術後免疫抑制のメカニズムを探索し、新しい周術期免疫療法を評価するための手術侵襲のマウス腫瘍モデル

要約

手術侵襲のマウス腫瘍モデルは、術後の免疫抑制は、転移性疾患を促進する方法を探索することおよび免疫刺激周術期治療を評価するために使用される。

要約

外科的切除は、ほとんどの癌患者のための不可欠な治療であるが、外科手術、免疫系における機能不全を誘導し、これは動物モデルおよび癌患者における転移性疾患の発症に関連している。我々のグループなどからの臨床前の仕事は、自然免疫機能、術後の期間に、特にNK細胞の深遠な抑制を実証しており、これは手術後の転移の強化発展に大きな役割を果たしている。比較的少数の動物試験および臨床試験は、癌手術の有害な影響を特徴付ける及び後進に焦点を当てている。自発的に転移性腫瘍および手術侵襲の厳密な動物モデルを使用して、肺転移の発生に対する癌の手術の向上が実証された。このモデルでは、4T1乳癌細胞をマウス乳腺脂肪パッドに移植される。 14日目に腫瘍移植後では、原発乳腺腫瘍の完全切除がperformeですすべての動物におけるD。動物のサブセットは、腹部の腎摘出の形で追加的な手術侵襲を受ける。 28日目​​に、肺腫瘍結節が定量化される。免疫療法はすぐに手術前に与えられた場合には、手術後に転移の発生を防ぐ免疫細胞の深遠な活性化が検出されました。 4T1乳房腫瘍の手術モデルは腫瘍転移に腹部の手術ストレスの影響のシミュレーションを可能にしている間、他の腫瘍タイプへの適用をテストする必要があります。現在の課題は、前臨床マウスモデルにおいて安全かつ有望な免疫療法を識別し、転移性疾患の再発を防止するために、癌手術患者に与えられる実行可能な周術期の治療にそれらを変換することである。

概要

手術は固形腫瘍の治癒的癌治療における重要なコンポーネントですが、完全切除にもかかわらず、多くの患者は、転移、再発を開発し、最終的には自分の病気で死亡する。ますます、術後期間は、血液凝固、増殖因子の放出、及び免疫抑制を含む手術生理的ストレス応答の結果として、転移の発生のための臨界時間として認識される。われわれのグループ^1,2およびその他^3-5は手術直後の期間は転移の形成のために独自に影響を受けやすい時期であることを示した。

手術の前転移性の影響に関与する重要なメカニズムの一つは、ナチュラルキラー（NK）細胞が^1-3の術後機能障害である。 NK細胞は、腫瘍増殖および転移⁶の制御に関与する先天性免疫系の細胞傷害性リンパ球である。手術後のNK細胞の機能不全iは実証されているNヒト患者^1,7-9および動物モデル^1,10,11両方。ヒトの研究において、周術期の間に低NK活性は癌の再発および死亡率が高い^15,16に関連している術後のNK細胞の抑制は、自発的な注入された^1,11-14転移の動物モデルにおいて増大した転移と相関する。

それにもかかわらず、特に直後のがんの手術を発生前転移性の変化への対応なく癌治療は現在ありません。周術期は、転移プロセスに介入するには機会の治療ウィンドウを表す。このような細胞毒性化学療法などの伝統的な癌治療法は、大手術¹⁷から回復した患者に投与されるにはあまりに毒性が考えられるが、免疫療法は、周術期投与のための理想的な候補である。組換えIL-2およびIFN-γの周術期の使用は私に研究されてきた術後のNK細胞の抑制を防ぎ、無増悪生存期間^18〜21を改善する可能性を実証するN初期段階の臨床試験。残念ながら、今後の発展には、大手術¹⁷と組み合わせて、この非特異的なサイトカイン療法の忍容性によって妨げられてきた。ウイルスはまた、NK細胞の強力な非特異的活性化剤である。我々の研究は、以前にこのような新規の抗がん腫瘍溶解性ウイルス（OV）、およびインフルエンザワクチンのようなウイルスワクチンを、非複製などに複製するウイルスの術前投与は、手術により誘導されるNK細胞の機能不全を阻害し、転移性疾患^1,22を減衰させることができることを実証しました。

