共焦点顕微鏡による絶縁型肺胞マクロファージの抗真菌活性を評価する

要約

共焦点顕微鏡によって貪食されたアスペルギルス胞子の成長を制御するために単離したマウス肺胞マクロファージの能力を評価する方法。

要約

肺は、宿主細胞は日常的に微生物および微生物産物に曝露されるインターフェースである。肺胞マクロファージは、吸入真菌および他の微生物が発生した最初の行の貪食細胞である。マクロファージおよび他の免疫細胞が病原体認識受容体によってアスペルギルスモチーフを認識し、下流の炎症反応を開始する。食細胞NADPHオキシダーゼは、活性酸素中間体（ROIを）を生成し、宿主防御のために重要である。 NADPHオキシダーゼが重要ではあるが、好中球媒介宿主防御のための^1から3は 、マクロファージにおけるNADPHオキシダーゼの重要性は十分に定義されていない。本研究の目的は、A.に対する宿主防御を仲介するマクロファージにおけるNADPHオキシダーゼの特定の役割を描写することであったフミ 。私たちは、肺胞マクロファージにおけるNADPHオキシダーゼが貪食Aの成長を制御していることがわかっフミは ⁴胞子。ここでは、マウスαの能力を評価するための方法を記載貪食アスペルギルス胞子 （分生子）の成長を制御するためlveolarマクロファージ（AM）。肺胞マクロファージは、 インビボで染色し、10日後に気管支肺胞洗浄（BAL）マウスから単離される。マクロファージは、緑色蛍光タンパク質（GFP）を発現するA.を播種し、次いで、カバーガラス上に播種するフミ胞子 。特定の時間に、細胞を固定し、貪食された胞子を有する無傷マクロファージの数を、共焦点顕微鏡法によって評価される。

概要

肺胞マクロファージは、吸入微生物が発生した最初の行の貪食細胞である。マクロファージは、病原体認識受容体によってアスペルギルスモチーフを認識し摂取および吸入胞子（分生子）の成長を制限し、炎症反応を開始する。食細胞NADPHオキシダーゼは、スーパーオキシドアニオンおよび下流の活性酸素中間体（ROIを）への分子状酸素に変換します。慢性肉芽腫症（CGD）は、重度の細菌および真菌感染により、過度の炎症反応によって特徴づけられるNADPHオキシダーゼの遺伝性疾患である。

NADPHオキシダーゼが重要ではあるが、好中球媒介宿主防御のための^1から3は 、マクロファージにおけるNADPHオキシダーゼの重要性は十分に定義されていない。以前の研究では好中球が主に菌糸のステージ^5をターゲットに対し、肺胞マクロファージは、 アスペルギルス胞子を摂取し、殺すことが示されている。しかし、矛盾するresulがあったA.の成長を制御するマクロファージにおけるNADPHオキシダーゼの役割としてのts フミ胞子 ^6、7。

このメソッドの目的は、A.に対する宿主防御を仲介するマクロファージにおけるNADPHオキシダーゼの特定の役割を描写することであったフミ胞子 。私たちは、肺胞マクロファージにおけるNADPHオキシダーゼが貪食Aの成長を制御していることがわかっフミは ⁴胞子。最も密接に吸入菌類に対する宿主応答をモデル化するために、我々はすぐに犠牲を次の刺激されていないマウスから気管支肺胞洗浄により収穫肺胞マクロファージを使用していました。孤立した肺胞マクロファージの使用は、生体内でのアスペルギルスに対する防御他の免疫細胞（ 例えば 、好中球を募集）が存在しない場合に、その抗真菌活性に焦点を当てることができました。この方法では、肺胞マクロファージは、収穫後の操作の量を最小にするように収穫する前にインビボで染色した。

この議定書のもう一つの利点は、GFPを発現するAの使用でフミ株 。この菌は菌糸のステージを通じて生子段階からのGFPを発現し、さらに染色の必要がありません。さらに詳細な画像を得るために、我々は得られた画像から3次元構造の再構築を可能にし、共焦点顕微鏡を選びました。三次元再構成は、菌糸がマクロファージやを通じて周囲に成長しているのではなく、区別できるようになります。分生子はまた、細胞外に対する細胞内のように正確に区別することができる。

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プロトコル

本研究では、動物で実行されたすべての手順は、ロズウェルパークがん研究所で動物実験委員会によって承認され、すべての状態を遵守し、連邦政府及び保健規則の国立研究所れた。

