Subnormothermicのテクニック<em&gt;生体外</em&gt;肝臓ストレージ、評価のための灌流、およびマージナル肝移植片の修復

要約

そのような脂肪肝、古いドナーからの移植片、または心臓死（DCD）の後に検索された肝臓のような限界移植片は、不十分にしか従来、冷たい静的記憶を容認。私たちは、移植前に限界肝臓移植片の保存、評価、および修復のためのsubnormothermic ex vivoでの肝灌流の新規モデルを開発した。

要約

肝移植の成功は劇的な臓器不足をもたらした。ほとんどの移植領域では肝移植の待機リスト上の患者の20〜30％が臓器移植を受けることなく死亡したり病気の進行のために上場廃止されています。ドナープールを増加させるための1つの戦略は、そのような脂肪肝、古いドナーからの移植片、または心臓死（DCD）の後に寄付として限界移植片の利用である。冷たい静的記憶の現在の保存技術は、わずかにしか重大な臓器損傷をもたらす限界肝臓によって許容されている。また、冷たい静的臓器保存は、グラフト評価または移植前に修復することはできません。

冷たい静的保存のこれらの欠点は、冷たい虚血性傷害を減らす保存時の肝臓移植片を評価し、移植前に限界肝臓を修復する機会を探求する温かい灌流臓器保存への関心を引き起こした。最適PRES確認およびフロー条件、灌流温度、灌流液の組成と酸素担体の必要性はこれまで議論されている。

いくつかの動物試験において有望な結果にもかかわらず、複雑さとコストは、これまで広範な臨床応用を妨げてきた。最近では、ex vivoでの間の強化された技術および肝臓生理学のより良い理解を温かい肝臓灌流の結果を灌流改善され、一貫して良好な結果を達成することができる。

本論文では、ブタの肝臓検索、保存技術、および分離された肝灌流に関する情報を提供します。私たちは、要件が器官に十分な酸素供給を確保するために）説明しますと、b）灌流マシンと灌流液、および単離された臓器のc）の生化学的側面についての技術的な考慮事項。

概要

肝臓移植は、末期肝疾患または進行肝細胞癌患者のための唯一の治療選択肢である。過去25年間、待っているリストの候補の数が次第に増加し、利用可能な移植片の数を超えています。心臓鼓動ドナーの数は、過去10年間で減少している。同時に、そのような心臓死（DCD）の後に寄付として限界移植片、だけでなく、古いものと、脂肪肝臓の数字は^、1,2を増加している。

マージナルグラフトはしばしば、一次移植以外または遅延機能の高い確率で肝移植のために減少している。 DCD移植片において、虚血性型胆管狭窄（ITBS）の開発は、特別な関心事である。従来の静的低温保存技術では、ITBSはDCD移植片の約10〜40％に起こる。大多数の患者では、ITBS再移植または患者の死亡をもたらす。特に長時間の暖かく、冷たい虚血時間は危険ですITBS ^3-7要因。追加的なリスクは^7-10因子としてドナーの年齢、（例えばCCR5デルタ32のような）遺伝的素因、及び保存液の選択は、議論されている。 DCDと肝移植は^11をグラフトした後peribiliary血管の部分的な微小血栓はITBSのための潜在的なメカニズムとして示唆されている。

肝移植の臨床導入される前は、ex vivoでの肝灌流は肝代謝と生理学^12,13を研究するために使用されてきた。肝移植は1960年代に臨床現場にその方法を発見した後、無数の試みが生理的栄養と酸素化状態を模倣することによって保存方法としてex vivoでの肝灌流を使用する試みがなされてきた。マージナル移植片の保全のためのその有用性は10年で研究されてきたが、それは標準的な臨床ケアに達しなかった。私たちは最近、D中の胆管損傷の減少を説明したex vivoでのCDによる肝移植、保存¹⁴灌流した。灌流液に関するさまざまなアプローチがなされた。選択は、マシンウィスコンシン大学液、IGL液、またはスティーン·ソリューション^14-19のような無細胞のアプローチに、ヒト血漿と組み合わせたドナー動物または濃縮赤血球からの全血のような細胞のソリューションの範囲である。

