を経て製造複合抗生物質エリスロマイシンをフィーチャーロジック、実験の手順、および異種天然物合成の可能性<em&gt; E大腸菌の</em

Ming Jiang; Haoran Zhang; Blaine A. Pfeifer

doi:10.3791/4346

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Method Article

を経て製造複合抗生物質エリスロマイシンをフィーチャーロジック、実験の手順、および異種天然物合成の可能性

DOI:

10.3791/4346

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January 13th, 2013

Ming Jiang¹, Haoran Zhang², Blaine A. Pfeifer¹

¹Chemical and Biological Engineering Department, State University of New York at Buffalo, ²Chemical Engineering Department, Massachusetts Institute of Technology

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要約

スルーエリスロマイシンの異種合成 E大腸菌の以下のような実験の手順が含まれます。各ステップは、使用しての治療自然な製品の生産に意欲、可能性、そして課題の文脈で説明する E大腸菌の代理ホストとして。

要約

複雑な天然物の異種生産は現在の限界と今後の可能性に対処するために設計のアプローチである。それは治療的価値を有しているが、十分に生産または製造の改良型の恩恵を受けることはできませんこれらの化合物のために特に有用である。 2）異種の再構成、3）製品分析1）遺伝的伝達：関与の実験手順は、次の3つのコンポーネントに分割できます。各実験コンポーネントは課題を満たすとこの新興アプローチに関連する機会を予想する継続的な最適化の下にあります。

異種合成は、貴重な天然物の責任遺伝子配列の同定から始まる。異種宿主に、このシーケンスを転送は、製品の形成に関与する生合成経路の複雑さによって複雑になる。抗生物質のエリスロマイシンが良い例です。二十の遺伝子（）> 50キロバイト、総額は最終的な生合成に必要とされています。さらに、これらの遺伝子の3つのサイズがmegasynthases、マルチドメイン酵素それぞれ〜300kDaのをエンコードします。この遺伝物質を設計し、 大腸菌に転送する必要があります再構成された生合成のための大腸菌 。 PCR産物の分離、オペロンの構築、マルチcystronicプラスミド、および電気変換の使用は、エリスロマイシンの大腸菌への遺伝的クラスタを転送することで説明される大腸菌 。

一度転送、 大腸菌大腸菌細胞は、最終的な生合成をサポートする必要があります。このプロセスは、Eとの間の実質的な違いは与えられた挑戦している大腸菌や複雑な天然物の形成に関与する最も元ホスト。セルは、生合成をサポートし、協調的に活性な酵素を生成するために転送遺伝クラスタを表現するために必要な基質を提供する必要があります。エリスロマイシンA、Eの場合には大腸菌細胞は、2つの前駆体（PRを提供するように設計しなければなりませんでしたopionyl-CoAと（2S） - メチルマロニルCoA）生合成に必要。また、遺伝子配列の変更、プラスミドのコピー数、シャペロニン共発現、翻訳後修飾酵素、およびプロセス温度も最終エリスロマイシン形成できるようにする必要がありました。

最後に、成功した生産が評価されなければならない。エリスロマイシンのケースでは、我々は2つの方法を紹介します。第一は、液体クロマトグラフィー - 質量分析（LC-MS）が生産を確認し、定量化することである。エリスロマイシンの生物活性はまた、抗生物質活性を枯草菌に対してテストされているバイオアッセイを使用することによって確認される。エリスロマイシン確立アセスメントアッセイEから生合成大腸菌や生産を改善したり、多様化する将来のエンジニアリング作業のために、このアプローチを使用して、新しい複雑な天然化合物の生産のための段階を設定します。

概要

エリスロマイシンは、グラム陽性土壌細菌サッカerythraeaによって生成されるポリケチド抗生物質であり、現在の生産量は徐々に伝統的な変異誘発およびスクリーニングプロトコルの十年を通じて、より最近でプロセスの最適化スキーム^〜1-6〜10グラム/ Lに向上しました。変異誘発およびスクリーニング戦略は培養及び/の難しさの結果として、または遺伝的にネイティブの本番ホストを操作し、容易に入手できるので、抗生物質活性や選択を支援するための改善された成長の表現型の抗生物質の天然製品開発では一般的である。エリスロマイシンA、Sの場合にはerythraea生産と新規な誘導体の生合成の急速な進歩を妨げ、したがって、遅い成長プロファイルとより直接的な遺伝子操作技術の欠如（ 大腸菌などの生物に比較して）によって制限されます。生産性の問題を認識し、diversificatiの鍵を開けたエリスロマイシンAのような化合物を用いた可能性について、研究コミュニティは異種合成（ 図^1）7のアイデアを追求し始めた。これらの努力は、エリスロマイシン遺伝子クラスター^8月11日のために利用可能な配列情報と一致した。それを配列決定し、複雑な天然物の遺伝子クラスターの数が大幅にエンコードされた薬効がある可能性にアクセスするための異種合成における継続的な努力のための原動力を提供し^{、12から16を}