このホワイトペーパーで説明外科モデルは、手術後の腫瘍細胞の広がりと成長に関与するメカニズムの理解を促進し、私たちは周術期に投与することができる新規な標的療法を探索することができました。この目標を達成するために、動物手術侵襲と自然転移札束開発モデル。自発的に肺特に複数の遠隔部位に原発乳腺から転移することが可能である - このモデルは、マウス乳癌腫瘍（4T1 BALB / c）に利用する。 0日目に、乳癌細胞をマウスの乳房脂肪パッドに移植される。 14日目に腫瘍移植後に、原発乳腺腫瘍の完全切除が全ての動物で行われる。動物のサブセットは、腹部の腎摘出の形で追加的な手術侵襲を受ける。 28日目​​に、外科的肺腫瘍結節を強調し、比較しない手術対照マウスは、単離されず、定量化される。がんや手術のこの動物モデルにおいて、癌転移の手術の影響が検討されていると、ウイルスに基づいた免疫刺激剤を複製し、複製しないなど、革新的な免疫療法の周術期投与の有効性が初めてテストされています。

プロトコル

1。 in vitroで 4T1腫瘍細胞を維持する

1. 10cmの組織培養プレート中の完全DMEMで培養未修飾4T1腫瘍細胞（DMEM、10％FBS、1×ペニシリン/ストレプトマイシン）。 37°C、5％CO ₂組織培養インキュベーター中でインキュベートする。
2. スプリット培養2〜3回/週。最適な生存細胞を維持するために80％コンフルエンスを超えてはならない。培養は> 1ヶ月、in vitroで継代された場合には、これは、以前の継代した細胞よりも悪性度や転移の可能性を減少させるように、生体内の原発腫瘍を確立するための細胞を使用しないでください。

2。注射用収穫4T1腫瘍細胞

1. パスツールピペットを用いて組織培養プレートから吸引し、培養培地。
2. 2ミリリットルのEDTAを含む1Xの滅菌PBS 10ミリリットルを追加します。 PBS溶液を37℃で5-7分間、5％CO ₂組織培養インキュベーターにてプレートでインキュベートしましょう。
3. プレートから収穫PBS溶液、R溶液を用いて、プレート2〜3倍をinsing、15ミリリットルコニカルチューブに移す。
4. ベンチトップ遠心分離機で4℃、500×gで5分間、遠心細胞。
5. 上清を吸引し、無血清DMEM中で細胞ペレットを再懸濁します。
6. 細胞カウンターを用いて細胞濃度を決定する。
7. 1×10 ⁶ cells/500に無血清培地で細胞を希釈して氷上に注入し、場所細胞についてμL（1×10 ⁵ cells/50μL（。

3。 4T1腫瘍細胞をマウスに注射

実行されたすべての動物実験は、同所注射または腫瘍移植を受けたすべての動物のためのオタワの勧告の大学の動物ケア獣医サービスの施設のガイドラインに従った。

1. 疼痛管理のための手術前にブプレノルフィン（0.05 mg / kg）を1時間で皮下マウスを扱う。
2. injecの期間中に2.5％イソフルランを使用して麻酔下でマウスを誘導し、維持するTiONから。反射反応を検出するために、マウスの足蹠ピンチ。何も検出されない場合、有効な麻酔レベルが達成される。無菌眼用潤滑剤は、次いで、角膜の乾燥を防ぐために適用される。
3. 30 Gをロード½細胞懸濁液を正確に50μLの「超微細」注射器に。すべての気泡が気泡を取り除くために、注射器の側面をタップして、注射器の列から削除されていることを確認してください。
4. 腹側を上に（麻酔下）にマウスを置きます。
5. アルコール綿を使用した注射部位をきれいにし、第4回乳房脂肪パッドに水平に直接針を導入し、ゆっくりとシリンジ容量を分注する。
6. すべての可能な漏れをきれいに綿棒を使用してください。
7. マウスは麻酔から回復することができます。
8. 2日間、8時間毎に皮下投与した疼痛管理のためにブプレノルフィン（0.05 mg / kgの）を維持する。