温度が^4-37℃20の範囲である。低体温、subnormothermic、および正常体温での命名法は、非常に可変と矛盾しています。すべての異なる技術、ソリューション、および温度設定は1）安定した灌流条件、2）十分な酸素化、および器官機能の3）再確立を目指します。強化された保存容量だけでなく、正常体温とsubnormothermic灌流中の臓器評価と治療の能力は、低体温灌流^20,21と比較して、より高い技術的な複雑さとコストに直面している。

私たちは、過去4年間でsubnormothermic ex vivoでの肝灌流システムを開発した。システムは、肝エネルギー含量を「再充電」1）を使用することができ、2）移植前に限界肝臓を修復）移植片の品質を評価し、3にする。以下のプロトコルは、安定した肝灌流のためのすべての情報が含まれます。

プロトコル

プロトコルの概略図を図1に示されている。

図1：研究プロトコル。肝障害のブタ研究デザインは、心臓死（DCD）モデルの後に寄付に基づいています。すべての肝臓血管の解剖した後、心臓死は暖かいグラフト虚血の45分に続いて誘導される。臨床現場におけるドナーとレシピエントの病院の間での移植片の輸送をシミュレートするために、移植片は冷たい、デュアルフラッシュの後、4時間氷上で保存されている。冷蔵後、器官を灌流安定性を評価するために、6時間subnormothermic灌流される。移植モデルにおいて、潅流時間はエネルギー貯蔵を再充電すると臓器の生存率を評価するためにに短くすることができます。 彼をクリックしてくださいこの図の拡大版を表示するために再。

1。動物

注：男性ヨークシャー豚30〜35 kgの、この研究のために利用した。全ての動物は、医学研究のための国家社会と「国立衛生研究所によって出版 '実験動物の管理に関する指針」により処方'実験動物管理の原則 'に準拠して人道的なケアを受けた。トロント総合研究院の動物管理委員会は、すべての研究を承認した。

2オルガン検索

1. ストレスのレベルを減少させ、住宅事​​情に動物を慣らすために、灌流/移植前1週間の研究施設でのハウスオスのヨークシャー豚。施設内の住宅の2日未満は、灌流の成果^22,23を変更することができますストレス誘発物理的反応、につながる。
2. 豚を麻酔ケタミン（25mg / kgの）、アトロピン（0.04ミリグラム/ kg）で、およびミダゾラム（/ kgの0.15 mg）の混合物の筋肉内（IM）注射によって投与することができる。
3. 挿管の前に、豚を5％イソフルランを投与したO ₂を自発的に2 Lを呼吸することを確認してください。声帯のけいれんを避けるために、挿管前に、2％リドカイン2分で声帯スプレー。例えば、35キロの豚のために6.5のFRを使用しています。気管チューブ。室内空気3〜5 mlの気管チューブをブロックします。
4. 挿管後、正しい挿管を確認するためにカプノメトリを使用しています。 2％イソフルランガスを下げます。 14-16呼吸/分および10ミリリットル/ kg体重の一回換気量に人工呼吸器を設定してください。
5. 乳酸リンゲル液（時間当たり200ミリリットル）の注入を可能にするために耳の静脈のいずれかで20 G静脈内（IV）カテーテルを配置します。その後、豚をスクラブし、滅菌ドレープでそれをカバーしています。
6. 左横方向延長に続いて正中切開を行います。大小の腸をカバーし、左側に移動したタオルを使用してください。
7. セパレートinferior大静脈（IVC）、および互いから遠位の大動脈;背面にライゲーション大動脈の枝;付着性組織から腎動脈を分離し、自由。
8. 焼灼を使用してfalciforme靭帯と三角靭帯を分割します。
9. 膵臓と門脈の間腹膜の切開により門脈をリリースします。門脈に膵臓から水切り静脈をオフに接続します。
10. 門脈下の腹腔動脈を解剖し、大動脈に後方にそれに従ってください。 2-0のタイとの腸間膜動脈を囲む。枝後方腹腔動脈への脾臓と左胃動脈を囲む。門脈オフ腹腔動脈を解剖。
11. リンパ管の漏れを防ぐために、肝十二指腸間膜内のリンパ管を連結する。タイの間の右胃動脈を分割します。小さい静脈を結紮。靭帯から胆管を分離し、遠位に結紮後にそれを分ける。
12. 心臓や腹腔TRとの間にダイヤフラムの背後にある大動脈を解剖UNK;大動脈の周りに2-0ネクタイを配置します。
13. 電気焼灼を使用して、右側の下静脈から肝臓を離し;静脈と肝臓の間の上側部分にハサミを使用しています。
14. 胆嚢を削除し、胆嚢床からブリーダーを焼灼。
15. ヘパリンの静脈千IU / kgをドナー体重を管理します。 DCDモデルでは、ヘパリン投与後40ミリバルのKCl 3分の心臓内注射することにより心停止を誘導する。温虚血の出発点として心停止を設定します。
16. 灌流のために、すぐに心臓死の後CPDA袋に豚の血の1.6 L（クエン酸塩、リン酸塩、ブドウ糖、アデノシン）を収集。ソフトスピン（ブレーキなし2000×gで）を実行します。無菌状態（バイオセーフティキャビネットクラスII）の下でプラズマと軟膜を取り外し、輸血のためCPDAバッグ内の赤血球を格納します。
17. 臓器フラッシュラインを有するカニューレを挿入門脈と大動脈。大腿骨、腎臓、脾臓、腸間膜、および左胃アートを中心に、以前に設定し絆をオフにネクタイシリだけでなく、アッパー大動脈。心臓鼓動ドナー（HBD）モデルの場合、心臓の鼓動条件の下で大動脈と門脈のカニューレ挿入を実行します。
18. 45分温虚血後、大動脈（圧力バッグ）と門脈（重力駆動）を介して二重の灌流を使用して、ウィスコンシン大学（UW）溶液を用いて、肝臓をフラッシュ。
19. 長い残りのすべての船を残して、豚から肝臓をカット。
20. バックテーブル作成時には、門脈流出が透明になるまで下IVC経由逆行UW溶液約0.5リットルで二度目をクランプし、肝臓をフラッシュSatinskyを使用して、上部IVCをクランプ。
21. 大動脈とセリアックトランクからすべての動脈枝を切り接続します。 UW溶液約0.5リットルで、動脈バックテーブル圧力灌流を行います。
22. UW液を用いて胆管を洗い流す。
23. ルアーロックで1月2日 "×8"リデューサーを使用してIVCの上部と下部にカニューレを挿入; 「3月8日を使用して、門脈、肝動脈にカニューレを挿入;ルアーロック付きのx 4 "と4分の1"×8 "リデューサー。静脈排出として、上下大静脈を使用してください。
24. 、臓器の袋に肝臓を置き臓器袋を閉じ、灌流が開始されるまで氷上に肝臓を格納します。

