プロテオームとトランスクリプトーム解析のための蜘蛛から毒の抽出と毒液腺Microdissections

要約

この記事では、プロテオミクス特性評価を実施し、1）順番に電気刺激を使用してクモから毒液を抽出するためのプロトコルを提供します2）毒液腺遺伝子発現を刺激し、そして3）毒の機能研究を行う。これは、遺伝子発現研究のための毒液腺microdissectionsの記述が続く。

要約

毒は、化学的に、典型的には多様な生理活性を有する多数のタンパク質およびペプチドを含む複合体の分泌物である。毒液タンパク質の機能的特徴付けは、細胞受容体に対する薬物リードまたはプローブの識別を含む重要な生物医学的用途を有する。スパイダーは毒の生物のほとんどの種が豊富クレードですが、ほんの数種の毒は、​​小さな動物から毒の微量を集めることに伴う困難のために部分的には、よく理解されている。本論文では、西部ブラックウィドウ（ ゴケグモ属のHesperusの ）上の手順を実証し、電気刺激を使用してクモから毒液を収集するためのプロトコルを提示します。収集された毒は、質量分析を経由して直接タンパク質同定、機能アッセイ、およびトランスクリプトーム研究のため毒遺伝子発現の刺激を含む様々な下流の解析に有用です。この技術は、そのイソプロトコルよりも有利である毒の一部として分泌されない細胞タンパク質から本物の毒成分を分離しない全体腺ホモジネート、後半から毒液。代表的な結果は、質量分析を使用して採取された試料からの既知の毒ペプチドの検出を実証する。毒収集手順は、結果は、これは配列レベルでの毒 - 発現されたタンパク質およびペプチドの特性をもたらすことを実証して、クモ毒腺を切開するためのプロトコルが続く。

概要

毒は主に捕食や防衛のために別の動物に注射し、動物の分泌物であり、また、生物医学関連性^1-3との重要な生物学的なアプリケーションを持っている。唯一の特定の動物は毒を合成するが、それは進化して独立しているため、その生産は、無脊椎動物（ 例えば 、刺胞動物、コーンカタツムリ、サソリ、クモ）および脊椎動物（ 例えば 、ヘビ、いくつかの魚や哺乳類）全体の分類学的に広まっている複数回^1,4 。毒の生化学的特徴付けは、典型的には、主に急速に構成毒素^1を送達するために注入された動物の循環系および神経系に作用するタンパク質およびペプチドの多様な、から構成されて示されている。有毒動物のごく一部には、ヒト、synanthropic分布⁵で特に種に脅威を与えることがあります。毒組成および機能活性の研究が重要な役割を果たしてきました機能的な脊椎動物の細胞成分（特に、神経細胞のイオンチャネル^）6の特性と基本的な細胞プロセスを解明する（ 例えば神経分泌^）7。また、選択毒ペプチドは、癌および疼痛^8,9の治療としてのそれらの使用を含む生物医学の文脈において有用な特性を有する、候補薬物リードおよび抗毒素の開発のために採掘されている。毒はまた従って、これらの危険な分泌物の収集は多くのユーティリティを持って、生態学と進化の研究^1,4,10,11において顕著な役割を果たしている。

そこに蜘蛛（クモ目秩序）の>4万説明し種があり、100以上のクモファミリーの1つを除くすべてが牙¹²で終端ペア毒腺を持っている。クモの高い種の多様性は、彼らが毒の生物の最大のクレードを表すことを示唆している。しかし、クモ毒の生化学的特徴付けは、Lを有しargely最も頻繁に人​​間毒物注入に関連した種の数が少ないに集中した。クモ毒の最近のプロテオミクスとトランスクリプトーム研究は、彼らは通常、多くのユニークなタンパク質およびペプチド^2,13,14を含んで示している。高スループットcDNAの配列決定および質量分析ペプチドフィンガープリントの進歩は著しく、これらの毒タンパク質¹⁵の発見を容易にした。それにもかかわらず、このような作業は、このような技術のためのクモから十分な毒および/ ​​または毒液腺の収集、および詳細なドキュメントで始まり、いくつかの¹⁶である。

