逆行性冠灌流によってブタ心臓の脱細胞化するための手順

要約

迅速かつ完全に逆行灌流を通して無傷ブタ心臓から細胞成分を除去するための方法が記載されている。この方法は、複数の臨床アプリケーションで使用するための可能性を秘めているサイト固有心筋細胞外マトリックス足場が得られます。

要約

主に足場のネイティブアーキテクチャを維持しながら、灌流ベースの全臓器の脱細胞化は最近、サイト固有の細胞外マトリックスの足場を作成するための手段として、組織工学の分野で関心を集めています。現在までに、このアプローチは、心臓、肺、肝臓^1月5日を含めて、臓器の様々なシステムで利用されている。簡単にアクセスできる血管網なしで組織のための前の脱細胞化法は、界面活性剤、酸、または周囲の細胞外環境^6月8日から細胞および核成分を除去するための手段として、酵素処理のソリューションに対する組織の長期の暴露に依存してきた。しかし、拡散を介して組織に浸透するソリューションの能力に応じてこれらの方法ヒンジ式の有効性。 decellularizatiのとは対照的に、自然の血管系による臓器の血流を効果的に拡散距離を減少させ、促進輸送組織のうち、組織および細胞成分にエージェント上。ここで、我々は完全に冠状逆行灌流を通して無傷ブタの心臓をdecellularizeする方法について述べる。プロトコルは、無傷の心臓の3次元構造を完全に脱細胞化された心臓の細胞外マトリックス（C-ECM）の足場を得た。我々の方法は、酵素、界面活性剤、および細胞の溶解および除去を助けるため高張低張とリンスと相まって酸のシリーズを使用していました。プロトコルは、細胞物質の除去を助けるためにTriton X-100およびデオキシコール酸ナトリウム溶液に続くマトリックスから細胞を分離するためにトリプシン溶液を使用していました。説明されたプロトコルはまた、長時間の2リットル/ min以上の灌流速度を使用します。細胞破片の汚染なし、組織への薬剤の輸送許可ソリューションの変更と相まって、高流量、および組織のリンス効果を確実にした。記載された方法はNATIからすべての核物質を除去様々なアプリケーションに使用することができ、サイト固有の心臓ECMの足場を作成VEブタ心臓組織、。

プロトコル

1。組織の準備と実験セットアップ

1. 食肉処理場や研究施設からすぐに安楽死の後に収穫豚の臓器と過剰血を洗い流す。心房と大動脈をそのまま維持し、余分な脂肪や組織の中心部をトリミングします。離れて大動脈から肺動脈を分離する脂肪トリミング。組織内の任意のカットがある場合は、適切に廃棄してください。
2. 冷凍庫の紙で個別にそれぞれの心をラップし、完全凍結を確実にするために、少なくとも24時間、-80℃の冷凍庫内のすべての組織を保管してください。
3. ときに使用する（通常3ヶ月未満）、一晩4℃で4リットルのビーカーに沈めタイプ1の雪解け水1そのまま冷凍ブタ心の準備ができて
4. 心が完全に解凍された後、心が乾いたなで心を量ると、体重を記録する。市場重量豚の心臓部は、約375〜450グラムの重量を量るべきである。
5. とげのある減速機の¼ "最後までサイズで18マスターフレックスチューブを接続します。有刺鉄線減速機を挿入し、大動脈内側チューブ。ちょうど腕頭動脈の下、大動脈周囲に2ホースクランプまたはセキュアジップタイを置きます。減速機とチューブは大動脈弁ので、冠状動脈が灌流することができます（図1）以上を保つ必要があります。
6. タイプIの水でチューブを埋めるために30または60 mlの注射器を使用しています。そのおおよその中点でマスターフレックスローラーポンプのカートリッジ内にチューブを挿入します。流入水2.5リットルを充填した4リットルのビーカーの底にチューブの端とチューブを固定沈める。
7. 水、気泡を除去するためにプライムポンプを入れたビーカーに心を置きます。気泡がチューブが挿入されている大動脈から来て認められた場合には、大動脈には、追加の関係で再配置または確保する必要があるかもしれません。気密シールは脱細胞化処理（図2）の間に十分な圧力を維持することが重要です。
8. 0.2パーセントTrypsin/0.05％EDTA/0.05％のNaN 3 Lを含む4リットルのビーカーを置きプレートをかき混ぜ、脱細胞化処理の準備で37℃に温めて上の3ソリューションを提供します。

2。組織リンス

1. 正しいチューブサイズを選択していることを確認、400ミリリットル/分の流量にポンプを設定します。 15から25分間、私は水を入力して心臓をフラッシュします。ポンプが開始されると、心臓が心室から血液を膨潤し、発散させるべきである。新鮮なソリューションは、すべての5〜10分間に置換、あるいは心臓から削除される血液の量に基づいて、必要に応じなければならない。血液は心臓から流出していない場合は、必要に応じてチューブとクランプを調整します。
2. ポンプを停止し、緩衝生理食塩水（PBS）2Xリン酸で満たされた別のビーカーに心を移す。チューブを溶液中に浸漬された後、ポンプを起動し、700 ml / minに流量を増加させる。心臓は、ソリューションごとに5分を変え、15分間溶液中に残るはずです。各ソリューションの変更は、組織とチューブを移動させながら、ポンプを一時的に停止させておく必要があり新しいビーカーに。
3. 10分間、私は水を入力し、750 ml / minに流量を増加するために、心臓を転送します。