3 エクスビボ肝臓灌流

1. 2000ミリリットルスティーン溶液を含む灌流溶液を調製し、400mlを、550mgのピルビン酸ナトリウムを赤血球を洗浄し、100mlのアミノ酸溶液（10％Travasol）、10mgのグルコン酸カルシウム1000 IE即効型インスリン、1gのセファゾリン、500ミリグラムメトロニダゾール、 10,000のIUヘパリン。血管拡張、免疫抑制、活性酸素種の捕捉、または特定の試験プロトコルに基づいて、肝臓細胞治療のための他の分子を加える。
2. 透析コンポーネントの場合、標準の3.5 mMのカリウム、25 mMの重炭酸ナトリウム、27 mMグルコースを含む透析液と同様に、275 mg / Lのピルビン酸を使用しています。
3. セットアップ灌流回路（スキーマは図2を参照）。
   
   図2の回路を設定します。始点と終点として、メインタンクから来て、灌流溶液は、人工肺を通って遠心ポンプにより駆動される。適切なソリューションの酸素化した後に、回路は、電解質のホメオスタシスのための透析器ユニットに実行されているより小さなラインに分割し、大きなラインが残存白血球（WBC）の還元のための白血球フィルターに実行されている。透析器を流れるソリューションは、主リザーバに戻ります。白血球フィルターの後、回路が2に等しい行に再び分割されます。 1本の線は、肝動脈を灌流するために直接、大動脈内に高圧（約60 mmHg）でで動作します。他のラインは、第二リザーバに排出されます。このリザーバから門脈を灌流する。ポータル灌流の圧力は、（2-6 mmHgの周り）リザーバーの液面の上昇エネルギーに依存する。全ての流体は、DRであるインフラとバック主リザーバへの超相肝静脈を経由してained。重力低減し、均質な灌流のために、肝臓は、温度調節水を満たしたプール内に配置されている。これは、不透過性の膜によって水から分離し、それは灌流懸濁液中泳ぐされています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
   1. 3Lのリザーバー（主リザーバ）の回路から全ての流体を収集し、流出をクランプします。
   2. 商用人工肺に続く遠心ポンプへの流出を接続します。
   3. 人工肺の後ろに、2行に配管を分割。透析器に1ラインを接続し、主リザーバに戻し、それを排出します。白血球除去フィルターへの第二線に接続します。
   4. 肝動脈に灌流液を供給する動脈ライン、中に白血球除去フィルター、およびポータルvの後に行を分割enousラインは重力流出による門脈に排出する第二のリザーバーに灌流液を提供する。ポータル流入をクランプ。
   5. 流体回想のための主要なリザーバに排出する大静脈ラインに動脈ラインを接続します。
   6. 腹水または肝臓からの灌流液の漏出の収集については、主リザーバに接続された吸引ラインを準備します。
4. メインタンクから流出クランプを解除し、灌流液で回路を埋める。 /分1500回のラウンドでの遠心ポンプを起動します。灌流液は、主リザーバに戻す大静脈ラインに動脈ラインをドライブします。すべての空気が回路に出力されていることを確認します。
5. 人工肺へのガス供給をオンにします。
6. 氷から肝臓を取る。食塩水を用いてUW溶液を洗い流す。
7. 避けるために、理想的に無重力環境における、血管へのアクセスを容易にするために、その凸側と、肝臓を下に置く接触面での臓器圧縮。耐熱性、冷却可能な水浴を使用してください。 20℃に回路と水浴の開始温度を設定します。不透過性の膜で水浴をカバーし、その膜上に肝臓を置く。灌流溶液で肝臓を沈めることによって、重力駆動型圧縮を削減します。
