マウスの網膜神経節細胞におけるシナプスと人工コンダクタンスによるダイナミッククランプの実装

要約

このビデオの記事では、セットアップの細胞体とどのように全体のマウントマウス網膜における神経節細胞からのダイナミッククランプ記録を実装するにパッチを適用する手順を示しています。この手法は、興奮性と抑制性シナプス入力の正確な貢献の調査、および神経スパイクに対する相対的な大きさとタイミングを可能にします。

要約

神経節細胞は、網膜の出力ニューロンであり、その活性は、特定の神経回路から生じる複数のシナプス入力の統合を反映している。パッチクランプ技術は、電圧クランプ、電流クランプ構成では、一般に神経細胞の生理学的特性を研究し、そのシナプス入力を特徴付けるために使用される。これらの技術の適用は非常に有益であるが、それらは様々な制限をもたらす。例えば、興奮性および抑制性入力の正確な相互作用が応答出力を決定する方法を定量化することは困難である。この問題に対処するために、我々はコンダクタンスクランプ^1、2、3とも呼ばれる修正された電流クランプ法、動的クランプを使用し、神経細胞の興奮性に興奮性および抑制性シナプス入力の影響を検討した。この技術は、セルに電流注入を必要とし、その時の膜電位のリアルタイムフィードバックに依存する。 injectedは電流が所定の興奮性および抑制性シナプスコンダクタンス、その反転電位とセルの瞬間的な膜電位から計算される。実験手順の詳細については、ダイナミッククランプ法の全細胞の構成と雇用を達成するために、細胞をパッチクランプは、このビデオの記事に示されている。ここでは、制御条件または薬物の存在下における生理学的実験から得られた様々なコンダクタンスの波形にマウス網膜神経節細胞の応答を示している。さらに、細胞の応答を調べるために、αの関数を用いて生成された人工興奮性および抑制性のコンダクタンスの使用を示す。

概要

網膜は、眼の後部に並ぶ近透明な神経組織である。多くの研究では、視覚処理とシナプス伝達のメカニズムの最初のステップを検討するモデルとして網膜を使用しています。ホールマウントの準備における網膜ネットワークは解剖後に無傷のままであるので、その生理反応がインビボ条件下に非常に類似しているとして、シナプスの相互作用を研究するための理想的なシステムを表しています。したがって、そのニューロンの特性はパッチクランプ技術（技術の上でレビューのために^、6,9,13を参照）を使用して研究することができる孤立網膜を用いた。薬剤は、様々な部位に作用するような特定の回路や神経節細胞応答に神経伝達物質の正確な寄与の同定は、しかしながら、通常は妨げられる。

光に網膜神経細胞の生理学的反応、自然な刺激が、細胞内液で満たされたガラスピペットで記録することができます。パッチCLを使用してアンプ技術、光刺激に対するニューロンの応答は、膜電位変動（電流クランプ）または電流（電圧クランプ）として記録することができます。異なる電圧で膜電位を保持し、 事後コンダクタンス分析を実施することにより、抑制性および興奮性シナプス入力^5,12を単離することができる。実験のこのタイプは、通常の入浴中に、異なる神経伝達物質および神経応答に対する受容体の寄与を分離するために、異なる薬剤の存在下で行うことができる。多くの研究室からの研究の富は、このような大きさ、コントラスト、空間的および時間周波数、方向、向きや他の刺激変数として刺激特性に出力し、興奮性と抑制性の入力をスパイクの依存性を特徴としている。これらの実験的なアプローチは刺激特性の関数としてスパイク出力とシナプス入力との間の関係に関する情報を提供していますが、細胞の興奮に、特定の細胞の種類とそのシナプス入力の寄与の解釈は簡単ではありません。これは、典型的に興奮性および抑制両方の入力が刺激特性によって異なり、したがって、それはこれらの入力のいずれかの変化は神経スパイクに与える正確な影響を評価することができないという事実によるものである。

