<sub&gt; 1</sub&gt; F<sub&gt; O</sub亜ミトコンドリアの小胞膜のパッチクランプ記録を実行するための&gt; ATPアーゼ小胞の準備とテクニック

要約

ラット脳からF1FO ATP合成酵素複合体に富む亜ミトコンドリアの小胞を単離する方法が記載されている。これらの小胞はパッチクランプ記録の技術を使用してF1FO ATPアーゼ複合体の活性の研究とその変調を可能にする。

要約

ミトコンドリア代謝、生存^1、開発および、カルシウムシグナリング²を含む多くの重要な細胞機能に関与している。最も重要なミトコンドリア機能の二つはATP、酸化的リン酸化による細胞のエネルギー通貨、およびプログラムされた細胞死^3つの信号の調停を効率よく製造に関連している。

ATPの生産を主に担当する酵素はまた、ATP合成酵素と呼ばれる^4-5 F1FO-ATP合成酵素である。近年では、アポトーシスおよび壊死細胞死におけるミトコンドリアの役割は、かなりの注目を集めている。アポトーシス細胞死では、このようなBaxのようなBCL-2ファミリータンパク質は、ミトコンドリア外膜を入力してオリゴマー化し、サイトゾル⁶にプロアポトーシス因子を放出し、外膜を透過性。古典的な壊死性細胞死で、このような神経細胞における虚血や興奮毒性、ラーグによって生成されるようにeは、マトリックスカルシウムに難規制増加は、内膜の細孔の開口部、ミトコンドリア透過性遷移孔またはMPTPに貢献しています。これは、内膜を脱分極と外膜の破裂、プロアポトーシス因子の放出、代謝機能不全に貢献する、浸透シフトを引き起こす。のBcl-xLの⁷を含む多くのタンパク質は、その機能を調節する、F1FO ATP合成酵素と相互作用する。 BCL-XLはF1FO ATP合成酵素のβサブユニットと直接相互作用し、この相互作用はF1FO ATPase活性⁸中F1FOによってH +の正味の輸送を増加させる、F1FOATPasecomplex内に漏れコンダクタンスを減少させ、それによってミトコンドリアの効率を高める。 ATP合成酵素の活性及び変調を研究するために、我々はF1FO ATPアーゼを含む齧歯類の脳亜ミトコンドリアの小胞（SMVs）から分離された。 Alavian らに示されているようにSMVsはF1FO ATPアーゼの構造および機能の完全性を維持する。ここでは、方法が記載さ我々は、ラット脳からSMVsを単離するために正常に使用していると我々はSMVsのチャネル活性を分析するためのパッチクランプ法（イオンリークコンダクタンス）を描くこと。

プロトコル

1。脳ミトコンドリア単離（ ブラウンMRらから適応^。9）

1. インスティテューショナルアニマルケアと使用委員会（IACUC）によって承認された方法を用いてラットを生け贄に捧げる。
2. 断頭により、動物の頭をカットし、皮膚をカットし、頭蓋骨を公開します。
3. はさみや骨鉗子で切断してそっと頭蓋骨を開きます。脳を取り外します。
4. 分離バッファにおける小脳（ 表1を参照）することなく、細かく脳をミンチし、5ミリリットルガラス/テフロンホモジナイザー（機器リストを参照）に転送します。
5. そっとティッシュをホモジナイズ10回（無気泡）、約5分。
6. 4時10分°Cベンチトップ遠心分離機で用1,500×gでサンプルを遠心分離します。
7. 上清を保存（ミトコンドリアとシナプトソーム）とペレット（核物質と細胞の破片）を捨てる。ベンチトップ遠心分離機で4℃で10分間、16,000×gで遠心分離します。
8. 捨てるアイソレーションバッファー500μlの上清と再懸濁ペレット。細胞破砕容器（機器リストを参照）シナプトソームを乱す。急減圧が続く10分間のために1,200 PSIの圧力を適用します。
9. 126500で層フィコール勾配上に混合物（ 表2参照）、SW-50.1ローターと遠心で行わ×gで4℃で20分間遠心°におけるC（機器リストを参照してください）。ペレットを精製ミトコンドリアで、フィコールの異なる密度の間の層は未破砕シナプトソームです。
10. 4時10分°ベンチトップ遠心分離機でC用16,000×gで分離バッファに遠心分離によってペレットを洗浄。

