マウスにおけるビデオ解析システムを用いた文脈と手掛り恐怖条件付け試験

要約

この記事では、コンテキストのためのプロトコルを提示したマウスで恐怖学習と記憶を評価するために、ビデオ分析システムを使用して、恐怖条件付け試験に頭出し。

要約

文脈や手がかり恐怖条件付け試験は、環境手がかりと嫌悪の経験との間の関連性を学び、覚えてマウスの能​​力を評価する行動試験の一つです。この試験では、マウスは、コンディショニングチャンバ内に配置され、馴化刺激（聴覚信号）と嫌悪無条件刺激（電気フットショック）のくずを与えられている。遅延時間後、マウスを同じ調整チャンバと、聴覚信号の提示を有する異なる形状のチャンバに露出している。試験中にすくみ行動は、恐怖記憶の指標として測定される。自動的に動作を分析するために、我々はhttp://www.mouse-phenotype.org/から無料でダウンロードできますImageFZアプリケーションソフトウェアプログラムを使用してビデオ解析システムを開発した。ここでは、我々のプロトコルの詳細を示すために、我々は文脈のための私たちの手順を示し、ImageFZのシステム経験を使用してC57BL/6Jマウスで恐怖条件付け試験を頭出しEM。加えて、我々は我々のプロトコルとImageFZシステムや人間の観察者によってスコアものとフォトビームベースのコンピュータ測定システムで測定された凍結時間を比較することにより、ビデオ分析システムの性能を検証しました。我々の代表的な結果に示されるように、ImageFZによって得られたデータはImageFZシステムを用いて行動解析は非常に信頼性があることを示す、人間の観察者によって分析されたものと同様であった。現在の映画の記事は、テスト手順についての詳細な情報を提供し、実験的な状況への理解を推進していきます。

概要

文脈的恐怖条件付け試験をきっかけに、げっ歯類^1-3の連想恐怖学習と記憶を評価するために用いた行動パラダイムである。この試験は、広く、トランスジェニックおよびノックアウトマウス^1,4-16における恐怖学習および記憶の神経生物学的メカニズムを理解するために使用されている。呼吸を除いて完全に不動のように定義されている動作を、凍結、恐ろしい状況に共通する反応である。この行動のパラダイムでは、動物は、電気フットショックと聴覚信号のペアリングにさらされた後、彼らは連想恐怖学習と記憶の指標として測定される凍結挙動を表示することによって、恐怖生産的刺激に応答します。このテストはあまり精巧機器、研究者が少ない身体運動、その他の学習と記憶タスクよりマウスについてのはるかに少ないトレーニング時間を必要とし、それは一般的に2日間、マウスあたり約5〜10分/日が必要です。試験手順は、Siではあるがmpleとすると、実行するには少し時間が必要で、研究者は慎重に観察し、マウスの動作を測定する必要があるため、いくつかの自動化された測定システムは、行動分析^17〜20を実施するために開発されている。我々はImageFZソフトウェアプログラムで開発された我々のビデオ分析システムは、私たちが容易に凍結挙動を分析し、信頼性の高い結果を生成することを可能にする。この記事では、我々のテスト手順に関する詳細な情報を提供し、ImageFZソフトウェアプログラムを使用する方法について説明します。