本論文では、同様のサイズのクモに適用することができ、黒の未亡人のスパイダーからの毒と毒腺の収集のためのプロトコルを提示します。別々腺からの毒のコレクションは、他の細胞の機能を実行するタンパク質とは対照的に、毒液中に分泌されるタンパク質の同定を可能にする。黒い未亡人や他のL種atrodectus広く、時には多量の発汗、筋肉の収縮、高血圧、呼吸困難や斑状麻痺⁵が付属して、ヒトでの激しい痛みを引き起こす彼らの非常に神経毒性毒に起因最も危険なクモ、間にあるものとして認識されている。ここで紹介する毒収集プロトコルは、筋収縮と毒のリリースを引き出すために麻酔をかけ、スパイダーに電流を提供するために電気刺激を使用しています。毒滴が迅速にマイクロキャピラリーを用いて収集し、冷凍保存のためのチューブに分注される。プロトコルは危険な手順が含まれているので、それだけで十分な訓練を受けた個人によって行われるべきであると注意が重要なステップで付勢されている。収集された毒は、生理学的実験または機能アッセイ¹⁸のためのこのような構成分子²の特徴付け及び単離のような多くの用途を有し、そして毒遺伝子発現^11を刺激すること。プロトコルはDESCRで締めくくり毒特異的遺伝子のクローニングに有用な毒液腺解剖と保存のiptionは、の発現が異なるクモ^10,11における毒枯渇後の2-3日に起こることが示されている。

プロトコル

電気刺激装置の作製

1. コンセントと外部信号入力​​に外部フット·ペダルを接続する電気刺激装置の電源コードを接続します。
   注意：電気配線が適切に絶縁されなければならず、電流を供給露出した金属が触れてはいけません。保護のためにラテックスまたはニトリル手袋を着用してください。電源コードを取り付け、ワイヤーを取り付ける際に電気刺激電源スイッチがOFFの位置にあるべきである。
2. （極性スイッチが通常モードにあるとき）、電気刺激の赤い出力端子に正極を接続し、黒の出力端子に負極を接続する。注：各電極線は、ワニ口クリップで終端する必要があります。
3. 次の推奨初期設定に刺激を設定します。電圧= 7 V、毎秒周波数= 1パルス、ディレイ= 0ミリ秒、持続時間= 200ミリ、ツインパルスは=定期的な切り替え、モードスイッチ=オフ。
4. voltmeするワニ口クリップを取り付けることにより、電極のテスト出力TER正と負のテストリード。刺激の電源スイッチをオンにして、フットペダルと電流を供給。

固定化鉗子及びその他の材料の作製

1. 液体プラスチックコーティングにフェザー級鉗子の1の突起を浸し、コーティングを乾燥させるために4時間待つ。しっかりと結び目でエンドを結ぶことにより、綿の縫製糸の単層、およびセキュアな糸で、対向する突起の先端部の15ミリメートルを包む。
   注：スレッドは、プラスチックコーティング、現在遅延させるために絶縁を提供するが、導電性を促進適用食塩水を吸収するために使用される。
2. 鋭いハサミで鈍い皮下注射針の先端をカットし、サンドペーパーで口を滑らかに。チューブを介して真空廃棄物トラップ（ 例えば 、真空フィルターフラスコ）に針を取り付けます。
   注：ニードルは、水を離れて吸引し、逆流、および刺激電極によって作成された回路を完成するのに役立つであろう。針開口μstが目詰まりすることなく、真空ソリューションにまだ十分に大きな、クモに害を与えない程度に小さいこと（ 例えば 、25のGゲージ×1 1/2物質一覧を参照してください）。
3. 底の上部とスレッドコーティングされた突起上の鉗子のプラスチックコーティングされた突起を持つビューの解剖顕微鏡の視野の下で、磁気ベースまたは固定スタンド装置に固定ビニールで覆われた二股のクランプを使ってしっかりと閉じた位置に水平に位置フェザー級鉗子。
   注：二股クランプはクランプホルダによる磁気ベースに静止位置に維持されている（材料リストを参照してください）​​。ゴムバンドは、しっかりと一度導入クモの周りに閉じた位置にフェザー級鉗子を保つために追加の圧力を加えるために、次のクランプホルダーに、フェザー級鉗子の突起の周りに固定してもよい。
4. スレッドの上流に鉗子「ボトムのプロングに正極ワニ口クリップを取り付け、金属製の真空針を鈍ら負ワニ口クリップを取り付けます。
5. スレッドとワニ口クリップの間に鉗子のプロングに正のリードを配置し、鈍真空針に負のリードを配置することによって、電圧計を使用したテスト回路の電流。十分な電流が検出されたことを確認し、十分な電流が検出された場合に、リードを除去するためのプレスフットペダル。
6. 毒のコレクションのためのいくつかのマイクロキャピラリーチューブを準備します。ブンゼンバーナーの炎の上に水平に鉗子開催エンドを置く、手袋をはめた手で、そして滅菌金属鉗子でもう一方の端に一端で、単一のマイクロキャピラリーチューブを開催しています。静止位置にもう一方の端を保持しながら、細長い先端部を作成するために離れて炎からの金属鉗子でマイクロキャピラリーを引っ張る。
   注：マイクロキャピラリーが簡単に破断することができますように、保護メガネを着用してください。
7. シャーレに取り付けパテストリップ上に準備されたマイクロキャピラリーを休ま。マイクロキャピラリーは、解剖顕微鏡下で終了し、滅菌した金属鉗子で引っ張っ端にある小さな、ベベル開口部を作成調べます。
8. ラ滅菌0.5ミリリットルチューブのベル可変数。滅菌チューブ（ 例えば 、オートクレーブの脱イオン水5μl）を滅菌脱イオン水を加える。氷の上を閉じ、チューブと場所チューブ。
9. ビーカーに生理食塩液を調製し、オートクレーブ処理水と第二のビーカーを埋める。