8. 千回/分に遠心ポンプの速度を減らし、動脈および大静脈線の接続で2クランプを配置します。その後、クランプ間にチューブをカット。 3ウェイコネクタを使用して、両方の静脈流出に参加し、大静脈ラインに接続します。
9. 、動脈ラインからクランプを解除し、気泡を取り除くために動脈カニューレに灌流液を注ぎ、そしてカニューレに回線を接続してください。 /分1500ラウンドに遠心ポンプを増やします。大静脈ラインから第2のクランプを解除してください。
10. それを埋めるために、門脈リザーバからクランプを解除してください。灌流溶液は、ポータルcannu注ぐましょうラして接続します。ポータルリザーバ内の安定した流体のレベルで特別な注意を払ってください。
11. 動脈、門脈、および大静脈カニューレのルアーロックに圧力ラインを接続します。
12. 生理学的条件を模倣するには、右側の容器に治療法を適用する。勾配の増加門脈グルコース勾配を模倣し、グリコーゲン合成^24,25を誘導を確立するために、動脈ラインに門脈にグルコースを注入していない。
13. 回路に肝臓を接続した後、60分以内に33℃まで温度を上げてください。
14. 40 mmHgで約250ミリリットル/分で動脈流動開始を目指す。圧力が70 mmHgのまで増加されると、これは、潅流中に700ミリリットル/分に達することができる。
15. 開始温度で、3〜5 mmHgので500〜600ミリリットル/分の門脈の流れを目指す。温度を上昇させた後、4〜6 mmHgので1100ミリリットル/分まで増加する門脈の流れを監視する。 physiologicaの上に門脈圧を超えないように正弦開窓^26を保護するために、L値（約8 mmHg）で。臓器の損傷を防止するために、2000ミリリットル/分以上の総流量を超えないようにしてください。機能的な流出障害による肝臓の混雑を防ぐために、主リザーバを下げることにより、-2 mmHgでの流出を設定します。
16. 所定の値に²⁷を灌流液を平衡化するために、回路に透析コンポーネントを追加します。 500ミリリットル/時の透析液の流れを設定します。灌流液を希釈することも、集中もされていないように、透析流出を調整するために特別な注意してください。灌流の最初の一時間以内に主リザーバを慎重に監視される必要があります！
17. O _{2（95〜98％）}とCO _{2（2-5％）}の主ガス混合成分を用いて、臓器の機能を回復し、維持するために、組織の均質な酸素化を確認してください。肝臓は、灌流の間、その代謝とそのpHの需要を変化するため、灌流中に変数のガスを使用してください。
18. の開始時に低pHを維持UW液中で保存した後に、臓器はCOの分圧を調整して7以下アシドーシスのpHを有しているので、パラドックスのpH概念^28を用いて臓器を保護し、再酸素化の下で、生理的pHへの高速接続から生じ得る重篤な組織損傷を回避するために潅流₂連続的に25〜30 mmHgのにまでpHが1時間以内で生理学的なレベルに達するようにする。
19. 灌流液中の標準的な重炭酸塩の生理的濃度を達成するために回路にナトリウムまたは重炭酸カリウムを加える。反復的な血液ガスおよび電解質の管理下に慎重に注入する。
20. 定期的な静脈および動脈血液ガスおよびAST分析することで、潅流を監視します。静脈PO _2は、灌流の間、175 mmHgの上に残っている。血管の流量と圧力を監視し、一定の血管抵抗によって安定した灌流に注意してください。
21. 8時間までの安定した灌流システムを保管してください。 エクスビボで灌流期間の終わりに、クール20°Cまで灌流システムダウンや、肝臓から、回路のチューブを外した後、氷冷UW液で二重に肝臓を灌流液を洗い流す。再び無菌臓器袋に氷の上に置い肝臓に保管してください。