プロトコル

実験はすべて、地元の動物管理使用委員会によって設立され指導やプロトコルに応じて行われるべきである。

1。装置の設定

1. コンディショニングおよびコンテキスト試験するための装置は、帯電可能格子床を有する正方形室、音源、および較正ショック発生器である。様々なチャンバーサイズは54センチメートルX 27センチメートル×30センチメートル^21〜25センチメートルX 35センチメートルX 30センチメートル²²まで変化する寸法で、使用されている。このプロトコルでは、装置はアクリルの正方形室で構成されています（33センチ×25センチメートル×28センチメートル、前後壁透明、側壁白）金属グリッド付（0.2cmの直径、離れて0.5cmに間隔）カバー透明なアクリル蓋（ 図1A）で。それは、黒アグーチ、あるいは希薄な茶色のマウスの行動を解析するためにホワイトアクリル床（ 図1B）に室を配置する必要があるので、私に画像解析システム（無料でダウンロードでき、材料/試薬の表を参照）mageFZソフトウェアプログラムは、それぞれの撮影したビデオ画像内の白い背景の暗い被写体を区別します。アルビノマウスはまた、ブラックメタルグリッド、黒色アクリル床（ 図1B）を用いて試験することができる。発光ダイオード（LED）が点灯し、装置上の天井に取り付けられている。格子床は、LEDライトで100ルクスで点灯している。白色雑音/音源（ 図1C）に接続されたスピーカ5センチメートル条件刺激（CS）と、聴覚信号（ホワイトノイズ55 dB）を提示する蓋上の天井に取り付けられている。グリッドを無条件刺激（米国）などの電気フットショックを配信するために、衝撃発生装置（ 図1C）に配線されている。試験室は、試験中に外部からのノイズを最小限に抑えるために防音室（168センチメートル×210センチメートル×200センチ）（ 図1D）内に配置される。この状態は、現在に供されていないマウスを防ぎ聴覚信号または試験マウスの発声を聞くことからテスト。
2. 手がかり試験するための装置が新たなコンテキストを提供する、調整チャンバーとは異なる特性を有するチャンバで構成されている。これは、マウスが調整チャンバとは無関係であるとして新規なコンテキストを知覚するように、できるだけ知覚合図を変更することが肝要である。一般的に、異なる形状のボックスや三角室が使用されます。さらに、異なる照明および/または嗅覚は、マウスに供給される。このプロトコルでは、装置はアクリル三角室である（33センチ×29センチメートル×32センチメートル、それぞれの側壁に白）フラット、白の床、黒アグーチ、またはアルビノ茶色マウスやフラット、黒い床を希釈するためのマウス、透明なアクリルの蓋（ 図1E）で覆われた。 LEDライトは、装置上の天井に取り付けられている。床の照明​​レベルを30ルクスに設定されている。スピーカーはPRに5センチメートル蓋の上の天井に取り付けられているコンディショニングの時点でマウスに与えたものと同じである聴覚合図をESENT。三角形のチャンバは、コンディショニングおよびコンテキスト試験を行っている部屋とは別の防音室に配置されている。
3. 各チャンバは、マウスの挙動を監視するためのクワッドビデオスプリッタとUSB画像キャプチャ装置を介してWindowsコンピュータに接続する天井用電荷結合素子（CCD）カメラを備えている、装置及びマウスの画像がによって捕捉され、分析されるアプリケーションソフトウェアプログラムはImageFZ（プロトコル6を参照）。ホワイトノイズとフットショックジェネレータは自動的にImageFZソフトウェアプログラムによって制御され、開始時刻とホワイトノイズやフットショックの持続期間はのためのビデオに示すサンプルのテキストフ​​ァイル '単純COND」を参照してください（テキストフ​​ァイルに記述する必要がありますアプリケーションに読み込まれたパラメータがファイルに書かれている方法の詳細）。
4. 各テストは、アクリルの壁を開始する前にそして床は、スーパー次亜塩素水（pHは6〜7）に浸したタオルで拭いていると、グリッドは嗅覚に基づくバイアスを防ぐために、70％エタノールで洗浄される。グリッドは、グリッドによる錆への導電性を軽減しないことを保証するために、エタノールの代わりに超次亜塩素水で拭いている。

2。動物の準備

1. 一般的に、二から四のマウスを12時間の明/暗サイクル（ 例えば午前7時に点灯）で温度制御された保持室（23±2℃）でケージあたりに収容されている。
2. このプロトコルでは、行動にケージ輸送の可能な影響を低減するために、実験環境にマウスを適合させるために、マウスを含むケージは防音試験室で少なくとも30分間に隣接防音待合室に動物保留室から転送され前に、各テストが開始されます。
3. 実験（ 図2A）の全ては、sの間に実行されるべきである異なる時間^23,24でテストすることによって生産さ行動の変化を最小限に抑えるために光や暗期中のAMEの期間、毎日。このプロトコルでは、全ての実験は、光期の開始と暗期（明期6:00〜午後8:00 AM）の発症前1時間後に1時間の間で行われている。唯一つの装置が使用可能な場合は、各遺伝子型のマウスは、実験時間および行動パフォーマンスに被験者のテスト順の潜在的影響を低減する相殺ためにテストする必要があります。 ImageFZは4機器の最大を制御することができます。相殺順に4の装置を使用して、同時に4匹をテストする研究者が時間を節約することを可能にすると、マウスの挙動に関する実験パラメータの影響の可能性を低減します。