これらの制限を回避する別のアプローチは、出力スパイクへの個々のシナプス入力の貢献の重要な評価を可能にするダイナミッククランプ記録を実施することである。ダイナミッククランプ法は、セルへの電流の直接注入を可能にし、所定の時間に注入される電流の量はその時^1,2,3（レビューのために^、7,14を参照）に記録された膜電位に依存します。これは、修正された電流クランプセットアップです記録の下のセルと専用のハードウェアを備えた機器、ソフトウェア間のリアルタイム、高速フィードバックインタラクションコンピュータが達成される。細胞に注入される電流の量はそれに応じて計算される。したがって、この方法の利点は、セルがコンダクタンス波形の異なる組み合わせで刺激することができ、その応答はシナプス入力を媒介受容体の活性を模倣することである。例えば、小さなスポット用興奮コンダクタンスの注入への応答で小さなスポット用の興奮性と抑制コンダクタンスの注入への応答の比較のみ細胞応答に対する阻害の影響に関する情報を提供します。同様に、生理的に記録されたコンダクタンスの他の組み合わせは、スパイクが出力にどのように影響するかを刺激依存性興奮性および/または抑制性コンダクタンスの変化を明らかにするために同時注入することができます。

我々の研究では、動的クランプ技術は、相対振幅および網膜神経節細胞の発火特性にシナプス入力のタイミングの影響を実証するために使用される。さまざまなコンダクタンス制御条件、または薬理学的薬剤の存在下における生理学的実験から得られた入力として用いた。また、アルファ関数に基づく人工コンダクタンスはまた、シナプス入力がニューロンによって一体化されている方法を調査するために使用された。したがって、このコンダクタンスは様々な種類の薬理学的又は計算的に同一の神経節細胞に注入される、いずれかの生理学的に生成され、これらの入力に対する応答のように比較を行うことができることができる汎用性の高い技術である。

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プロトコル

1。全般設定と組織の準備

1. 30分（そのストレスレベルを減少させることを目指して）のために暗闇の中でマウスをおいてください。待っている間、外液の1 Lを用意。第ミリQ水の半分リットルの重炭酸ナトリウム1.9gを溶解する。そのpHを95％O ₂および5％CO ₂でバブリングすることにより7.4に維持される。 5分後、ミリQ水で1 Lまでの上部、重炭酸ナトリウム溶液に加える、ミリQ水100mlにエイムス媒体の8.8グラムを溶解し、よく混合する。実験の残りのcarboxygenatedこのソリューションを保つ。
2. carboxygenatedエイムス培地250mlのを取るとセットアップ電気生理学的に流体灌流システムを設定。ソリューションはcarboxygenated保つ。
3. 灌流チャンバーの底部上に均一に塗沫真空グリースを薄く。カバースリップでそれを封印し、それが気密であることを確認します。グリースの少量（直径約2 mm）を取り、上にそれを置き、ボトムは、チャンバの端。これらのボールの場所にグリッド（デンタルフロスで張らプラチナフレーム）を保持し、それが網膜上にあまりにもハード押す防ぐことができます。プラットフォームにチャンバーを修正し、両方の開口部の位置を合わせます。
4. 動物は2分間イソフルランとの最初の麻酔され、その後頸椎脱臼により屠殺。迅速に、小さなハサミ（湾曲した刃）で目を取り除く小さなビーカーにcarboxygenated細胞外液で十分に洗った後、carboxygenated細胞外液で満たされたペトリ皿に置きます。
5. 解剖顕微鏡下では、19ゲージの針を使用して角膜に挿入孔を（端から〜2mm）を作る。他の目について、この手順を繰り返します。これは重要なステップは、両方の網膜の酸素化を可能にする迅速でなければならない。その縁に平行に切断することにより、虹彩はさみの小さなペアで1角膜を削除します。次に、細かい鉗子一対の虹彩、レンズを取り外します。他の目について、この手順を繰り返します。入ったビーカーに1アイカップを転送細胞外溶液をcarboxygenated。
6. メス刃で、ホールマウントを平らにするために、網膜ごとに2つの全マウントを入手することができるように、半分に1アイカップを切った。鈍解剖プローブを用いた色素上皮からやそっとそれを引っ張って網膜を慎重に分離します。一度デタッチ、網膜はかなり透明になります。凸面は、光受容体の側であることに注意してください。凹面は、神経節細胞側である、それは粘着性硝子体液の存在に起因して、それ自体に付着することがあります。
7. 細かい鉗子のペアで、鋸状縁に近い一戸建て網膜組織のエッジを保持し、細かい鉗子の別のペアで鋸状縁をつかむ、網膜の中心に向かってそれを引く。これは微妙なプロセスであり、いくつかの試みがかかる場合があります。成功した場合、鋸状縁、毛様体及び硝子体液は、このプロセスによって除去され、網膜の曲率（ すなわち平坦に）低減される。
8. エッジをトリミングしてから、当たりに転送上向きに神経節細胞との融合チャンバ。グリースのボールの上にグリッドを配置することによって所定の位置に組織を持ちます。後で使用するために他のアイカップで、残りの組織を置きます。網膜の解剖のために同様の方法がミドルトンとプロッティ¹⁶とPottek らで説明されています^17。
9. 正立顕微鏡で記録室をマウントします。 5ml /分 - すぐに3の割合でcarboxygenated細胞外溶液（35.5°C）で網膜の連続灌流を設定します。接地電極が配置されていることを確認します。
10. 顕微鏡に装着すると、組織の可視化を可能にするデジタルカメラです。全体のセットアップはエアテーブル（衝撃吸収性）の上およびファラデーケージ（ブロック外部静的および非静的電界）の内部に位置しています。
11. 光源（赤外線、> 850 nm）のオンと40X目的に回して、神経節細胞の細胞体に焦点をもたらす。 recorのための全体のマウントの中央エリアを検索鼎。
12. デフロストKの凍結バイアル⁺ベースの細胞内溶液（300μL、でpH = 7.4）を含有する（単位：mm）K-グルコン酸：140、HEPES酸：10、のMgCl _{2：4.6、ATP-}のNa ^+：4、GTP-のNa ⁺ ：0.4とEGTA：10。すべての試薬は、Sigma-Aldrich社から購入した。