結果

以下では、前subnormothermic ex vivoでの灌流の開始まで45分ウォーム4時間冷虚血後にDCD-移植片5潅流実験の結果を提示する。

ex vivoでの肝灌流のための主な目標は、臓器に十分な酸素供給を確保することである。虚血は、このように灌流抵抗を増加、血管収縮を引き起こす。安定した圧力に一定の血管の流れを達成することは、適切な酸素化の良い指標である。 1〜2時間の誘導期間中に灌流液および器官は肝臓の血管抵抗をdeceases 33℃に温めている。 33℃の目標温度が達成されると、流量値は、6時間の灌流時間（ 図3A〜3D）の残りの部分に対して一定、ほぼ生理的範囲でのレベル。

同時に、臓器は代謝的にアクティブになります。 図4（a）は、静脈のpOを示しています<サブ> 2、酸素消費量マーカー。一定の高原への最初の2時間以内に静脈pO _2を下落。この代謝的に活性な状態では、肝臓は胆汁（ 図4B）の製造を開始します。透析器は、バランスのとれた電解質の恒常性（ 図4C-4D）を提供します。初期の高カリウム血症はすぐに平準化されている。オンラインAST測定は、肝細胞の損傷の監視として機能します。5ディスプレイの全体の灌流期間中のみの浅い直線ASTの上昇図 。灌流の6時間後のH＆E染色は、肝細胞壊死<無傷の小葉と正弦波構造（ 図6）で5％であることを示した。同じ時点でPAS染色は、冷保存DCD-移植片（ 図7）における疲れストレージと比較して、補充さセルラーグリコーゲン貯蔵を示しています。

図3潅流の流れと圧力た（n = 5、エラーバーは標準偏差を示す）。 （A、B）肝動脈（HA）が流れ、圧力：温暖化フェーズ中1〜2時間で、安定した圧力での流量が増加し、その後一定である。減少門脈静脈圧（C）を見ると、潅流の終わりに向かって、HAの流れの増加は、肝臓の自己調節反応である可能性があります。（C、D）の間に、HAの流れに対応したポータル静脈（PV）流量が増加温暖化の最初の2時間。圧力は比較的安定した状態を保つ。

図4の監視パラメータた（n = 5、エラーバーは標準偏差を示す）。 （A）酸素要求量と代謝活性のマーカーとして静脈のpO _2起因アクティブに蜂巣に温暖化の初期段階内で減少R代謝;それは、その後安定なままで代謝活性のマーカーとして（B）胆汁産生が灌流の第一および第二の時間の間、このようにして、30°Cの周囲温度で始まり、（C、D）透析装置は、電解質の恒常性を保証する。;初期の高カリウム血症はすぐにバランスが取れている。

図5 ASTた（n = 5、エラーバーは標準偏差を示す）ASTは、肝細胞損傷の高感度マーカーである。浅い増加は、ex vivo灌流の間に有意な傷害を示唆していない。

図6のH＆E染色（20X倍率）。暖かい虚血前（A）シャム肝臓試料、無傷のarchitecturと、代表的な一肝小葉E。（B）肝温虚血の45分後のサンプル、冷たい虚血の4時間、およびsubnormothermic灌流の6時間、小葉アーキテクチャが壊死することなく、無傷であり、唯一の最小限の細胞腫脹、正弦スペースが軽度と比較して拡張されている偽サンプル。