3。コンディショニング

1. マウスを条件付けチャンバー内に配置され、マウスは、典型的には自由に120秒間チャンバを探索させている。その後、AUこのようなホワイトノイズ、音、聴覚クリッカーとしてditoryキューは、30秒間のCSとして提示され、0.1〜0.8ミリアンペアのフットショックは、音の最後の2秒の間に、米国のようにマウスに与えられている。 CS-USのペアリングのプレゼンテーションは、関連付けを強化するために繰り返される。マウスは、チャンバのコンテキストと嫌悪の経験との間の関連性を確立するために、最後のプレゼンテーション後の時間の長さの室内に放置されています。このプロトコルでは、無料の探査の120秒後に、聴覚信号（ホワイトノイズ、55デシベル）を30秒間提示され、0.3ミリアンペアのフットショックは、ホワイトノイズの最後の2秒の間に連続的に配信されます。 90秒後、フットショックと聴覚信号のペアリングを再度被験者に与えられます。 CS-USのプレゼンテーションでは、セッションごとに3回（120、240、およびコンディショニング開始後360秒）（ 図2B）を繰り返す。最終的なフットショックに続いて、マウスを90秒間チャンバ内に放置されています。
2. コンディショニングセッションが始まる前に、プラグインのメニュー「FZエアコンとFZオンライン（4室）」を選択し、ImageFZアプリケーションソフトウェアプログラムを実行して、ステップバイステップで、次のようにパラメータ値を設定。
   1. ステップ1：プロジェクトID。あなたのデータファイルを格納するフォルダを指定します。
   2. ステップ2：セッション名。 「セッション」のボックスに、 例えば実験の日付、任意の言葉を入力し、開始時刻とホワイトノイズやフットショックの持続時間は「リファレンス」のボックスに、記述された参照テキストファイルを選択します。サンプルテキストフ​​ァイルは、ビデオに示されている。
   3. ステップ3：パラメータ設定。以下のように各ボックスにパラメータ値を入力します。
      1. レート（フレーム/秒）：画像取得、 例えば、1フレーム/秒のフレームレート。
      2. 持続時間（秒）：空調の場合には、全持続時間は480秒である。
      3. ビン時間（秒）： 例えば 、60秒、データは各ブロックで分析される60秒。
      4. 対象サイズ - 分（ピクセル）：ImageFZは、各画像内の白い背景に黒の粒子（画素の一部質量）としてマウスやノイズを検出します。ブラック粒子（画素）の領域が「テーマサイズ-分（ピクセル）」未満であるときの値（ 例えば 100画素）、粒子が雑音とみなされ、画像解析から除外される。
      5. MAX（ピクセル） - 対象サイズは：ブラック粒子の大きさが「題目サイズ - 最大（ピクセル） 'のサイズよりも多い場合は、値は、粒子は分析から除外されます。
      6. フレームサイズ-幅/高さ（cm）：チャンバ寸法、 すなわち 33センチメートル広い25センチの高さ。
      7. 基準（ピクセル）凍結： 例えば 30ピクセルを、議定書6で詳細を参照してください。
      8. 継続時間を凍結-分（秒）： 例えば、2秒、なし、マウスの動きにのみ2以上秒間検出されなかった場合、その動作は「凍結」としてカウントされません;。
      9. ショック·レート（フレーム/秒）：プロトコル6で詳細を参照してください。
   4. ステップ4：件名ID。サブジェクト識別情報を入力してください。
   5. ステップ5：カメラの設定。明るさや撮影した画像のコントラストを制御します。
   6. ステップ6：しきい値設定。各画像における白色の背景に黒色の画素として黒マウスを検出するためのしきい値を調整し、（議定書6で詳細を参照してください）​​ '凍結'または '凍結のないこと」として、マウスの動作を判断する。アルビノマウスを分析するには、チェックボックスの「反転モード」をクリックし、適切にしきい値を調整します。
   7. ステップ7：設定しケイジフィールド。キャプチャする各室のフィールドを指定します。ツールボックスの四角形のボタンをクリックすると、ライブ画像ウィンドウ上室の床の周りに長方形を描きます。次に、チャンバー番号を選択し、「設定」ボタンをクリックしてください。最後に、「完了」ボタンをクリックします。
<パラメータ設定値が設定されている李>後、予備試験は、画像解析システム及び白色雑音/ショック発生が問題なく動作するかどうかを決定するためにその日の最初の試験前の練習マウス（被験体として使用されていないマウス）を用いて与えられるべきである。
3. 隣接する待合室から防音試験室に練習マウスを含むホームケージを移動し、調整チャンバーの各マウスを置く。すぐにチャンバー内にマウスを置いた後、ImageFZの[スタート]ボタンをクリックします。アプリケーションソフトを使用すると、参照ファイルに指定した順序でマウスに聴覚的な手がかり、および/または電気フットショックを紹介します。
4. 480秒が経過した後、ホームケージにマウスを返し、保持室内の棚にケージを戻す。
5. 慎重にチャンバーを清掃してください。その後、「次の分析」ボタンをクリックして、試験マウスのための手順を3.2.4-3.6繰り返します。
6. ImageFZ店は生活し、TIFF形式で画像をトレースします。プログラムが可能に私たちは、修正したパラメータ値を用いて画像を再分析するように、オフライン分析を行う。オフライン分析を行う場合は、メニューのプラグイン「恐怖条件付けとFZオフライン」を選択し、再分析したいデータのフォルダを選択します。その後、再度、入力パラメータ値を、そして「完了」ボタンをクリックします。

4。コンテキストテスト

1. コンディショニングセッションが完了した後、マウスを同じコンディショニングチャンバに戻し、文脈的恐怖条件付け（コンテキスト試験）を測定する動作を凍結のため採点する。コンディショニングとコンテキストのテスト間の遅延間隔は、一般的に24時間で設定されています。このプロトコルでは、最近の記憶及び遠隔記憶を評価する（試験1日目で測定し、28日よりコンディショニング後、それぞれ^）25、マウスを約24時間および30日間コンディショニングした後にセッションコンテキスト試験に供される。マウスはCONDに配置されますチャンバーをitioning自由CSおよび米国のプレゼンテーション（ 図2C）なしで300秒間室を探索させている。
2. ImageFZソフトウェアプログラムを実行し、（セクション3.2.3を参照）コンディショニングと同様にして、アプリケーションソフトウェアのパラメータ値を設定するが、300秒までこの試験の継続時間を変更し、コンテキスト·テストのための基準テキストフ​​ァイルを選択。設定を変更した後、予備テストはImageFZシステムをチェックするための練習マウスを用いて与えられるべきである。
3. 空調室に各マウスを置き、[スタート]ボタンをクリックします。 300秒が経過した後、ホームケージにマウスを返し、頭出しのテストが始まるまで邪魔されずにケージにしておきます。
4. チャンバーを清掃してください。その後、「次の分析」ボタンをクリックして、繰り返して、試験マウスで4.3から4.4を繰り返します。