鉗子でスパイダー3.固定化

1. 長い金属鉗子を用いてCO ₂チャンバー内に（材料リストを参照してください）バイアルを収集し、閉じたプラスチックからのCO ₂のタンクと転送クモをオンにします。
   注：黒い未亡人のスパイダーは、危険な毒を持っています。常にこのプロトコル中に手袋を着用してください。
2. 5〜10分間、または麻酔し、もはや静かに長い鉗子で突いたときに移動するまで、チャンバ内のクモを保つ。食塩水で鉗子にスレッドを湿らせるトラ​​ンスファーピペットを使用してください。
   注：黒い未亡人のためのCO ₂麻酔パラメータのガイドラインについては、スペイン広場とムーア¹⁹を参照してください。
3. CO ₂から麻酔をかけたクモを取得鈍い解剖鉗子や手袋をはめた手を使用して、その前方の足でそれを拾うことによってチャンバー。鉗子装置はフェザー級に麻酔をかけクモを移動します。独立したクローズドフェザー級鉗子の突起と突起の間に蜘蛛の頭胸部を配置し、突起がクモを確実にするために、シャット閉じることができるように所定の位置にしっかりと保持されているが押しつぶされていません。正極は一番下の突起に付着したままで、クモがスレッドコーティングされたプロング上に載っている、（クモ解剖するためのガイドのためのFoelix ^20を参照）を下方甲背側に配置され、甲羅の腹側がプラスチックコーティングに直面していることを確認してください。クモを取り扱う際は迅速に作業。
4. 蜘蛛の鋏角と牙がはっきりと見えるようになるまでの顕微鏡倍率、フォーカス、および光源を解剖調整します。

4.ヴェノムコレクション

1. シリンジnをひっくり返した第二鈍を用いて水溶液で真空及びスプレースパイダー鋏角をオンにするeedle。不純物を除去するために真空針で水を離れて吸引する。
2. クモ演壇に付着した負極を備えた真空針をタッチし、フットペダル一回以上のパルスを提供します。必要であれば真空は離れて逆流。
   注：クモの演壇は鋏角とendites（詳細なクモの解剖学のためのFoelix ^20を参照）との間に背側表面に鋏角する口の後部の内側にある。注：各パルスでは、クモの足契約および毒液が牙から現れる明確な液滴として表示されます。
3. 毒を集める（溶液がキャピラリーに吸い込まれる）水または緩衝液で0.5ミリリットルチューブにマイクロキャピラリー先端と転送キャピラリー先端で滴。
   注：血リンパ汚染や死につながる可能性が毛細血管でクモを穿刺避ける。また、紡糸口金からシルクや接着剤で毛細血管の汚染を避ける。
4. チューブ（収集先端と反対側の端部で）マイクロキャピラリーへのアダプタおよびdで転送シリンジを取り付けバックチューブにispense毒ソリューション。チューブを氷上に置く。
   注：近くの鋭利物容器に廃棄物の毛細血管廃棄してください。
5. クモに近いそのキャップと一緒に、オープンなプラスチックの収集バイアルを置きます。慎重に鈍鉗子かつ迅速近いキャップでバイアルを集めるにクモをスライド、もう一方の手で片手で保持鈍い解剖用ピンセットでクモの脚と慎重に開いているフェザー級鉗子プロングを把握する。終了したら、-80℃の冷凍庫内の次のクモや店舗毒-含むチューブに進みます。
   注：バックバイアルに鉗子からクモを移動するときは注意して運動を続ける。収集バイアルとキャップは、その迅速な転送のためのスパイダーに近くなっていることを確認しますと手袋を着用してください。

