血管系内の残留血液から色で少しピンクがかったでなければなりません。二国間の脈絡叢収穫は各重量1から2 mgの2無傷の組織サンプルでなければなりません。余分な水は、組織の損失を回避するために、このようなレンズのクリーニングで使用されるのとティッシュペーパーを使用して、ストレージや処理に先立って、MAVから削除することができますが、それは解剖脈絡叢から余分な水分を除去するのは良いアイデアではありません。 図1のために生成されました表現にprofil比較で存在しているGSE23093とGSE29733、NCBI GEOのアクセッション＃GPL7294;アジレント-014879全ラットゲノム4x44K 60merのオリゴヌクレオチドアレイ（G4131F、アジレント·テクノロジー、パロアルト、CAを使用して制御条件下での3地域でES（線条体、頭頂皮質およびMAV） NCBI GEOのリポジトリ）。 1）線条体は、頭頂葉皮質に比べ、2）MAVが頭頂葉皮質に比べで、図中の2つのプロットは、絵を用いて発現を示す。それは、線条体と頭頂葉皮質がはるかに密接にMAVよりお互いに関連していることは明らかである。 MAVと脈絡叢を比較したデータは、将来の刊行物に発表される予定です。しかし、それは、MAVと脈絡叢における発現プロファイルがより密接に彼らは線条体と頭頂葉皮質にあるより、相互に関連している可能性があります。 図2は、差動遺伝子発現温熱療法への応答（EIH）対AMPH MAVで比較コントロールとお互いに。

内容は ">対照動物のMAVの公式NCBIの遺伝子記号と11,000人以上の遺伝子の遺伝子発現が線条体と頭頂葉皮質に記録されたものと比較した。これらの遺伝子の2000以上のMAVで2.5倍以上異なる表情を持っていた2神経が豊富な組織と比較して、550遺伝子は発現が10倍以上の差があった。これらのわずか40％以上（253）は、MAVで10倍以上の発現が減少している遺伝子であったとに関連していた神経機能。と343遺伝子は、頭頂葉皮質と線条体に比べMAVで10倍以上の過剰発現がありました。遺伝子のこのリストは、MAVで非常に高い濃縮度を持つ遺伝子を決定することを起点として使用した。 表1リストMAVで15倍式より大きいと遺伝子頭頂皮質および線条体と比較すると機能に関して、それらを分類しています、これらの遺伝子の多くは、血管系および/ ​​または免疫系に関連していた。これらトン遺伝子のypesは約5豊かにされるべきである - 10 - に増えたため、血管系自体とその内に存在する血液の倍。しかし、既知の一般的な血管機能を持つ遺伝子について、15​​倍を超える増加は、MAVで濃縮を示しています。遺伝子の数はそれぞれ非常に大きな倍率変化でもあった、1）細胞外マトリックスタンパク質（特に血管系に関連していない）、2）溶質トランスポーター3）脂質とレチノイン酸代謝。同様に、いくつかの増殖と分化の遺伝子または転写因子が発見された。

図1。頭頂皮質および線条体とMAVにおける遺伝子発現の比較。頭頂皮質および線条体（上のプロット）と頭頂皮質およびMAV（下のプロット）の遺伝子発現レベルを比較火山プロット。赤いシンボルは大きく異なるbetweある遺伝子を示すp <0.05で専用地域と地域の間に1.5倍以上の発現差を持っています。黒シンボルは有意（p> 0.05）の領域の間に違いはありません遺伝子を表しており、1.5倍の発現が異なる未満です。ピンクの記号はp <0.05で式の中で1.5倍の差よりも小さいが、統計的に有意に異なる遺伝子を持つことを示す。黄色のシンボルが1.5倍以上の発現を持っていますが、この変更はp <0.05で統計的に有意ではない遺伝子を同定する。