5。手掛かり試験

1. 頭出しのテストは、コンテキストのテストの同じ日に、または次の日に行われる。この試験では、マウスを3分間条件付けチャンバーとは無関係である新しいコンテキストを提供する、非常に異なる特性を有する別のテストチャンバ内に配置される。最初の3分間の終わりに、コンディショニング時に提示される聴覚信号は、新規のコンテキスト環境での3分間のマウスに与えられる。このプロトコルでは、手がかり試験は、数時間、コンテキスト試験後に行われる。マウスを360秒間三角室を探索させている。最初の3分間で、CSや米国でもないが提示され、その後、CS（55デシベルホワイトノイズ）は、最後の3分間提示される。
2. ImageFZソフトウェアプログラムを実行し、360秒の試験の継続時間を変更し、手がかり試験のための基準テキストフ​​ァイルを選択する以外は、コンディショニングと同様にしてパラメータ値を設定する。設定を調整した後、予備テストはImageFZシステムをチェックするための練習マウスを用いて与えられるべきである。
3. 三角室に各マウスを置き、[開始]をクリックしますボタンを押します。 360秒が経過した後、ホームケージにマウスを返すと保持室の棚にケージを戻す。
4. チャンバーを清掃してください。その後、「次の分析」ボタンをクリックしてを繰り返して、試験マウスで5.3から5.4を繰り返します。
5. さらに、リモートメモリをテストする4-5約30日間のコンディショニングセッション（ 図2A）の後にプロトコルを繰り返します。

6。画像解析

1. 自動的ImageFZを使用してデータ収集と分析を行う。このアプリケーション·ソフトウェア·プログラムは、剛宮川によって変更された（国立衛生研究所とhttp://rsb.info.nih.gov/ij/で入手可能でウェインRasbandによって開発された）パブリックドメインImageJのプログラム、（ImageFZアプリケーションソフトウェアに基づいています、無料でダウンロードできます）素材/試薬の表を参照してください。
2. 全ての実験について、を含む、USBビデオキャプチャデバイスを使用してImageFZで所与のフレームレート（ 例えば、1コマ）の画像をキャプチャするビデオカメラ。 、連続した画像から移動した距離を測定し、黒色の粒子（マウス）と白の背景にセグメント画像に設定されているプログラム（ 例えば 80ピクセル）の「しきい値分'の値を調整します。走行距離は、連続する画像のxyにおける粒子の重心座標の各セットの間の距離から計算される。
3. 、連続した画像から凍結挙動を測定するブラック粒子（マウス）に分割した画像を設定し、背景である「しきい値分（XOR） 'プログラムの値（ 例えば 160ピクセル）を、調整し、計算するには連続する画像の各対の粒子間の非オーバーラップ領域の面積の大きさ（ピクセル）。各画像の黒い粒子が尾を除いたマウスの全身の形状と一致するまで、しきい値ツールのスライダーを使って値を調整します。 nonoverlaの面積があればリージョンをpping 'は凍結基準」の値（ 例えば 30ピクセル）未満であり、動作は、一般的に呼吸と心拍を除く任意の動きの完全な欠如として定義されている（ 図3）、'凍結'であると考えられている。領域がこの値を超えると、動作が「非凍結'（ 図3）であると考えられる。判決は、凍結の定義に基づいてなされるべきである。マウスは時々恐怖を反映した凍結挙動と見なされていない可能性があり、微妙な動きや瞬間的な不動を呈する。恐怖の発現とは異なる可能性がある短い時間（ 例えば 2秒未満）、続く不動には、凍結の時間閾値を設定することにより、分析から除外することができる。値（ 例えば 2秒） -時間しきい値、入力'分（秒）凍結期間を'を設定する。
4. ImageFZプログラムを自動的にカルキユルのATEは、距離が（CM）および凍結の割合を旅した。結果は、テキストフ​​ァイルに保存され、生きおよびトレース画像がTIFF形式で格納されている。距離を測定するために、電気フットショック感受性の指標として（センチメートル）を走行し、ImageFZプログラムは、2まで、2秒のフットショックの送達の前に2秒から測定し、6秒間、高フレームレート（ 例えば 4コマ）の画像を取得するオンライン分析の間フットショック後の秒。その間、および「ショック·レート（フレーム/秒）」ボックスに、フットショック、入力値の後に、前の画像キャプチャのフレームレートを設定します。オンライン分析の後、移動した距離のデータを取得するために「FZショックオフライン 'プラグインのメニューを選択することで、オフライン分析を行う。
5. ImageFZプログラムのパラメータ値は、予備試験で人間の観察によって得られた結果と同様の結果を生成するために最適化されるべきである。手動スコアリングのために、凍結挙動を連続stopwatcを用いて測定されるhおよびイベント録画プログラムまたはImageFZソフトウェアを用いて分析中に瞬間的な時間サンプリング手順毎に3-10秒。二人の観察者は、一般的に行動観察を行っています。画像解析の結果は、人間の観察者のものと一致していることを保証するためにImageFZプログラムのパラメータ値を調整ImageFZプログラムのオフライン解析を行い、「しきい値分（XOR） 'を変更し、「凍結基準」の値に。オフライン分析を実行するには、プラグインのメニュー「FZオフライン」と入力パラメータ値を選択します。