5.毒腺解剖

1. 毒採取後2対三日間、CO ₂チャンバー内でクモを麻酔（ステップ3.1を参照）。解剖顕微鏡の隣に液体窒素キャリアと場所を記入してください。
   注：WH液体窒素での作業途中で、目の保護と極低温の手袋を使用しています。
2. クリーンな解剖エリアとRNaseとDNAの混入を排除ソリューションで解剖鉗子。バッファー（ 例えば 、1X生理食塩水クエン酸ナトリウム（SSC）バッファ）解剖と解剖顕微鏡下に置かれた小さなペトリ皿を埋める。
3. 皿のペトリかつ迅速腹部から頭胸部を分離するために鉗子を使用するようにCO ₂室からクモを転送します。
4. ピンセットで解剖顕微鏡下で頭胸部を持ち、視野内に鋏角を配置。鋏角の横方向の側面を甲羅に入社キューティクルをカットする鉗子の第二対の鋭い端を使用してください。横方向に鉗子の第二の対を使用して、鋏角を持ち、静か毒腺が引き出されるまで、前後に引っ張る。
5. 鋏角とは別の腺cyrosafe 0.5ミリリットルチューブに転送（または残す必要に応じて、鋏角に取り付けられている）。クロを置く液体窒素中で編管。
   注：各解剖はこれ以上15分以上を取る必要があります。
6. 仕上げまで追加のクモで解剖を繰り返します。 -80℃の冷凍庫内に液体窒素から移送管。

結果

毒と毒腺解離の集合は、しばしば配列レベル^10,11,15で毒タンパク質およびペプチドを特徴付けるために実施される。収集された毒はまた、それらの機能的活性^18を決定するために、生理学的ア ​​ッセイにおいて使用され得る。毒のコレクションは、それによってRT-PCR ^10,11を介して、特定の毒素転写産物のクローニングを容易に毒腺遺伝子発現を刺激する。毒タンパク質の同定はまた^、15,21毒腺cDNAライブラリーから生成された配列データベース標準質量分析技術を統合することにより、ハイスループット様式で行うことができる。このような作業の例は、毒液腺その有効性を実証し、上記で詳述したプロトコルを使用して収集から開始して、 図1に示されている。

L.から収集毒Hesperusの成人女性をトリプシンで消化し ​​、溶液中に供したタンデム質量分析（MS / MS）をHPLC（高速液体クロマトグラフィー）を結ぶMuDPIT分析。ここMuDPIT分析はプロテオミクスコンソーシアムアリゾナ大学によって行った。 （スペクトルから推測された娘イオン）を検出するペプチドの質量及びそれらの解離フラグメントは、理論的にはL.から構築遺伝子発現ライブラリーから得られたcDNA配列の翻訳から予測されたペプチド配列と比較したHesperusの毒腺^21（腺切開プロトコルによって取得された、上述した）。この実験では、36のタンパク質は、99​​.9％の確率閾値で、すべての収集されたスペクトルから検出され、かつ少なくとも1つの検出されたペプチドを含有していた。検出されたタンパク質の一つはタンパク質配列（ 図1B）の35％をカバーする三排他的ペプチドに対応する、43の合計スペクトル（ 図1Aに示される模範スペクトル）によって支持されている。 collecteから翻訳検出されたタンパク質（ D cDNAは）L.からlatrodectinするトップのBLASTpヒットした図2e-46の電子スコア、およびこの実験で検出されるタンパク質とアミノ酸配列レベルでの株式80％の同一性を有するtredecimguttatus（GenBankアクセッション番号P49125.1）。また、α-ラトロトキシン低分子量タンパク質として知られているLatrodectinは、クロゴケグモの認識毒成分が提示プロトコルの有効性を検証し^{、22、23、}スパイダーある。毒から同定されたいくつかのタンパク質はBLASTヒットが検出されないれる配列に対応する。未知のタンパク質が、毒汚染物質を表し、またはので、それは、クモのために利用可能な限られたゲノムリソース、ならびにそれらのタンパク質のための制限された機能情報にそのような結果があるかどうかは不明である。それにもかかわらず、遺伝子またはタンパク質の発現は、それが本物の毒の成分であるかどうかを明らかにする必要があり、他の組織に比べて毒腺におけるこのような新規タンパク質の存在量を調べる分析する。