2。網膜神経節細胞のパッチ適用細胞体

1. 最初に火がホウケイ酸ガラスキャピラリーチューブの端を磨いて、それから2つの加熱ステップ（： - MΩ8 5抵抗）とガラス微小電極プラーとそれらを引く。
2. 細胞内液にルシファーイエローの3液（最終濃度0.2％）を加え、よく混ぜて、それを遠心分離。次に、1ミリリットルのシリンジに液の上部85％を譲渡、30 G再利用可能な皮下注射針に、その後、0.22μmのFの ILTERユニットに接続します。冷蔵。
3. そのホルダーに、録音に使用されているものと同様のチップサイズで、ガラスピペットを修正し、micromanipulaを使用して顕微鏡下に移動器。それは内境界膜の表面に小さなくぼみを作るまで、40X目的の下で、ゆっくりとピペットを下げる。それは少量の組織を捕捉するまで慎重にピペットを前方に前進した後、神経節細胞の細胞体を露出させるための小さな穴を引き裂くために上方および/または横に移動する。穴より小さい、網膜ネットワークの整合度が高いが維持される。所望であれば、スルホローダミン101（SR101、0.5から1μM）を蛍光顕微鏡^15を用いて損傷した神経細胞を標識するための細胞外培地に添加することができる。
4. 細胞内の溶液10μl - 8とクリーンピペットを埋める。アンプのヘッドステージに取り付けるホルダーにそれを挿入し、塩素化塩化銀電極が水没していることを確認します。汚れ、及び/又は気泡が/存在しているされている場合は破棄します。
5. すべての装置の電源をオンにします。我々は、電圧クランプ消費で細胞全体の記録を達成するためにPatchMasterによって制御EPC 8パッチクランプ増幅器を使用し形状。高速モードで電流クランプ記録を可能にする他のアンプを使用することもできることに留意されたい。ピペット溶液中の正圧を適用し、維持する。それはむしろ避難アマクリン細胞やグリア細胞よりも神経節細胞であるので、最も可能性の高い大規模な細胞体とのセルを選択します。ゆっくりと、膜の表面上に小さなディンプルを行っているので、ピペットチップを下げ停止し、圧力を解放する。 60 mVの - 即時に保持電位を下げる。ギガシール（GΩ）がそれらの間に達成されると、穏やかに全細胞パッチクランプ構成を実現するために、膜を破るために吸う。あまりにも負圧が印加された場合は、この手順では、繊細なステップであり、接続は漏れなり、少なすぎると、膜はそのまま残ります。
6. 時間が経つにつれて、ルシファーイエロー、セルの形態の可視化を可能にし、セルを記入します。安定した場合には、このセットアップは30分以上持続する必要があります。