7。トラブルシューティング

1. どのようにImageFZプログラムを入手し、インストールすることができますか？
   ImageFZプログラム（材料/試薬の表を参照してください）​​当社のウェブサイトから無料でダウンロード可能であり、Windowsコンピュータ上で実行されます。 ImageFZ用zipフォルダをダウンロードし、お使いのコンピュータにソフトウェアをインストールしてください。据付けのための「README.TXT」ファイルを参照してください。詳細に関するステップバイステップの指示に従ってください。
2. なぜエラーメッセージが表示された 'エラーはキャプチャデバイスを設定する」のか？
   カメラケーブルの接続やUSBイメージキャプチャデバイスのドライバのインストールを確認してください。設定に問題がない場合は、ImageFZソフトウェアは、画像キャプチャデバイスでは動作しない場合があります。 ImageFZソフトウェアと共に使用するための適切なデバイスに関する「README.TXT」ファイルを参照してください。
3. ImageFZは粒子としてのマウスの体全体を検出することはできません。
   「しきい値分」および/または「しきい値分（XOR）の現在値よりも低い値を設定します。 ImageFZは、試験室の隅例えば 、特定の場所にこのような均一に照明、床やマウスと背景とのコントラストを少しの差として、その後は不十分で試験条件を、マウスを検出できない場合は、存在する可能性があります。この問題を解決するために、パラメータ値を（ 例えば、調整する明るさとライブ画像としきい値のコントラスト）、ライトの数と位置を制御したり、黒のマウス用の白い背景を使用してください。
4. 高フレームレートでキャプチャした画像は、オンライン分析の中にコンピュータが遅くなります。
   現在のレートよりも低い値にフレームレートを設定し、オンライン分析を行う。代表的な結果の項に示されているようImageFZ分析は、1 fpsで画像取得により、正確に凍結を測定するために十分である。
5. ImageFZ分析の結果は、ヒトのスコアのものと一致していない。
   保存された画像および判定結果のファイルを調べる。 ImageFZ凍結過大評価した場合、現在の値よりも低い値に '凍結基準」を設定して、オフラインで解析を実行する。 ImageFZ凍結を過小評価した場合、現在の値よりも高い値に「凍結基準」を設定してください。
6. optogeneticalおよびin vivo電気生理学E 中xperiments、マウスの頭部に装着ファイバケーブルは、凍結の判断を妨害する。
   コー​​トは黒のマウス用の白の中のケーブル、およびケーブルが検出されなくなるまでカメラの位置と角度を変更してください。
7. オフライン解析のために必要とされているの？
   ImageFZプログラムのルートディレクトリに「Image_FZ」という名前のフォルダを作成します。このフォルダに、サブフォルダ「画像」と「セッション」を作成。 「イメージ」フォルダに8ビットグレースケール画像を移動し、画像ファイル名が「セッション」フォルダ内に書かれているテキストフ​​ァイルを作成します。その後、ImageFZオフライン分析を実行し、プログラムの指示に従ってください。

結果

恐怖条件付け試験で、人間の実験者は、労働集約型の直接観察^26から29を通して凍結挙動を定量化するために使用されるが、最近ではフォトビームベースのコンピュータ計測（ 例えばフリーズモニター」システム）と画像解析システムが自動的に使用されてきたすくみ行動^26,30-32を測定^します。 ImageFZは、後述するように、人間の観察によって得られるものに匹敵する結果を生成し、自動画像解析システムである。ここでは、様々なパラメータの下でImageFZ分析の結果と人間の観察の結果を比較した。 'レート（フレーム/秒）」と「（ピクセル）を基準に凍結。'この実験では、5雄のC57BL/6Jマウス（SD（G±平均体重）、31.4±3.55は、SD（ピクセル）、351.6±62.2±ボディサイズを意味する）は、生後15-27週で使用した。人間の観察は、イベント記録プログラム（マッキントッシュOS9ソフトウェアプログラム）を用いて作製した;続けるキー押下イベントマウスが動かないの試合を表示2秒以上Dは「凍結」と考えられていた。凍結の割合を各試験において60秒ごとに計算し、相関分析のために使用した。 2オブザーバーによってスコア凍結の割合（空調用者間の信頼性、R = 0.879、コンテキスト·テスト、R = 0.957のため、頭出しのテストのために、R = 0.866、すべてのケースのために、R = 0.888）は、ヒトを生成するために平均化したスコア。凍結各フレームレート（ すなわち、1、2、および4のfps）でImageFZを通して測定百分率およびヒト観測で得られたものとの間の相関関係を調べた。 図4に示すように、ImageFZ（1,2、および4のfps）によって算出凍結百分率は非常2の観察者の測定から得られる平均値と相関していた。注目すべきは、より高いフレームレートで画像をキャプチャすると、常に最良の相関を生成しません。 1 fpsでの画像解析には、電子で、人間の観察者から得られた結果と同様の結果を生成したACHテスト。人間の観察により測定し、「凍結基準（ピクセル）」の各条件を用いて凍結ImageFZパーセンテージ（ すなわち 20、30、及び40画素）との相関を調べた。凍結百分率は20、30 'の凍結基準（ピクセル）'でImageFZを用いて計算し、40ピクセルは、全ての場合において、高度に人間の観察（ 図5）を介して得られたものと相関していた。 図5Dに示すように、凍結基準が低い値に設定されている場合、人間の観察者によって「凍結」されると考えマウスの微妙な動きは、「未凍結'ImageFZを用いて考えられるであろう。基準が高い値に設定されている場合、逆に、マウスの動きは、人間の観察者により「不凍」としてスコア、ImageFZ（ 図5C、5F、および5I）を用い'凍結'とみなされる。このように、最も信頼性の高い結果を得るために、ImageFZプログラムの各パラメータは私達に較正されるべきである各テスト環境で人間の観察を通して獲得したデータをING。