4。 BALB / cマウスベアリング4T1腫瘍における周術期治療を施す

治療レジメンとインフルエンザワクチンの投与のための経路は、腫瘍溶解性ウイルス術前治療と同じです。

1. 13日後に腫瘍細胞注射では、外部のキャリパーを使用して、原発腫瘍を測定します。ノギスでの最大の長径（長さ）および最大横径（幅）を測定します。修飾された楕円の式は、腫瘍体積（ 腫瘍体積 = 1/2（ 長さ Ã 幅 ^2）を計算するために使用される
2. 13日後に腫瘍細胞注射では、原発腫瘍が約1cm ^3を測定する必要^があります。この腫瘍測定が達成されたときに、周術期治療試薬を調製する。
3. 腫瘍溶解性ウイルスは、1が周術期に管理することができます1の革新的な治療である。注射の前に氷上で1×滅菌PBS、所定の位置に腫瘍溶解性ウイルス（1×10 ⁹ PFU / 1ミリリットル）を準備します。
4. 安全で場所をマウス静脈内尾部静脈注射のために拘束。
5. 穏やかに外側尾静脈を可視化するために温かい水道水でマウス尾を加熱する。
6. 27 Gをロード½ "インスリンシリンジ」の腫瘍溶解性ウイルス療法の正確100μlで。すべての気泡がシリンジカラムから除去されていることを確認。
7. 外側尾静脈のいずれかに1×10 ⁸ PFU/100μL/マウスでマウスを注入。針が適切に横静脈に挿入されている場合は、注射器を押し下げたときに、全く抵抗が感じられてはならない。

5。原発腫瘍の切除や腹部、左腎摘出を完了

1. 14日後に腫瘍細胞注射で、オタワ動物管理獣医サービスの大学のプロトコルを承認し、次のルーチン周術期のケアを開始します。疼痛管理のための手術前にブプレノルフィン（0.05 mg / kg）を1時間で皮下マウスを扱う。誘導し、手術中に2.5％イソフルランを使用して麻酔を維持。 UNDER条件を滅菌し、無菌手術器具を使用して、手術部位を剃毛し、スクラブされています。動物は、手術前に皮下流体および眼の潤滑剤を投与する。
2. 穏やかに完全に乳房脂肪体から原発4T1腫瘍を除去するために小さな切開（長さ1〜2センチ）を作る。
3. 2月3日9ミリメートルのステープルで切開を閉じます。
4. マウスの腹側正中線に沿って皮膚および皮下層を介して切断することにより、腹部を公開します。
5. マウスの腹膜にアクセスするための白線（3-4 CM）で切開する。
6. 側に覆って腸を動かすことで、腹部の左側内側を公開します。腸を生理食塩水に浸した滅菌ガーゼで湿った保たれていることを確認します。
7. 外科鉗子の鈍ペアを使用して、静かに左腎臓を把握する。
8. ループに縛ら3-0ワックスコーティングされた編組絹縫合糸を使用して、左腎臓の門を連結し、3外科結び目で固定します。 surgiで左腎臓を削除CALはさみ。
9. 十分な止血が達成されることを保証するために慎重に縫​​合タイを点検します。
10. 9ミリメートルのステープルを使用して5-0編組吸収性、そして定番スキン層を使用した連続ループ縫合糸で皮下層を閉じます。 5.10への5.2は10分/動物を必要としなければならない手順。
11. 2日間、8時間毎に皮下投与した疼痛管理のためにブプレノルフィン（0.05 mg / kgの）を維持する。

6。安楽死マウスとその処理と肺腫瘍負荷の定量化

1. 4T1腫瘍注入後28日目に、オタワ大学の動物管理獣医サービスのプロトコルに従ってマウスを安楽死させる。
2. 70％エタノールでマウスを下にスプレーします。
3. ちょうど肋骨の下にはさみで最初の切開を行います。
4. マウスの胸腔の腹側正中線に沿って皮膚と皮下層を切断することで胸郭を公開します。
5. NEまでそれぞれの側の皮膚や組織を通って横方向の切開を作るマウスのCK。
6. 肺の上下に結合組織を離れて切り取るながら優しく肺をつかんで、肺を解剖する。
7. 予浸を10％緩衝化ホルマリン中に置き、次いで、残留血液を除去し、冷PBSで肺を抽出した。
8. 腫瘍転移の評価のための各肺を撮影。腫瘍量の定量化のために肺の重量を量る。

結果

肺転移の劇的な強化をもたらし、外科的ストレスの再現性のマウスモデルが開発されている。一日に28ポスト4T1腫瘍接種（および14日後に腫瘍切除+ / - 腹部腎摘出）、肺転移のために収穫し、可視化した。手術は明らかに、肺の写真（ 図1A）、肺結節の列挙（ 図1B）及び肺重量（ 図1C）によって示されるように、未処理マウスと比較して肺転移の量を増加させる。腫瘍溶解性ウイルス不活化インフルエンザワクチンを複製術前投与は、がんの手術の前転移性の効果（ 図1A-C）を救う。