3。 Dynamiを使用した神経節細胞の録音Cクランプ

1. まず、電流 - 電圧試験（904 - 75 + 35 mVのすべての10 mVのには）PatchMasterを使用して実行されます。大型のNa ⁺電流（> 1 NA）が存在する場合のみ、後でテストに進みます。避難アマクリン細胞にパッチが適用されてまれで、その場合には、それに続く現在の注射に活動電位の列車で応答しないことに注意してください。
2. オープンLabVIEWとカスタム書かNeuroakumaプログラムを実行し、その後さまざまなコンダクタンス波形をロードします。 8（ - 8統計的目的のための6）に繰り返し数を設定します。それぞれ75 mVの - 0とで興奮性と抑制性のコンダクタンスの逆転電位を設定します。テストのための興奮性と抑制コンダクタンスの一つ一致するペアを選択します。興奮性コンダクタンストレース（緑色）と抑制コンダクタンストレースは（赤）下のパネルに表示されます。
3. PatchMasterに戻り、電流クランプモードを選択し、すぐに 'CC +通信FAST'電流クランプモードにアンプを切り替える。このモードでは、ACCにできますurately膜電位の急激な変化に追従。膜とピペットとの間に良好なシールが維持されている場合は、少し/補償なしが必要とされ、そうでない場合、記録は長くは続かないだろう。 Neuroakumaでは、 "記録"ボタンを押してください。細胞応答（通常、活動電位の相性バースト、 図1A）は、上部パネルに表示されます。なし/少し応答が観察されている場合は、それが強力な応答を生成するまで最初のコンダクタンスの低いスケーリングとセルに電流を注入、少しずつ増加。過大電流注入は、セルを殺すことができる。いったんテストが完了し、コンダクタンス波形の新しいペアを選択し、生理学的および人工的なコンダクタンスのすべてのペアについては、上記を繰り返します。リアルタイムで注入された生理的な電流は、（I）に基づいています。
   I（t）が_大口 = G（t）は×（V _M（t）は、 - V _EXC）+ G _INH（トン）×（V _M（t）は、 - V _INH）

コンダクタンスは（NSのG）SYかもしれませんnapticまたは人工。興奮性と抑制性シナプスコンダクタンス波形は（TTX、1μM）制御条件の異なる視覚刺激に応答し、テトロドトキシンの存在下でプロッティ、ディマルコ、黄、Vonhoff、グエンとソロモン（未発表結果）によって実行される以前の実験から収集した。人工コンダクタンス波形はアルファ関数を用いてモデル化した。 V _mが （mV単位）記録された膜電位である。 G _EXCとG _{INHは、V EXC}とV _INHは 、それぞれ興奮性と抑制コンダクタンスの逆転電位を表しながらそれぞれ興奮性と抑制性のコンダクタンスを表しています。時間はミリ秒でtです。サンプリングレートは40 kHzです。
I _S = I _0（T /α）の^e-αT

上記の式は、アルファ機能（;電流のピークから1 /α=時間（秒^-1）I ₀ =最大電流）です。シナプスの立ち上がり時間と減衰時間電流は^、α4によって決定されます。抑制コンダクタンスの待ち時間は、励起の発症（ 図2D）に対してその遅延を減らし、変更されたながら興奮コンダクタンスが変化しなかった。