加えて、我々はImageFZ（ 図6参照 ）を用いて得られたものと、フォトビーム·ベースのコンピュータ·測定システム（フリーズモニターシステム）を用いて、人間の観察者によって生成された結果を比較した。人間の観察、処置群とImageFZスコアリングの結果を知らされた。フリーズ監視システムのパラメータ設定のために、我々は以前に検証済みシステム³⁰から冷凍の割合の3尺度を使用していました。簡単に説明すると、10秒間隔の数とは、動物が各5秒間隔の開始との間に（それぞれ1秒の10秒と2秒の10秒）間隔および待ち時間の最初の新しいビームを交差させる以上の1または2秒を必要とし、この区間（Latency3）内の第3の新たなビームの中断を測定した。マウスは、凍結された時の間隔のパーセンテージまたは時間rの合計量の割合第三のフォトビームを計算した破るequired。

各システムで測定された凍結のパーセンテージは、図6に示されている。基は、t検定、続いて二方向反復測定ANOVA（ 表1を参照）を用いて比較した。 ImageFZ（ 図6B）を用いて測定凍結百分率は、フォトビーム·ベースのシステム（ 図6C-E）を使用して得られたデータよりもヒトの観察（ 図6A）を介して獲得したものと、より類似していた。凍結パーセンテージの間の相関を測定し、一方、各試験においてImageFZプログラムを用いて測定された冷凍パーセンテージは非常に人間の観察（手がかり試験であり、r = 0.934;、コンテキスト試験であり、r = 0.970コンディショニングあり、r = 0.947）を介して獲得したものと相関していたフォトビームベースのコンピュータ測定システム（1秒の10秒、2秒の10秒、またはLatency3）を使用し、人間の観察者は、コンディショニング、R = 0.503、0.593、および0.761（低かった。コンテキストTImageFZおよびヒトの観察（ 図7Aおよび7B）を用いて測定し、凍結パーセンテージの間の相関に比べエストあり、r = 0.772、0.819、および0.912）。また、 図7は、人間の観測で得られた各マウスにImageFZを使用して凍結割合の違いは、最小の違いだったことが明らかになった。これらの結果は、凍結の量を測定する際ImageFZを用いて測定冷凍パーセンテージは非常に正確であり、人間の観察とそのImageFZにより得られたものと同様であったことを示した。

図1。文脈的恐怖条件付け試験を頭出しするための装置。（A）、エアコン、コンテキストのテストのためのアクリルの正方形チャンバー、（ B）白いマウス（下）のための黒いプラスチック製の床に、黒アグーチ、あるいは希薄な茶色のマウス（上）と帯電性黒色金属グリッドの白いプラスチックの床の上に金属グリッドは、グリッドの拡大画像が右側に表示されますパネル（C）ホワイトノイズ/音源とショックジェネレータ、（D）防音室、（E）の頭出し試験のための平らな床を有するアクリル三角室。 拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。

図2。プロトコルの概略図。文脈の（A）の概要と恐怖条件付け試験を手がかり、（B）の調節、（C）はContextテスト、および（D）は 、テストを頭出し。 拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。

図3。 ImageFZソフトウェアプログラムによる画像解析。連続する画像の各ペアについて、マウスを移動する面積（画素）の量はImageFZによって計算される。この領域が特定の閾値（ 例えば 30画素）未満であると、動作が「凍結」していると判断される。面積の大きさに等しいか、しきい値を超えた場合、動作は「凍結のないこと」であると考えられている。 拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。

図4。人間の観察により測定されたものでImageFZを使用して、異なるフレームレートで画像から算出された凍結パーセンテージの比較。恐怖条件付け試験は、雄のC57BL/6Jマウス（n = 5）を用いて行った。テストの間に、二人の観察者は、凍結挙動を記録した。同時に、ライブ画像はImageFZプログラムを用いて4 fpsで捕捉した。 4 fpsでキャプチャしたファイルは、1 FPSや2 fpsで撮影された画像に対応するフレームを抽出した後に小型化された。 「レート（フレーム/秒）」のパラメータ値は、1,2、または4 fpsに設定し、各60秒ビン内の凍結百分率はImageFZオフライン分析を用いて画像ファイルから計算した。各ドットは、それぞれ60秒ビンの凍結割合を表します。人間の観察とImageFZ分析から得られたデータとの間のピアソンの相関係数を算出した。拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください。

図5。 ImageFZおよびヒト観測で測定されたものを使用して、異なる凍結基準値で画像から算出した凍結百分率は、恐怖条件付け試験を雄C57BL/6Jマウス（n = 5）を用いて行った。比較した 。テストの間に、二人の観察者は、凍結挙動を記録し、ライブ画像がImageFZプログラムを使用して撮影した。各60秒のビンにおける冷凍パーセンテージは、20、30、または40ピクセルに「凍結基準（ピクセル）」のパラメータ値の設定、ImageFZオフライン分析を通して画像（1フレーム/秒）から計算した。各ドットは、それぞれ60秒ビンの凍結割合を表します。ピアソンの相関係数人間観察とImageFZ分析から得られたデータとの間efficients各試験で計算した。 拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。

図6。凍結のパーセンテージは、雄のC57BL/6Jマウスの無条件馴化群（n = 5、各基）で自動化されたシステム及びヒト観察を用いて測定した 。 （A）ヒトの観察、（B）ImageFZ、（C）監視システム1（1秒と10秒）を凍結、（D）は、モニタ装置2（2秒と10秒）、および（E）凍結監視システム3（Latency3）をフリーズ。グループ比較はt検定（続く双方向反復測定分散分析を用いて行った異様なnditioned基対馴化基、*、P <0.05、†はp <0.01）。 ImageFZを使用して得られたデータは、ヒト観察を通して獲得したものと類似していた。 拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。

