マウス脊髄における条件遺伝子操作のためのウイルスベクターの定位注射

要約

ウイルスベクターは、標的遺伝子操作が可能になります。我々は、脊髄後角へのウイルスベクターの定位注射、一次体性感覚求心性および中枢神経系の神経細胞間のシナプスの接触の著名なサイトを使って、条件付き遺伝子発現やマウス脊髄におけるアブレーションのための方法を示しています。

要約

ウイルスベクターの実質内注射は、神経細胞や中枢神経系の特定領域の異なる集団の中の条件遺伝子操作を可能にします。我々は、マウスの脊髄後角における標的遺伝子発現またはサイレンシングを可能に定位注入技術を実証する。手術は短時間です。それは動物と脊椎の健常運動性の迅速なリカバリを提供する、単一の椎骨の椎弓切除術を必要とします。傾斜のガラスカニューレとシリンジの低速および使用に小さなベクター懸濁液量の制御された注射は組織病変を最小限に抑えます。ベクトルの局所免疫応答は、採用ウイルス固有の性質に依存し、我々の経験では、組換えアデノ随伴ウイルスを使用した場合、マイナーと短命です。このような強化された緑色蛍光タンパク質などのレポーター遺伝子は、ベクターの監視空間分布を容易にし、有効性や携帯仕様トランスフェクションのficity。

概要

マウスにおける条件遺伝子操作の高度な技術は、中枢神経系におけるシナプス経路と機能の接続の探査への多面的なアプローチを可能にします。導入遺伝子は、エストロゲン受容体¹の変異型リガンド結合ドメインを認識するリプレッサーまたは遺伝子の転写活性化因子、またはタモキシフェンとして機能するように設計することができるテトラサイクリン制御トランスに作用するようドキシサイクリンなどの小分子エフェクターによって調節することができる。不可逆的な導入遺伝子の改変は、一般的デオキシリボ核酸（DNA）リコンビナーゼによって達成される。 CRE（原因組換え）とFLP（フリッパーゼ組換え酵素）が切除、反転またはそれぞれ¹のloxP（クロスxの軌跡上、P1）またはFRT（フリッパーゼ認識対象）サイトが隣接してDNA断片の転移を触媒する。アプリケーションでは、遺伝子の活性化またはサイレンシングおよび誘導リボ核酸（RNA）干渉を含む ^{2。例えば、β-ガラクトシダーゼまたはアルカリホスファターゼなどの蛍光または酵素レポーターの条件式は、ニューロンにラベルを付け、それらの局所組織と接続3を調べるために使用することができます。北米（の大規模な変異導入プロジェクトhttp://www.norcomm.org/index.htm ）、ヨーロッパ（ http://www.knockoutmouse.org/about/eucommは ）で、マウス胚性幹細胞クローンのライブラリーを製造しています最終的には全体のマウスゲノムをカバーする条件付き遺伝子標的とトラップ。これらのクローンから生成されたマウスは、選択的な遺伝子操作（たとえば、ニューロンの特定の集団へ特異的プロモーターまたは遺伝子座の下でのDNAリコンビナーゼを発現するマウス系統の拡大数と交配することができるhttp://nagy.mshri.on.ca/cre_new/index 。PHP ）。}

興味のあるニューロン集団に特異的なプロモーターが知られていないか、領域内のすべてのニューロンによって表現されていない場合には、神経細胞や関心のある特定の領域の異なる集団に遺伝子操作を制限することは、単独で標的遺伝子によって達成されない場合があります興味のある。脊髄では、実験的なデザインは、1つまたは2つの頭尾方向のセグメントへの遺伝子操作の空間的制約が必要な場合があります。 CreまたはFLPを発現するウイルスベクターの定位注入フロックス化またはflrted対立、いわゆるDNA断片がloxPまたはFRT部位に隣接されているマウスの脊髄の領域に遺伝子組換えを制限することができます。マウスを表現リコンビナーゼで動物を交配に起因する構成的DNA再構成とは異なり、この戦略はまた、遺伝子の活性化やサイレン以上時間的な制御を提供します。コー​​ドするウイルスベクターは、フロックス化または導入遺伝子はcorrespoを発現するマウスで遺伝子操作の逆のオプションを提供しています浮気ニューロン特異的プロモーターの下流にリコンビナーゼをnding。ニューロンへの親和性を持ついくつかの組換えベクターは^、4利用可能です。大容量（ガット）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、単純ヘルペスウイルスやレンチウイルスは、一般的に神経親和性のベクトルを使用されています。研究課題に適したウイルスを選択すると、実験デザインの重要な部分です。導入遺伝子のサイズ、配送ルート、グリア細胞とは対照的に、神経細胞への感染の特異性、感染症の効能は、炎症性および毒性の副作用が^4を考慮する必要があります。