4. 細胞体はそのまま留まるように記録した後、慎重にピペットを撤回。直ちにリン酸緩衝液0.1Mの持つ3つの10分間の洗浄に続いて30分間の4％パラホルムアルデヒドで組織を固定する。冷蔵と抗体は翌日染色または週間以内に行います。

4。ルシファーイエローいっぱい網膜神経節細胞に対する抗体染色

1. 二次ヤギ抗ウサギIgG（希釈= 1:500と6日目に、一晩染色、室温でルシファーイエローいっぱい神経節細胞（5日間の主要抗ルシファーイエローウサギIgG（希釈= 1:10,000）に対する抗体染色））。蛍光保存メディアで網膜をマウントぬらし。釘pはスリップとシールをカバーolish。
2. ライカSPEC-II共焦点顕微鏡（ 図1B）を使用して、細胞の形態の共焦点写真を撮る。軸索の存在は、神経節細胞の確認を可能にします。

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結果

神経節細胞応答を阻害する異なる入力源の寄与は、様々なコンダクタンス波形を適用することにより実証される。これらの波形は通常の状態にし、ブロックアクションのみ抑制性網膜ニューロンのサブセットで電位発生。 図2Aはの注入に代表的な反応を示していることTTX、電圧依存性Na ⁺チャネル遮断薬の存在下で異なる輝度の刺激が得られた興奮性と抑制性のコンダク?...

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ディスカッション

ここでは、比の影響と網膜神経節細胞の出力に興奮と抑制の相対的なタイミングを評価するためのダイナミック·クランプを使用することを示しています。ダイナミッククランプは生きているニューロンに生理的に記録されたまたは人工シナプスコンダクタンスを導入するためのコンピュータシミュレーションを利用しています。この方法論はコンダクタンスが変更され、ニューロンの応答?...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent
Isoflurane Inhalation Anaesthetic	Pharmachem
Ames Medium with L-Glutamate (Powder)	Sigma-Aldrich
Potassium Gluconate, Anhydrous	Sigma-Aldrich
HEPES Sodium salt	Sigma-Aldrich
Magnesium chloride solution (4.9 mol/l)	Sigma-Aldrich
Adenosine 5'-triphosphate (ATP) disodium salt hydrate	Sigma-Aldrich
Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate	Sigma-Aldrich
Ethylene glycol-bis(2-amin–thylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid	Sigma-Aldrich
Paraformaldehyde Powder, 95%	Sigma-Aldrich
Anti-Lucifer Yellow, Rabbit IgG Fraction (3 mg/ml)	Invitrogen
Alexa Fluor 594 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) 2 mg/ml	Invitrogen
Fluorescent Preserving Media	BioFX Laboratories Inc.
Equipment
Capillary Glass Tubing with flame polished ends (OD = 1.50 mm, ID = 0.86 mm, Length = 15 cm)	Warner Instruments	64-0794
Single Stage Glass Micr–lectrode Puller	Narishinge Japan	Model PP-830
Minipuls 2	Gilson
Millex-GV 0.22 μm Filter Unit	Millipore Corporation	SLGV004SL
Luer Lock Reusable Hypodermic Needle: 30 G	Smith Nephew (Australia)
Single Inline Solution Heater	Warner Instruments	Model SH-27B
Dual Automatic Temperature Controller	Warner Instruments	TC-344B
Olympus Stereomicroscope SZ61	Olympus Corporation
Olympus Microscope BX50WI: with 40X objective	Olympus Corporation
0-30 V 2.5 A DC Power Supply	Dick Smith Electronics	Q1770
Digital Microscopic Camera ProgResMF cool	Jenoptik
Micromanipulator MP-225	Sutter Instrument Company
Patch Clamp Amplifier EPC 8	HEKA Elektronik
InstruTECH LIH 8+8 Data Acquisition System	HEKA Elektronik
Computer: DELL	Dell Corporation