ディスカッション

DCD肝移植を模倣ブタモデルでは、安定した灌流パラメータ、最小限の肝細胞傷害、およびアクティブ肝代謝における細胞灌流液の結果とそのsubnormothermic肝灌流を示した。セットアップ当社subnormothermic灌流は肝細胞の恒常性および代謝を回復するために証明されています。グリコーゲン貯蔵が復元され、代謝物は廃棄される。

保存技術としてエクスビボ肝臓灌流は初めて臓器保存および移植前に中に移植片機能と傷害のマーカーを評価する機会を提供しています。グラフト灌流均質性の巨視的評価のほかに、流量値は、移植片の生存率およびそれが²⁹以前を受けていた虚血性傷害の程度の良い指標を提供する。酸素消費量および胆汁産生は代謝機能のマーカーである。 ASTのような肝臓酵素のレベルは、に使用することができる肝細胞損傷³⁰度やダイナミクスをSESS。この徹底したグラフト評価は、移植と非移植マージナル臓器間の確実な識別を可能にすることができる。

温度は、代謝ならびにATP及びグリコーゲン合成を可能にするのに十分であるため、私たちは、灌流システムに33℃のsubnormothermic温度を選んだ。同時に、それは、虚血性傷害に対するさらなる安全性を提供正常体温灌流設定と比較して減少した酸素要求量を提供する。一般的に、30℃以上の灌流温度が冷たい虚血性損傷を最小化し、十分な代謝活動^31を提供すること^が示されている。

他のグループとは対照的に洗浄し、濾過した赤血球と、私たちは灌流液として全血を使用していなかったが、normo浸透アルブミン溶液（ステーン）。血漿成分だけでなく、血小板や白血球を除外することにより、灌流溶液は、脱ですex vivoでの灌流の間、前炎症性シグナル伝達を最小限にするために署名した。

グラフト評価に加えて、数時間にわたって安定した灌流条件は、移植治療を可能にする。多数の分子は、実験条件³²の下で再灌流傷害を減弱することが示されている。しかし、ほとんどの治療計画は、まだ、臨床診療にその方法を作っていない。一つの理由は、低温貯蔵中にこれらの治療法を適用する機会がないことであると思われる。 エクスビボで灌流システム上の代謝的に活性な肝臓は、任意の種類の処置を適用するために最適である。この点で、活性酸素種のクッパー細胞活性または捕捉の減衰のような灌流状態を改善するための治療だけでなく、が考えられるだけでなく、遺伝子療法のような治療は、C型肝炎の再発に対して、 例えば 、移植片を調整する。他の潜在的な戦略は、ex vivo灌流中に脂肪変性に対する削減を含めることができます期間^33。

要約すると、ex vivoでの肝灌流は冷たい虚血性損傷を最小限にするために、肝移植前に限界肝臓移植を評価するために新たな戦略です。 ex vivoでの灌流の設定は移植前に移植片を修復し、条件するユニークな機会を提供します。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
circuit	Maquet (Hirrlingen, GER)	custom made	main reservoir (3 L, 3/8" outflow) portal reservoir (1.5 L, 1/4", outflow) centrifugal pump oxygenator lycocyte filter
Tubing (1/4" x 1/16")	Raumedic (Helmbrechts, GER)	MED7506
Tubing (3/8" x 3/32")	Raumedic (Helmbrechts, GER)	MED7536
Tubing connectors	Raumedic (Helmbrechts, GER)		various sizes
Dialysis filter, Optiflux F160NR	Fresenius Medical Care (Waltham, MA)	F160NR
STEEN solution	XVIVO (Göteborg, SWE)	19004	2 L
Dialysis acid concentrate A	Baxter (Mississauga, ON)	D12188M	45 ml
Amino acid, Travasol 10%	Baxter (Mississauga, ON)	JB6760	100 ml
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)	P2256	1.1 g
Heparin	Sandoz Canada Inc (Toronto, ON)	10750	40,000 iU
Calcium gluconate	Pharmaceutical Partners of Canada (Richmond Hill, ON)	C31110	10 mg
Fast acting insulin	various vendors		1,000 iU
Cefazoline	various vendors		1 g
Metronidazole	Baxter (Mississauga, ON)	JB3401	500 mg