図7。相関凍結百分率自動化されたシステム及びヒト観察により得点との間の自動化されたシステム及びヒト観察を使用して測定冷凍パーセント、（AB）散布図およびピアソンの相関係数の差の度数分布が示されている。 ImageFZを使用して計算凍結パーセンテージは、高度に人間の観察を通して得られたものと相関していた。 10％DIF未満（CF）。出現データは、人間の観察を通して分析されたものと比較したImageFZを使用して分析した場合に自動化されたシステム対人間の観察から得られた凍結割合間ferenceが最も高かった。 拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。

	分散分析
	条件	時間	条件×時間
1日目（コンディショニング）
人間	F（1,8）= 28.53、P = 0.0007	F（7,56）= 20.79、P <0.0001	F（7,56）= 16.58、p <0.0001
ImageFZ	F（1,8）= 13.97、P = 0.0057	F（7,56）= 21.40、P <0.0001	F（7,56）= 11.69、p <0.0001
フリーズモニター（1sec10sec）	F（1,8）= 5.16、P = 0.0528	F（7,56）= 2.39、P = 0.0329	F（7,56）= 0.72、P = 0.6572
フリーズモニター（2sec10sec）	F（1,8）= 4.07、P = 0.0782	F（7,56）= 3.44、P = 0.0039	F（7,56）= 1.52、P = 0.1803
フリーズモニター（Latency3）	F（1,8）= 4.44、P = 0.0682	F（7,56）= 9.94、p <0.0001	F（7,56）= 4.33、P = 0.0007
2日目（コンテキスト）
人間	F（1,8）= 42.94、P = 0.0002	F（4,32）= 1.91、P = 0.1336	F（4,32）= 1.48、P = 0.2302
ImageFZ	F（1,8）= 49.61、P = 0.0001	F（4,32）= 2.06、P = 0.1087	F（4,32）= 0.83、P = 0.5174
フリーズモニター（1sec10sec）	F（1,8）= 20.28、P = 0.002	F（4,32）= 1.63、P = 0.1918	F（4,32）= 0.55、P = 0.6997
フリーズモニター（2sec10sec）	F（1,8）= 40.20、P = 0.0002	F（4,32）= 2.66、P = 0.0504	F（4,32）= 1.20、P = 0.3306
フリーズモニター（Latency3）	F（1,8）= 35.30、P = 0.0003	F（4,32）= 2.49、P = 0.0626	F（4,32）= 1.09、P = 0.3793

表1。統計の比較。

ディスカッション

文脈手がかりと恐怖条件付け試験は、学習および記憶を評価するための最も広く使用されているパラダイムの一つである。このテストでは、関連付けは、コンテキストおよび/または条件刺激（聴覚信号）と嫌悪刺激（電気フットショック）との間で行われたパブロフの条件付けの一形態である。コンテキストまたはキューのどちらかに直面したときにコンテキスト/聴覚信号およびフットショックの単一のペアリングした後、マウスは長期的な凍結を示す。この試験では、凍結挙動が恐怖記憶の指標として用いられる。薬理学的病変の研究は、記憶形成、統合、及び検索は、例えば扁桃体、海馬および前頭前皮質^3,33-35などのいくつかの脳領域によって調節されることを明らかにした。また、分子遺伝学研究は、特定の遺伝子および遺伝子改変マウス^36を使用して、これらの脳領域における学習および記憶に関与する分子の役割を実証した。したがって、このテストはSIMPLあるEと恐怖の学習と記憶の根底にある神経生物学的基礎を探索するのに便利。この映画の記事では、我々は理解し、簡単にテストを実行するための詳細な情報を実験者を提供するために、我々のプロトコルを導入しました。

すくみ行動は、人間の実験者による直接観察により定量した。よく訓練された実験者が観察渡って信頼性の高い、安定した結果を生み出すことが期待される。しかし、この方法は、それが困難な直接の独立実験者と異なる研究室からの結果を比較すること、そのような観測方法の違い、観察者バイアス、および単純な定量化の間違いのような潜在的な問題を伴う。自動化されたフォトビーム·ベースのコンピュータ·測定システムはまた^{、26,30-32に}使用されている。しかしながら、このシステムはまた、凍結挙動を測定する潜在的な問題を提示する。なぜならセンサ装置の、このシステムはtypicaなり、小さな頭の動きを検出することができない場合がありますLLY人間観察を通して「アクティブ」として採点する。また、凍結中震えは動物がフリーズ、フォトビーム間欠中断が震えるの結果として観察されている場合ので、不凍液として考えられるかもしれません。代替方法として、自動化された画像およびビデオ解析システムが^{17-20,37,38が}開発されている。 Anagnostaras ら ^37は、良好な有効性を有し、ウェル^{17,20,37-38の}凍結スコア画像分析ソフトウェアプログラムと、いくつかのシステムが記載されている。しかしながら、これらのシステムおよび解析プログラムのほとんどは商業的供給業者から入手しなければならず、典型的に高価である。我々は、凍結挙動の分析のためのImageFZソフトウェアプログラムを開発し、このプログラムはフリーソフトウェアプログラムとして分配される。 ImageFZは、ピクセルの体（粒子）として、マウスが検出され、「凍結」や量に応じて、「非凍結」と微妙なマウスの動きを判別する連続する画像の各対の粒子間の非オーバーラップ領域の面積。代表的な結果に示されるように、ImageFZプログラムを用いての測定は、と一致して又は他​​の方法を用いて得られるよりも正確である。このように、ImageFZプログラムが自動的に人間の観察者が定義した基準を使用して凍結するように判断する動作を測定します。また、ImageFZプログラムは、距離が凍結挙動の衝撃感度および分析の評価を容易にする、その間、およびフットショック露光後、前（cm）の走行を算出する。