NK細胞は、ワクチン後の処理の転移の予防に媒介役割を果たしているかどうかを決定するために、NK細胞は、薬理学的に腫瘍転移モデルにおいて抗アシアロ-GM-1を用いて枯渇させた。 NKが存在しない場合には細胞は、我々は、周術期の免疫療法の治療効果の抑止（ 図2Aおよび2B）を観察した。このデータは、我々の外科的ストレスモデルにおける腫瘍転移の除去は、主としてNK細胞の腫瘍溶解性ウイルスおよびインフルエンザワクチンの活性化およびその後のNK媒介性の腫瘍溶解を介して媒介されることを示唆している。さらに、腫瘍溶解性ウイルスおよびインフルエンザワクチンの周術期の投与後のNK細胞機能を特徴付けるために、ex vivoでの NK細胞の死滅を評価した。手短に言えば、プールし、ソートDX5 + NK細胞は、外科的に強調し、対照マウスの脾細胞から単離した。これらは、ガンマカウンターで上清クロム放出を測定し比をターゲットに異なるエフェクターで、クロムラベルYAC-1標的細胞と4時間培養した。腫瘍溶解性ウイルスとINFLの周術期投与後のNK殺傷の有意​​な回復とともに、NK細胞の細胞傷害性の大幅な手術誘起欠陥uenzaワクチンは手術単独に比べて（ 図2Cおよび2D）が観察された。まとめると、これらの結果は、周術期のNK細胞の抑制が正常に処理し、転移性疾患の新規治療法と免疫刺激を低減することができることを実証している。

図1。肺腫瘍の肺転移の手術誘発性増強に対する周術期治療としての抗癌腫瘍溶解性ウイルスおよびインフルエンザワクチンの新規。代表肺の（A）の写真によって指示された処置群の28日目の4T1肺腫瘍転移の評価、（B）の列挙結節および（C）の肺の重み。データは3類似した実験の代表例であるN = 5-10/group（*、P = 0.01; ** P <0.0001; NS、有意ではない）。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。

図2。外科的ストレスがNK細胞を損なうことによって、肺腫瘍転移を増加させる。 （A、B）における肺腫瘍転移の定量は、外科的に新規な周術期治療で処置したマウスを強調した（C、D）外科的により精製されたDX5 + NK細胞の能力を強調し、腫瘍細胞を殺すために、未処理の対照。 T比：示され、Eのための三重のウェルからクロム放出の - （SD + / - ）のデータは平均パーセントとして表示されます。データは、n = 4-5/group（; ** P <0.005; NS、有意ではない*、P = 0.01）3類似した実験の代表である。/ www.jove.com/files/ftp_upload/51253/51253fig2highres.jpg "ターゲット=" _blank ">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。

ディスカッション

外科的切除は局所的な固形悪性腫瘍患者のための治療の中心です。でも、完全切除して、多くの患者は、転移、再発を開発し、最終的には自分の病気で死亡する。手術直後の期間は術後、NK細胞の抑制によって大部分が変調されたがんの転移の形成、、、のための理想的な環境を提供します。これにもかかわらず、それはほとんど無視されている治療ウインドウのまま。 術後の転移を防ぐことを目的とした標準的な周術期の抗癌治療は現在ありません。現在の課題は、それによって微小転移疾患の確立を防止し、周術期にNK細胞を活性化します安全かつ有望な治療法を特定することである。これらの治療法は、厳密に前臨床動物モデルでの安全性と有効性について特徴づけした後、考え込むように設計された臨床試験に翻訳されなければならない。