略語

AMPHアンフェタミン
EIH環境誘発性高体温
MAVの髄膜および関連する脳血管系
ノーム体温コントロール

図2。比較温熱療法とMAVにおける遺伝子発現に対するアンフェタミンの効果。火山プロット3時間の時点で生理食塩水、EIHまたはAMPH後にMAVでの遺伝子発現レベル。赤いシンボルは黒ドット/円は大幅に領域間で異ならない遺伝子を表して有意差があるとみなされている遺伝子を示す。追加の統計解析は、制御および治療法の違いは統計的に有意で、実際にはそのうちの発現を確認するために使用されていました。

MAV式脳式	NCBIの遺伝子記号	組織特異性または報告された機能（複数可）
> 50倍	Anxa2、Col8a1、DES、Esm1、Glycam1、KL A、Lect1、Lepr、ラム、Myh11、OGN、Tagln、THBS2、Tnnt2	血管系＆ハート
> 50倍	CCL19、CD74、Defb1、Lrrc21、Mgl1、MRC1、Msln、PLa2g5、PRG4、RT1-BB、RT1〜ダ	免疫システム
> 50倍	ADH1、Aebp1、Aldh1a2、Gstm2	レチノイン酸＆脂質処理
> 50倍	CDH1、COL3A1、COL1A2、Colec12、Cpxm2、CPZ、DCN、Emp3、GPC3、Nupr1、OMD、Pcolce Slamf9、Tmem27、Tspan8	細胞外マトリックスと細胞間結合
> 50倍	AQP1、Asgr1、Kcnj13、Slc5a5、Slc6a13、Slc6a20、Slc22a6、Sned1、TTR	イオン＆溶質ホメオスタシス
> 50倍	Alx3、Cdkn1c、Foxc2、IGFBP2、Ifitm1、Ifitm2、Nkx6-1、OSR1、Prrx2、Sfrp1、Tbx15。 Upk1b、Wisp2、Wnt6	開発＆転写調節
> 50倍	Gpha2、Mfap5、Mpzl2 Plac8、Scgb1c1、Sostdc1、Steap1	不明＆その他
30から50倍	Anxa1、Angpt2、C6 A、GJB2、Ptgis、Thbd、TIMP1	血管系＆ハート
30から50倍	Casp12、CCL2、CCR1、CD14、CXCL10、Ifitm3、Klra5、Lgals1、Lgals3、Ms4a4a、Ms4a7、Plscr1、SPP1、XCL1	免疫システム
30から50倍	Col6a3、Cpxm1、Efemp1、FMOD、MGP、Nid2	細胞外マトリックスと細胞間結合
30から50倍	Cpは、Cubn、Gcgr、S100a6、Scn7a、SCT、Slc4a5、Slc16a11、Slco1a5	イオン＆溶質ホメオスタシス
30から50倍	CFD、Ch25h、Crabp2、Rarres2	レチノイン酸＆脂質処理
30から50倍	Bmp6、Casp12、DAB2、Folr1、IGF2、MSX1、Tbx18、Twist1、Wnt5b	開発＆転写調節
30から50倍	Cela3b、Cln6、C1qtnf7、Copz2、Dhrs7c、Gng11、Prss23、Srpxは、Vim	不明＆その他
15から30倍	ADM、ANGPT1、Angptl2、BGN、Cklf A、Cnn1、Cox8h、Ctsk、F13a1、Gja5、Klf4の、LOX、LYZ、Myl9、PROCR、Pros1、RT1-BA、Serpinb10、Serping1、Serpinf1、Tgm2、Tnmd、Trim63、Txnip 、Vamp5、VTN	血管系＆ハート
15から30倍	エイダA、BST2、Ccl6、CD40、CD68、CTSC、DAP、Faim3、Fkbp9、Fxyd5、FMO1、Glipr1、Ier3、Ifi47、Igsf6、MSC、Nfatc4、RT1-DB1、Serpinb1a、Tir4、Tubb6	免疫システム
15から30倍	Adamtsl4、COL1A1、CRB3、DPT、Egfl3、FBN1、Fbln1、Fbln5、FN1、Itgb4、Lama2、Lgals3bp、LOXL1、Mfap4、MMP14、Mmp23、PPIC、Serpinh1、Timp3	細胞外マトリックスと細胞間結合
15から30倍	Cybrd1、Selenbp1、Slc2a4、Slc9A2、Slc13a3、Slc16a4、Slc22a8、Slc22a18	イオン＆溶質ホメオスタシス
15から30倍	Agpat2、Bdh2、Cyp26b1、Lpar3、Ltb4dh、Olr1、Pon3、Rbp1、RBP4	レチノイン酸＆脂質処理
15から30倍	ATF3、Dkk4、Eya2、Ifitm7、Ltbp1、Mustn1、Nr2f2、Ptrf、Sphk1、TGFBI、Tcea3 Tcfap2b、Wnt2b、Wnt5a、Zic1	開発＆転写調節
15から30倍	Adamts12、Adamtsl3、C1R、Crispld2、Crygn、CYP1B1、DSE、Enpep、Enpp2、Epn3、FLNA、FMO3、GNMT、Gprc5c、Hspb1、Klc3、Krt18、Krt19、MDK、Mesp1、Ms4a6a、Ms4a6b、Ms4a11、NET1、Pdlim2、 Phactr2、PLP2、Ppp1r3b、Pqlc3、RIN3、Spag11、Sult1a1、Tmem106a、Wfikkn2	不明＆その他