3。脱細胞化とソリューション灌流

1. 0.2パーセントTrypsin/0.05％EDTA/0.05％で、37のNaN _3℃の入ったビーカーに心を移す1200ミリリットル/分にポンプ速度を増加させ、ポンプを起動します。ビーカー中の溶液を循環させるためにビーカーの底に置か攪拌棒を使用しています。心臓は3時間の合計を37℃で0.2パーセントTrypsin/0.05％EDTA/0.05％のNaN ₃溶液中に残るはずです。 1時間後、1,500 ml / minにポンプ速度を増加させる。追加の時間後、1,800 ml / minにポンプ速度を増加させる。組織は徐々に条件を組織に増加灌流速度を施し、血管の破裂を防止しています。心臓が膨張し、ほぼプロトコルのこのステップの間にサイズが2倍になります。組織は目を通して心房から頂点へと進行する、その自然な色を失うことになるメールプロトコル（図3）。
2. 各ソリューション灌流後、すすぎ2ステップは、細胞破片、化学残留物、援助、細胞溶解を除去するために行われている。すすぎが10分続くタイプI水ですすぎ、10分で構成されてそれぞれが室温で2X PBS溶液ですすいでください。各洗浄は、ソリューションをすすぎ追加、水没心臓を入れたビーカー内に灌流液を循環させ、元のビーカーから溶液の除去で構成されています。 1900ミリリットル/分で0.2パーセントTrypsin/0.05％EDTA/0.05％のNaN ₃溶液、水灌流したあと、これを1950ミリリットル/分で2X PBSを灌流する。
3. 室温で3％トリトンX-100/0.05％EDTA/0.05％のNaN ₃の溶液に心を移してください。 1時間2000ミリリットル/分であり、灌流液にポンプの速度を増加させる。ビーカーから溶液を除去し、新鮮な溶液と交換し、2100 ml / minにポンプ速度を増加させ、さらに1時間半の新鮮な溶液を灌流、合計時間を持ち込む3パーセントトリトンX-100/0.05％EDTA/0.05％NaN _3を 2.5時間に。
4. 10分ごとに2180ミリリットル/分で2150ミリリットル/分と2XのPBSでタイプI水にティッシュを洗い流す。
5. 室温で4％デオキシコール酸ナトリウム液に心を移す。 2200ミリリットル/分および3時間灌流液にポンプの速度を増加させる。
6. 各ソリューションの5から10分後にソリューションを変更すると、15分ごとに2200ミリリットル/分でタイプIの水でと2X PBS中で組織を洗浄します。説明灌流手順が二回リンス工程を実施し、4℃で一晩添付のチューブと一緒に心を格納することにより、複数の日にわたって分割して、タイプIの水中に沈んでいる可能性があります。
7. 次の日は、5分、5分、1,500 ml /分で1×PBSですすぎ、続いて750ミリリットル/分でタイプIの水で洗い流し行う。プロトコルは、その後、適切な解決策で説明流量で継続することができる。

4。消毒と最終処理

1. 0.1％peracに心を移すETIC酸/ 2200ミリリットル/分で1.5時間、4％のエタノール溶液と灌流液。
2. 組織のための最終的なリンスは、すべての2200ミリリットル/分の速度で実行されます。タイプIの水に2分5回洗浄し、15分のための1×PBSで組織を灌流する。リンスのこのシリーズは、溶液灌流手続きを完了するために、もう一度繰り返されます。
3. ポンプの電源をオフにして、心を排出するために、溶液から心臓を削除します。大動脈からの関係を断つ、すべてのチューブを取り外し、1時間排水するために、空のビーカーに心を置く。余分な液体は、定期的に排水する必要があります。完全に心を排出する吸収パッド（図4）に心を置きます。
4. 水の大部分が除去された後、心臓の細胞外マトリックス（C-ECM）の重量を記録する。心臓を脱細胞化処理中に、その初期重量の約20〜25％を失うことが予想される。
5. 右心室と左心室、ならびにDNA quantificatiための心室中隔を解剖上および組織学的処理の順序で組織の完全な脱細胞（図5）を確認します。
6. 凍結乾燥前に少なくとも2時間、-80℃で、C-ECMを凍結。

結果

全体ブタの心臓に脱細胞化の効果は自然に大きさの違い、圧力、容器の配置によって変化する。従って、細胞外マトリックス由来の足場の正確な組成は、心臓から心臓に同じにはなりません。説明されたプロトコルの完了は、細胞材料の損失を示す、白色または半透明表示される心臓を得ることができます。しかし、それは広く組織はさらにいくつかの定量的なパラメータ⁸の組み合?...

ディスカッション

現在の研究では、ブタの心臓の一貫性のある効率的な脱細胞化するための方法論を説明した。プロトコルは、以前に発表した報告書¹への変更であり、再現性の高い結果が得られた流量と圧力の上昇に長い露出が含まれていました。結果として脱細胞化組織は、組織²が正常細胞化のために発行基準のすべてを満たした。頻繁なソリューションの変更は組織に細胞物質の再導入?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
試薬/材料の名称	会社	カタログ番号	注釈
トリプシン	ギブコ	15090
EDTAを	フィッシャー	BP120-500
NaN 3を	シグマ	S2002-500G
トリトンX-100	シグマ	X100-1L
10X PBS	フィッシャー	BP399-20
デオキシコール酸ナトリウム	シグマ	D6750-500G
過酢酸	ファルツとバウアー	P05020	35％CAS番号79-21-0
エタノール	Pharmco	111000200
マスターフレックスポンプドライブ	コー​​ルパーマー	SI-07524から50
マスターフレックスチューブ	コー​​ルパーマー	96400から18	サイズ18
有刺鉄線リデューサー	コー​​ルパーマー	EW-30612から20
4Lビーカー	フィッシャー·サイエンティフィック	02-540T