ここでは、脊髄後角へのウイルスベクターを、私たちは痛みの神経生物学上の我々の研究での条件付き遺伝子調節のために採用している手法の定位注射について説明します。後角には侵害受容性ニューロンを含む一次体性感覚ニューロンからの求心性入力を受け取る。投射ニューロンからそれを伝える前に、ローカルの介在ニューロンは情報を処理する脳^5〜背角。我々は、構成的に活性サイトメガロウイルスプロモーター下に強化緑色蛍光タンパク質（EGFP）を発現する神経向性組換えアデノ随伴ウイルス（rAAVの）と脊髄分節レベルL4で後角ニューロンの感染を示しています。

プロトコル

記載外科手術はコロンビア大学の施設内動物のケアと使用委員会（IACUC）によって承認されています。

1。機器およびウイルス粒子懸濁液の調製

1. 装置を清掃し、消毒、手術器具と椎骨L1を固定するために使用されるVノッチスパイクを滅菌します。
2. プルとベベルガラスピペット。我々は、40μmの先端径を持ち、20°の角度で傾斜がついていピペットを使用しています。ガラスピペットを滅菌する。
3. 定位フレームを設定し、マニピュレータ上にマイクロシリンジインジェクタを取り付けるとコントローラにインジェクタを接続します。
4. コンプレッションフィッティングキットを使用してマイクロシリンジにガラスピペットのいずれかを添付してください。
5. マイクロシリンジからプランジャを取り外し、ミネラルオイルを注射器を埋める。オイルレッドO（1 - （2,5 - ジメチル-4 - （2,5 - dimethylphenylazo）フェニルアゾ）-2 - ナフトール）が、そのvを高めるために鉱物油に添加してもよいisibility。プランジ​​ャーを挿入し、先端に至るまで押し込みます。慎重に気泡を作成することは避けてください。
6. バイオセーフティキャビネット内でウイルス粒子の懸濁液を準備します。氷の上で冷凍ウイルスを解凍し、使用直前に、滅菌した所望の粒子濃度にリン酸緩衝生理食塩水で希釈。
7. インジェクタ上のホルダーにマイクロシリンジを挿入します。
8. 小さ ​​なプラスチック製のシート上にウイルス懸濁液のピペットを5μl、 例えばパラフィルム。ドロップにガラスピペットの先端を下げ、マイクロシリンジを埋めるためにプランジャーを引く。目詰まりを防ぐためのピペット先端に小さな気泡を作成します。

2。椎弓切除術

1. ベンチや消毒剤で加熱パッドを拭くことによって手術領域を準備します。
2. マウスを麻酔。我々は、（誘導中に3％、メンテナンス時の2〜3％）とイソフルラン吸入麻酔を使用します。
3. 時の乾燥から目を保護するために、それぞれの目の上に置いて潤滑剤操作。
4. 腰痛からのマウスの首にファーを剃ると、クロルヘキシジンまたはポビドンヨード、70％エタノールなどの局所消毒のワイプを交互に皮膚の消毒。外科用ドレープで無菌的に調製現場を隔離し、ブピバカイン（0.25％、生理食塩水で1:10に希釈）を用いて切開部位に浸潤する。
5. 正中線に沿って肋骨の尾側（2-3 cm）で皮膚を切開し、背骨を覆う筋膜を分離します。
6. 脊髄は脊柱より生後発育中に、以前の成長が止まるので、脊髄分節L4は第1腰椎（L1）の下に位置しています。椎骨L1はリブの最後のペアを保持している椎骨尾に位置しています。その背面に付いている小さな脊髄筋肉と靭帯を除去することによって椎骨L1を識別し、公開します。
7. 少しアドソン鉗子と椎骨L1を持ち上げたままにします。背portioを削除するには、専用の椎弓切除鉗子を使用n個の椎骨（背骨やラミナ）と脊髄を露出するの。脊髄の損傷を防ぐ。
8. 定位フレーム内の加熱プレート上にマウスを移す。その後の動作中にマウスの温度を監視します。