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図1：質量分析法を用いてクロゴケグモ毒から識別Latrodectinペプチド（A）代表スペクトル（43の1）LのMuDPIT分析のMS / MS部を介して検出されました。パートB.スペクトルに示す収集cDNA配列の予測された翻訳に割り当てられたHesperusの毒液は、上部に文字で、親ペプチド（CGEEDFGEEIVK）を断片化することによって製造され、水平軸上で検出された娘イオンの比（m / z）の質量電荷を示している娘イオンの質量に基づいて、ペプチド配列を示す。スペクトルの一部にAが割り当てられた（B）タンパク質配列は、赤、太字および下線付きテキストでパートAに示すスペクトルから、対応するシーケンスを示す、追加の赤色のテキスト（太字ではない）他の収集したSPで検出し、このタンパク質に別のペプチドを表し、ectra。タンパク質配列を解剖毒腺から得られたcDNA配列から翻訳される。

ディスカッション

毒は、生理学的反応性タンパク質、ペプチドおよび薬物発見のための用途を有する他の分子の重要な供給源、ならびに携帯用や生態研究^1-3の基本的な側面を表す。しかし、特に危険または小動物からの毒のコレクションは、困難な作業である。このプロトコルは、毒と毒腺が黒い未亡人のクモから採取することができる方法を示し、そして毒のMuDPIT分析と^21腺毒液からクローン化cDNA由来タンパク質データベースとの組み合わせでこのアプローチの成功が確認される。このプロトコルは黒い未亡人や中規模のスパイダーに適していますが、他の毒収集技術は^24、ピペット^などガラス内にそのような牙から毒の直接吸引などのより大きなmygalomorph（タランチュラ様）クモのために使用されてきた。この後者のアプローチを、しかし、aggressiされていない小さなサイズのスパイダーのためにうまく機能しませんVEの。

それはより多くのルーチン、一貫してより速くなるように、ここで説明毒収集プロトコルの一つの特に重要な側面は、収集プロセスの準備と最適化の初期段階である。プロトコルは当初、マスターするために挑戦されていますが、繰り返される裁判で、それが簡単かつ迅速になります。注意はまた、危険なクモの取り扱い、電流、細かい点ガラスマイクロキャピラリー、及び注射針の使用を含むすべての重要な位相で付勢されている。これは、マイクロキャピラリを整形する際にアイウェアとしてだけでなく、そのようなニトリル手袋、白衣、長ズボンと閉じた靴のような適切な個人用保護具を着用することが重要です。

毒コレクションに別の困難な局面は、収集された量は、Liとすることができるから、いずれかのクモ、特にゴケグモ属によって産生さ毒の少量であるせいぜい個体あたり1~2マイクロリットルにmited。そのようなタンパク質ゲルまたは機能的アッセイなどの下流のアプリケーションのために十分な毒を得ることは1チューブに複数の個人からの毒の組み合わせを必要とするかもしれない。このような場合には、毒は、同じ性別、個体発生段階の個体から組み合わされるべきであり、人口は、いくつかの毒^{25、26、intersexual}発達および地理的変動の認識を与えられた。クモも少ない量の腺の最近の枯渇を反映している可能性が個体間で生成さ毒の量でかなりの変動を示すことができる。したがって、それは彼らの最後の給餌後に毒数日を収集することをお勧めかもしれません。少し毒が解除されると、過大な電流が血リンパや死と毒の汚染につながる、キューティクルが破裂する恐れがありクモに適用しないでください。