^*表には含まれて遺伝子は線条体とパリエットの両方で、15以上の倍上記の式でなければなりませんアル皮質およびバックグラウンドレベル上記の5倍​​。各遺伝子の二つの比率（MAV /線条体またはMAV /頭頂葉皮質）の下、グループ化のために使用された。

遺伝子は内皮細胞で見つけたが、また、おそらく免疫応答を媒介する主要な役割を果たしています。

表1 15倍^*以上を有する遺伝子線条体と頭頂葉皮質に比べMAVで発現増加。

ディスカッション

テクニカルMAVの側面および脈絡叢郭清

それは、脳が生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水または水酸化ナトリウムでほとんどの時間を "水没"を持っているMAVの解剖時に重要です。 MAVと皮質は解剖中に脱水できるようにすると、これはMAVおよび/または皮質からこれらの付着MAVのセクションを削除することができないことの結果で収穫皮質組織の量が増加します皮質層Iにしっかり付着し、MAVになります。また、忍耐は解剖時に必要です。一つは解剖中に1つの半球の皮質からMAVを除去する際にいくつかの抵抗に遭遇した場合、もう一度、他の半球に切り替えて抵抗が発生した側に後で戻ってください。この方法は完璧にいくつかの練習時間がかかりますかとMAV組織の一貫して均一な収穫が達成される前に、約5〜15 "実践"解剖を必要とします。解剖とレモの起動方法脳の基底部における動脈輪でMAVのvalは、サポートとして大きな血管系を使用することによって髄膜の除去を容易にする "足場"を

多くの血のもともとMA​​V血管系の犠牲の後には、解剖時に排出されるべきである、とMAVから収穫されたRNAの5％未満では、血液由来のものである必要があります。断頭し、脳を除去する前の組織学的技術を用いて、生理食塩水50〜70mlで動物を灌流することで、ほとんどすべての血液を除去することが可能です。しかし、その後、解剖時にMAV組織を視覚化することがはるかに困難です。 MAV組織の "汚染"の3つの最も可能性が高いソースは松果体、皮質層I組織と残留嗅球組織であるが、それは準備のために下垂体組織を取得することも可能です。 MAVで松果体汚染が濃い赤色であるラウンド1〜2mmの直径の球体を含むMAVによって検出されます。主要機能松果体は、通常、MAVとは全く異なるものと見なされます。その主な機能は、概日リズム⁹の側面を調節し、脂質前駆体のlipoxygenation ¹⁰でメラトニンを生成することです。リポキシゲナーゼ活性を制御する遺伝子のLOXが 、主に松果体¹⁰の大人に存在すると考えられていたが、我々の結果は、それはまた、MAVの大幅なレベルで一貫して存在することを示す。ずっとそれで囲まれた色の淡いアール一部の1〜2mmの緻密な組織を持つピンクがかったクモの巣のようなMAV組織中の残留皮質や嗅球汚染の結果。これは、バッファの表面にMAVを "浮遊"してから、2解剖鉗子を使用して重い皮質または電球組織を除去することによって発見することができます。