原発比率手術侵襲のマウス腫瘍モデルを開発するnaleは、手術後の免疫抑制および転移拡散のメカニズムを探索し、原発腫瘍を除去する手術を受けている癌患者における将来の使用のための潜在的に革新的な免疫療法を評価することである。この目標を達成するために、外科的ストレスと結合4T1マウス乳癌モデルが開発された。 4T1細胞株は、マウス「乳癌」であるが、この細胞株を使用する理由は、私たちは現実的な癌モデルにおける手術侵襲の影響を評価することを可能にする自発的転移の再現性である。この文脈において、悪性腫瘍の実際の起源は、転移の可能性および腫瘍生物学よりも重要である。我々のモデルの第二の重要なコンポーネントは、密接に人間のがんの手術に似ている動物の外科的処置の開発である。それが1cm ^3に達した後、この動物の外科的ストレスモデルにおいて、一次4T1乳房腫瘍が切除される。なぜならヒト患者における癌の手術は、「外科的ストレス」治療群で開いている腹部腎摘出術がさらに行われ、有意な免疫抑制を伴う。それは、ヒトにおいて、より従来型の腫瘍切除に匹敵するように、完全な左腎摘出術の侵襲的な性質は、結腸直腸癌、卵巣癌、腎臓癌、膵臓癌、肺癌および食道の手術を含む固体悪性腫瘍に対する外科的治療の多くのタイプに非常に匹敵するがん。加えて、我々は開腹+腎摘出による手術時に発生する重大な生理学的変化は、十分にほとんどの固形悪性腫瘍に対する侵襲的手術後に発生する圧倒的な生理学的変化を再現することを主張するだろう。過大な手術侵襲と死亡率、麻酔や手術時間につながり、手術中に体温を維持できた周術期の要因を制御するには、正確に定義されている。すべてのこれらのパラメータを正確に実行されますDは、ヒト癌患者におけるルーチン周術期のケアをミラーリングする私たちの手術プロトコルで定義されている。

周術期治療のタイミングは、周術期の救助·モデルに追加の重要なコンポーネントです。 4T1腫瘍を有するマウスは、以前にインフルエンザワクチンの3レジメンで治療されています：ネオアジュバント（手術前に5日間与えられた）、周術期（手術の同じ日に与えられた）、手術の日に与えられた周術+マルチドーズは（2に続く追加投与）は5日間隔で与えられた。驚くべきことに、ワクチン治療のすべての3つのモードが大幅に肺転移²²減少^した。しかし、インフルエンザワクチンは、転移の最も効果的に低減する単回用量として手術時に投与。まとめると、これらの実験は、転移過程に介入する狭い治療ウィンドウとして即時周術期の重要性を強調している。

このようなoncolyなどの革新的な免疫療法の周術期の使用チックウイルスおよびワクチンは、排他的に我々の研究グループに限られていた。我々は、新規腫瘍溶解性のORFとワクシニアウイルスの周術期投与が動物モデル¹における手術後のNK細胞抑制を逆にすることができますことを初めて実証した。さらに重要なことは、免疫機能のこの救済は、転移の術後の形成の減少と相関している。ヒトの研究では、術後の癌の手術患者は、NK細胞の細胞傷害性が減少したと周術期のOVが著しく癌患者¹にNK細胞活性を増大させる。市販の予防ワクチンを用いて、我々は、周術期のインフルエンザワクチンの投与は、有意に腫瘍転移を低減し、前臨床腫瘍モデルにおけるNK細胞の細胞障害性を向上させることを実証した。ヒトの研究において、インフルエンザワクチンは、有意に²²健康なヒトのドナーおよび癌の手術患者におけるNK細胞活性を増強した。

多くのアプローチがCANCを低減するために使用されている化学療法、放射線が、これらの治療を含む、ERの再発は、通常（ネオアジュバント）の前または（アジュバント）手術後数週間から数ヶ月投与する。この分野の研究は、手術直後の期間が長期腫瘍再発率を決定する上で非常に重要であることを示している。そのため、この重要な期間中に免疫療法の形で臨床介入は、かなり長期的なメリットを持っていることがあります。自発的な肺転移および外科的ストレスのマウスモデルを用いた我々の研究は、新しい治療法を探求し、癌手術患者において周術期の免疫抑制を防止し、それによって、癌の再発率を低下させる可能性を決定するためのユニークな機会を提供する。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Corning Cell-Gro	10-013-CV
Inactivated Fetal Bovine Serum (FBS)	HyClone	SH30396.03
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15070-063
1x Sterile Phosphate Buffered Saline (PBS)	Corning Cell Gro	21-031-CV
Buprenorphine	Chiron, Guelph	RXN309968
Isoflurane	Baxter Corp	1001936040
1/2 Ultra-fine syringe	Terumo	30 G, SS05M3009
9 mm Staples	Braintree	ACS BX
5-0 Braided absorbable suture	Covidien	UL-202
3-0 Wax braided silk suture	Covidien	S-194
Formalin	Fisher	SF100-20
4T1 Tumor cells	ATCC	CRL-2539
BALB/c mice	Charles Rivers Labs	Strain Code:028