クモSiと毒のサンプルの汚染LKまたはヒト源も無菌またはクリーン機器の使用により回避されるべきである。これらの課題にもかかわらず、純粋な毒のコレクション、生きているクモを残して、（他の細胞タンパク質から毒成分を分離しないでください）​​とクモを殺す腺ホモジネートから毒液を得る方法に好適である。これはサンプルを迅速にタンパク質の分解を防ぐために凍結されることを保証するためにも重要である。

毒の抽出、それによって毒腺に毒遺伝子の発現を刺激する、後続の毒産生を促進する。クモ毒枯渇を生き残るためには、このプロトコルができるのでしたがって、それらの腺は毒遺伝子の発現は、例えば^10,11をクローニングする転写物の遺伝子研究のために十分であると予想される時点で（クモを殺す）、数日後に解剖してもよい。いくつかの重要な注意事項も毒腺郭清に注意する必要があります。重点はラボを使用して配置する必要があり設備を導入ENTとRNAを分解RNaseを含まない試薬。したがって、RNaseおよびDNAの混入を排除するソリューションを鉗子やその他の非使い捨て機器や表面を拭くことをお勧めします。解離は、組織のRNAの完全性を確保するために可能な限り迅速かつ直接凍結として行われるべきである。彼らの頭胸部と腹部がすぐに分離した後、最終的に、解剖は、麻酔をかけスパイダーで実行する必要があります。

結論として、この記事では、クモ毒と毒腺を取得するために検証されたプロトコルを提供します。毒及び毒液腺およびトランスクリプトーム、プロテオームアプローチを用いて、それらのタンパク質およびペプチド成分の単離および特徴づけを可能にする。また、毒のサンプルは、その構成分子の生物医学的および薬理学的潜在性を決定する機能的アッセイの開始点を表すことができる。ほぼすべてのスパイダーは毒を生産し、幅広いダイバー個々の種によって合成毒成分をsityは毒分子の広大な多様性を示唆している^13をまだ発見されています。したがって、このプロトコルは、クモの毒に存在する生物学的に活性な分子の豊富な供給源を調査するためのツールを提供します。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nerve and muscle stimulator (electro-stimulator)	Grass Technologies	SD9	http://www.grasstechnologies.com/products/stimulators/stimsd9.html
Voltmeter	RadioShack	22-223	any generic voltmeter/multimeter can be substituted
Pointed Featherweight Forceps	Bioquip	4748
Plasti Dip	Performix		Available at Ace Hardware
25 G x 1½ in Precision Glide hypodermic syringe needle	BD Medical	305127
Vacuum filter flask 1 L	Nalgene	DS4101-1000	smaller flask sizes may also work
Buchner Two Piece funnel, 90 mm	Nalgene	4280-0900
5 μl Capillary Bores (Micro capillaries)	VWR	53508-375
Mounting putty strip	Loctite		Available at Ace Hardware
Fisherbrand General-Purpose Extra-Long Forceps Length: 11-13/16 in.	Fisher	10-316C
SSC Buffer, 20x (pH 7.0), Molecular Grade	Promega	V4261	can be made from stock chemicals (150 mM NaCl, 15 mM sodium citrate)
Eppendorf safe-lock tubes 0.5 ml tubes (cryogenic safe)	Eppendorf	22363611
Nalgene Dewar, 1 L, HDPE, Liquid nitrogen benchtop flask	Thermo Scientific	4150-1000
Rnase Away	VWR	53225-514
Ultra Fine Tweezers (dissecting forceps)	EMS	78310-0	similar high-quality fine point forceps can be substituted
Foot switch/pedal	Linemaster Switch Corp.	491-S
Two-pronged extension clamp, with vinyl covered sleeves, 8.5 inches	VWR	21570-007	similar models could be substituted
Clamp Holder	VWR	89084-746	similar models could be substituted, must accommodate diameter of extension clamp rod
Magnetic base (holds extension clamp via clamp holder)	VWR	300042-270	similar apparatus able to securely hold extension clamp in fixed position may be substituted
Plastic Collecting Vials (large/40 dram)	Bioquip	8940
Cotton sewing thread	Joann fabric and craft store	7245855	similar product could be substituted