皮質層私は組織、視床下部組織または松果腺からMAVの汚染が存在しているなら、いくつかの遺伝子が有意になります"クリーン"解剖で通常存在するものよりも大幅大きい式。松果腺とMAVの汚染は、メラトニンの合成に必要であるアリルアルキルアミンN-アセチルトランスフェラーゼ（Aanat）のより高い発現をもたらすでしょう。松果体の汚染は、MAVの解剖中に発生した場合、残念ながら、MAVでLOXのレベルが正確に判定することができません。皮質組織とMAVの汚染は、このようなhippocalcin（HPCA）、パルブアルブミン（Pvalb）および/ ​​または神経ペントラキシン受容体（Nptxr）などのニューロン特異的遺伝子の高発現をもたらすでしょう。視床下部組織とMAVの汚染は成長ホルモン1（GH1）、プロオピオメラノコルチン（POMC）のより高い発現をもたらすでしょう。収穫された組織内の一部の汚染が存在しない場合においては、これらの遺伝子のほとんどが同定され、遺伝子発現解析で使用されていないことができます。これは循環BLOに存在する遺伝子のために特に重要であるまだMAVや脈絡叢に存在してもよいOD。

収穫MAVと脈絡叢からの遺伝子発現データを解釈する

関連付けられている髄膜（MAV）と脈絡叢と一緒に脳表面（表層）血管系は脳血流と脳脊髄液（CSF）ホメオスタシス^{4,11、12、13、14、15、16、17}のために必要である。組織の収穫は生化学的および生理学的解析に適している、とMAVは、遺伝子発現解析によるアンフェタミンおよび温熱^1,2によって生成される損傷に対して敏感であることが示されている。また、これらの結果は、重度の温熱療法と一般^18,19,20における脳血管系へのアンフェタミンへの暴露について知られているものに見合っています。ヒトでの臨床データは硬膜下血管系はアンフェタミンとメタンフェタミン^21,22による損傷に対して敏感であるという信念をサポートしています。同様に、メジャーとマイナーの脳血管系は含め頭部外傷^{23,24 25}の震とうの種類を調査する際に潜在的に高い関心があるMAVに収穫さ軟膜髄膜の層でそれらをING。 MAVから得られた現在の遺伝子発現プロファイルは、軟膜とくも膜おそらく髄膜は脳脊髄液の組成を調節するのに予想以上に大きな役割を果たしている可能性があることを示しています。将来的には、解剖顕微鏡の技術の使用によって、それは軟膜とクモ膜が存在し、おそらく互いに大きな動脈の血管系から分離することができ、さらに、MAVを含む組織を分離することが可能することができるようにします。これは、収穫したMAVのこれらの3つのコンポーネントの各々の機能の良い解釈を可能にするでしょう。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
試薬/機器の名称	会社	カタログ番号	コメント（オプション）
生理食塩水（生理食塩水9グラム/ 1リットルのH 2 O）	社内		解剖バッファ
0.1Mリン酸ナトリウムpH7.4の	社内		解剖バッファ
骨Rongeurs	Roboz	RS-8300	頭蓋骨除去
鉗子曲がった先端部（4 "ロング＆0.8ミリメートル広いチップ）	Roboz	、RS-5135またはRS-5137	解剖用ピンセット
鉗子ストレートチップ（5.5 "長さ）	Roboz	、RS-8124またはRS-8104	親指ドレッシング鉗子