3。注射

1. Vノッチスパイクで椎骨L1を固定してください。椎骨は、呼吸中に動かないようにスパイクが脊椎を安定させなければなりません。
2. 近いので、ピペットの先端が椎弓切除部位を超えていることをマイクロシリンジを持参してください。あなたはピペットを出るウイルス懸濁液が表示されるまでプランジャーを押し下げます。滅菌綿棒で液滴を削除します。
3. 露出した脊髄の吻側、最も部分にピペットチップを置きます。センター後正中溝上記ピペット、その後500μmで横方向に先端を移動。コー​​ドの表面にチップと穿刺硬膜を下げるか、あなたはunbeveledガラスピペットを使って作業しているときは、dは穿刺に面取りされたスチール製のカニューレを使用浦。脊髄にガラスピペット300μmの先端を下げます。
4. 200 NL / minの速度でウイルス懸濁液の1μlを注入します。
5. 注射の終了時に、ゆっくりと後退させるピペット前に少なくとも2分待ってください。
6. 脊髄分節L4にウイルスベクターの完全な分配を達成するために露出した脊髄の尾最部でステップ3.3から3.5を繰り返します。 2注射部位は、対象地域の組織の損傷を回避するために吻側およびL4セグメントの尾側に位置しています。

4。創縫合

1. Vノッチクランプから椎骨L1を離すと定位フレームからマウスを削除します。
2. 5.0ビクリルと筋膜を縫合。閉鎖筋膜は椎弓切除部位のためのカバーを提供しています。
3. ナイロン縫合糸または外科用ステープルで皮膚を閉じます。

5。術後処置

1. 柔らかい、nonparticularな寝具を使用して回復ケージにマウスを移す。トンの上に置きます快適な呼吸のために彼がサイド。それは通院、完全に警戒され、飲酒を開始するまで、動物を監視します。
2. 我々は、カルプロフェンの毎日の皮下注射（5.0 mg / kg）を使って72時間術後の鎮痛を提供します。
3. 実験が完了するまで、最初の3日間毎日検査で術後の回復、隔日または週3日を監視します。
4. 創傷治癒が完了したときに、7〜10日間運転後の皮膚の縫合糸またはステープルを外します。
5. 実験終了後の動物を安楽死させる。

結果

反対側、腹角および後根神経節の背角を温存注入後角（ 図1）の神経細胞で成功したトランスフェクションの利回り堅牢な遺伝子発現を、。

図1。後角ニューロンのトランスフェクション。L4脊髄の左後角における蛍光レポーターEGFP（緑色）の（）式は、2週間のrAAV-EGFPの定位注入後?...

ディスカッション

定位ベクターの注入は^、神経変性¹¹の予防または治療のために傷害^9,10、または遺伝子治療から再生中に^6,7またはoptogenetic郭清^8、軸索ガイダンスを広げる経シナプスウイルスに基づいて、このような神経ネットワークのマッピングなどのアプリケーションに脊髄ニューロンを標的にできます^12。ウイルスベクターは、体性感覚、運動と自律神経?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
材料名	会社	カタログ番号
脊髄ベースプレート	デビッドKopfはインスツルメンツ	912
小動物の定位器	デビッドKopfはインスツルメンツ	900
マウスガス麻酔ヘッドホルダー	デビッドKopfはインスツルメンツ	923-B
調整可能なベース·マウント	デビッドKopfはインスツルメンツ	982
Vノッチスパイク	デビッドKopfはインスツルメンツ	987
小動物温度制御システム	デビッドKopfはインスツルメンツ	TCAT-2LV
アドソン鉗子	ファイン科学ツール	11006から12
椎弓切除鉗子	ファイン科学ツール	11223から20
SYS-Micro4コントローラとUltraMicroPump（1）	ワールド·精密機器	UMP3-1
マイクロシリンジ、65RN	ハミルトン	7633から01
RNコンプレッションフィッティング、1ミリメートル	ハミルトン	55750から01
ホウケイ酸ガラスキャピラリー	ワールド·精密機器	1B100F-4
Microgrinder	ナリシゲ	EG-44