2。亜ミトコンドリアの小胞（SMV）アイソレーション（チャンら ¹⁰から適応）

1. 1％ジギトニン等量と組み合わせる200μlのアイソレーション·バッファ内のミトコンドリア再懸濁、15分間氷の上に座ることができます。
2. より多くのアイソレーションバフを追加16,000でERと遠心×4 gで10分間°ベンチトップ遠心分離機でC。これを2回行う。
3. 200μlのアイソレーションバッファーでペレットを再懸濁すると10％Lubrol PX（C12E​​9）2μlのを追加します。混ぜ、15分間氷上で座ることができます。
4. 分離バッファ上に層混合物、182,000でSW-50.1ローター遠心×4のG℃で1時間で場所。
5. 4℃で10分間16,000で分離バッファで卓上遠心×gでの遠心分離することにより最終的に得られたペレットを洗浄します

3。電気生理学的記録

1. 典型的な電気生理学リグは、増幅器、pClamp10.0ソフトウェア、マニピュレータ、顕微鏡、防振台、ファラデーケージと一緒にDigidata 1440Aアナログ - デジタル変換器インタフェースを備えたPCのコンピュータを含む。
2. ホウケイ酸ガラスキャピラリーチューブはフレーミング/ブラウンマイクロピペットプラーモデルP-87に挿入されます。ピペットプラープログラムに最適化されていますMΩ80〜100の間に抵抗とピペットを生成します。
3. SMVs生理的細胞内液（ATP、記録中に適切な時間に加算されます）（ 表3）に配置されます。パッチクランプピペットは、同じ溶液（無ATP）が充填されている。レコーディングを室温でSMVsにギガオームシールを形成することによって作られる。小胞はニコン又はツァイス倒立顕微鏡と位相差顕微鏡によって可視化される。
4. 膜電位は、-100 mVでから10秒の期間で+は100mVの範囲の電圧で維持される。録音はアンプ回路を使用して5 kHzでフィルタリングされます。 1未満の浮遊pAの電気的又は非特異的なノイズのレベルが成功記録のために望ましい。
5. データは、単一チャネル·イベントの周波数と振幅を決定するために、例えばClampfit 10.0ソフトウェアを使用して分析される。電圧依存性は、直流電圧の関係をプロットすることによって決定される。

結果

我々のプロトコルの最初のステップは、 図1のウェスタンブロットにより示されるようにミトコンドリアの単離精製を可能にする。 図2に脳由来亜ミトコンドリアのベシクルパッチ記録の一例を示している。インサイドアウトパッチ構成を用いて、我々は、ATPによって変調されたチャネルの活性を示す。コントロール（CTL）記録（左）は平均で600 psのピークコンダク?...

ディスカッション

この方法によってphenotypes.SMVspurified細胞の区別なく全脳から、手順2の後にここに、ステップ1の終了時に純粋なミトコンドリアの分離を可能にし、亜ミトコンドリアの小胞（SMVs）に記載された方法は、に示されているように他の細胞内小器官による汚染の本質的に自由である図1に、私たちの前の仕事（Alavian KN ら ^8）、凍結前にその構造と機能の整合性を保持しま?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Potter-Elvehjem Tissue Grinder withPTFEPestle	Krackeler Scientific, Inc.	1-7725T-5
Eppendorf Centrifuge 5424	Eppendorf	5424 000.410
4639 Cell Disruption Vessel	Parr Instrument Company	4639
Ficoll	Sigma-Aldrich	F5415
Polycarbonate centrifuge tubes	Beckman Coulter	P20314
SW-50.1 rotor	Beckman Coulter
L8-70M Ultracentrifuge	Beckman Coulter
Digitonin	Sigma-Aldrich	D5628
Lubrol PX (C12E9)	Calbiochem	205534
Axopatch 200B	Axon Instruments
Digidata 1440A	Molecular Device
pClamp10.0	Molecular Device
Manipulator	Sutter Instrument
Borosilicate glass capillary	World Precision Instruments	1308325
Flaming/Brown Micropipette Puller Model P-87	Sutter Instrument