方法論的な違いは、研究室間に存在する。これらの違いは、研究室間のデータを比較することが困難で、別の実験室での結果を複製することがあります。より安定した比較可能なデータを得るためには、できるだけ多くの試験プロトコルを標準化する必要がある。 ImageFZと解析システムに寄与することができる試験手順の自動化をもたらす研究室全体で使用されるプロトコルの標準化。

凍結挙動を分析する際に、いくつかの行動反応を考慮しなければなりません。動物は恐ろしい状況に直面するとき、最初に、彼らは^39を凍結するのではなく、逃げることがあります。逃げるには、恐怖反応の一つであり、その発生が恐怖記憶を過小評価につながる。第二に、凍結は、一般的な活動レベルに依存することが、実験マウスおよび対照マウスにおける活性レベルを検討する必要がある。 M1ムスカリン性アセチルコリン受容体を欠くマウスは野生型マウスと比較して凍結レベルの低下を示したが、例えば、種々の行動試験は、結果が代わりに記憶障害¹⁸のそれらの機能亢進表現型に起因し得ることを示した。 ImageFZは被験者が移動した距離（CM）を算出する。データは、違いは被験者間の一般的な活動レベルに存在するかどうかを調べるために用意されています。のグループの差が存在する場合走行距離、問題に対する一つの可能​​なアプローチは、距離を考慮することであるベースラインの活動などの訓練の最初の2分の間に旅して、抑圧比（テスト中抑圧比は=（活性）/（中にベースライン+活動中のアクティビティを使用する恐怖^17,40の二次インデックスとテスト））。最後に、電気フットショックに対する反応性の変化を誘発する疼痛感受性の差は、もしあれば、凍結挙動の変動をもたらし得る。 ImageFZも距離がフットショック感受性の指標として使用することができる、（6秒）の暴露後に2秒2秒のフットショックの露光前に2秒から詳細に（CM）を旅し計算します。

ビデオ分析システムは、ブラックアグーチアルビノの凍結挙動を測定し、茶色のマウスを希釈するために開発されてきた。 ImageFZ（ 図1B参照 ）白いマウスを調べるために黒い床トレイと黒のグリッドを使用しています。ブラックグリッドは仕様で作られている味方コーティングされた黒色塗料を、金属を加工し、典型的には、黒色マウスに使用される非被覆の金属グリッドと同様の導電性を有している。 ImageFZは、プログラム·パラメータの調整を経てラットおよび他のげっ歯類での凍結挙動を解析します。 ImageFZの現在のバージョンでは、被験者の挙動を分析するために凍結上壁からビデオカメラを用いて記録される。 ImageFZはまた、画像が室側から捕捉されるセットアップに用いることができる。また、ImageFZは4機器の最大値を制御します。この機能は、時間を節約し、各被験者の実行時間と動作上のテスト順の違いによる潜在的な影響を低減する、研究者は、同時に4匹のマウスを調べることができます。このように、ImageFZは試験手順と凍結挙動の分析を簡素化しており、このプログラムは、より少ない労力で、行動実験のための任意の訓練なしでテストを容易にします。

宮川ラボにおいてe_content ">、我々は、学習及び記憶上の所定の遺伝子の影響を解明するために、ビデオ解析システムを用いて、文脈と頭出し恐怖条件付け試験における遺伝子改変マウスおよび野生型対照マウスの110以上の株を評価している^41-42我々は5,000人以上のマウスの生データの大規模なセットを取得している公開された研究論文^4-16のために使用された生データを公開データベース（URLとして「マウス表現型データベース」に含まれています：HTTP： / / www.mouse-phenotype.org/）本映画の記事では、我々の実験手順の詳細についての詳細な情報を提供し、テストの状況の理解を促進する。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
ImageFZ program	Developed by Tsuyoshi Miyakawa		This program is available through O'Hara & Co., Tokyo, Japan and for free download at http://www.mouse-phenotype.org/. This software runs on 32-bit Windows XP/Vista/7.
Conditioning chamber	O’Hara & Co., Japan	CL-3002L	For mouse.
Cued test chamber	O’Hara & Co., Japan	CLT-3002L	For mouse.
Interface	O’Hara & Co., Japan	CL-1040	The interface includes a white noise/tone generator, which can be controlled by ImageFZ program.
Scrambled shock generator	O’Hara & Co., Japan	SGA-2040	The shock generator can be controlled by ImageFZ program.
Shock grid tester (ammeter)	O’Hara & Co., Japan	SG-T
USB video capture device	XLR8	USB2IVOSX
Quad image splitter	Wireless Tsukamoto Co., Ltd., Japan	400AS
Soundproof room	O’Hara & Co., Japan	CL-4210
Freeze Monitor	San Diego Instruments, Inc., CA, USA		16 x 16 photbeam array  ( 2.5 cm spacing)