1。 インビボマクロファージのラベリング

注：PHK26（iv）は、静脈内投与された場合、循環中および組織中の両方食細胞によって取り込まれる親油性染料である。 PKH26は、マクロファージの収穫後の操作量を最小限にするためにin vivo標識のために使用した。 PKH-26を安定して長期間にわたって肺胞マクロファージに蓄積するという利点を有する。行政だけ肺胞マクロファージを安定PKH26 ^8、9で標識したまま循環からすべての標識細胞の排除を可能にした後10日を待っています。 PKH26は、互換性の励起（551 nm）を照射（567 nm）の特性を持つ赤の蛍光色素であるローダミンまたはフィコエリス検出システムと。いずれの標識操作は、生存率の低下を含め、アーティファクトを導入することができます。我々は（NADPHオキシダーゼ欠損対例えば 、WT）異なるマウスの遺伝子型におけるマクロファージの標識に同じアプローチを使用するので、これらのアーチファクトの影響は均一になります。

1. PKH26の原液（エタノール中1×10 ^-3 M）メーカーが提供する希釈剤Cの1:5に希釈する。
2. 各マウス1/2ミリリットルのインスリンシリンジ（29 G×1/2 "）に希釈したPKH26の負荷を100μl。
3. 収穫するには、少なくとも10日前までに静脈内注射（尾静脈または眼窩のいずれか）によりマウスに投与する。

気管支肺胞洗浄による2。収穫肺胞マクロファージ（BAL）

実験に使用するマウスの数は変えることができる。刺激されていないマウスからの典型的な収率は1〜2×10 ⁵肺胞マクロファージの範囲であるが、この数は大幅に浅を変えることができこのようなマウスのサイズ、洗浄を行った人の経験、洗浄液や肺から引き出されたボリュームの点滴の数などの要因に編このプロトコルでは肺洗浄を繰り返した1mlの洗浄液と共に細胞収率を高めるために役立つ閉鎖胸腔を用いて行われる。

1. 滅菌溶液を維持するために、無菌状態を使用してアベルチン麻酔薬の致死量（12.5 mg）を腹腔内（IP）を投与することにより、マウスを安楽死させる。
2. 70％エタノールで徹底的にマウスをスプレーします。
3. 胸部を露出させた動物の頭蓋終わり（ 図1A）から肌を削除します。
   1. ただ、ダイヤフラムの下の皮膚の小さなカットを行います。
   2. カットに指を挿入し、離れて動物（ 図1A）の頭蓋端から肌を引き出します。
   3. 首（ 図1A）の腹側を拡張し、頭の上にわずかに押し上げます。
4. 胸郭を通して小さな穴をカット胸部の右側に肺を収縮させると、次のステップの間に、肺の可視化を可能にする。
5. 気管を見つけて、慎重に周囲の組織を離れて解剖。
   1. 湾曲したピンセットで唾液腺、胸骨舌骨筋および喉頭などを削除します。
   2. 慎重に湾曲したピンセットで持ち上げて、ハサミで基盤となる環状軟骨構造を明らかにし、気管（外膜）を覆う薄い組織を切り取る。
6. 気管にカテーテルを挿入します。
   1. 湾曲したピンセットを用いて、気管（背側に）背後に縫合糸を配置し、開口部を通って10cmの長さを引き出します。
   2. 輪状（軟骨の肥厚したリング）上に起動すると、慎重に気管が胸骨の後ろに消え気管停止まで22のGカテーテルを導く。
   3. しっかりとぴったりフィットするため、気管およびカテーテルの周りに縫合糸を結ぶ。カテーテルから針を外します。
7. 4方活栓を組み立てます。
   1. 埋めるオン6 mlのDPBS、1％FBSでシリンジ及び図1Bに示すように、4方コックに取り付けられる。
   2. 4方コック（ 図1B）に示される位置に空の6ミリリットルの注射器を取り付けます。
   3. カテーテル4方コック（ 図1B）上で開いているポートを接続します。気管からカテーテルを取り除くしないように注意してください。
8. 肺から洗浄液を収集します。
   注：研究者は、組織への損傷の可能性を最小限にする洗浄液の低いボリュームを使用することを選ぶことができる。それは、同じアプローチが一貫してすべてのマウスのグループに適用されることが重要である。
   1. 空のシリンジが閉じているので、ストップコックのハンドルを回して、 ゆっくりと肺を膨らませるために〜1ミリリットルのDPBS、1％FBSを注入します。ステップ2.4​​の穴のカットを通じて肺インフレを観察します。
   2. 肺をover​​inflateないように注意してください。
   3. フルシリンジが閉じているように、ストップコックのハンドルを回して、慎重にインフルエンザを撤回肺からのID。
   4. 肺はステップ1.4の穴のカットを通じて収縮を観察。カテーテルは、良いドローを得るために、わずかに前後に移動させる必要があります。気管内カテーテルを維持するために、特別な予防措置をとる。
   5. すべてのDPBS、1％FBSを肺から注入され、撤回されるまで繰り返します2.8.1-2.8.4 5-6Xを繰り返します。注：肺液の回収が注入される流体の100パーセントではありません。
9. を50mlコニカルチューブに洗浄液を持つ空のシリンジ。室温で細胞を維持する。
10. 室温で5分間、300×gで遠心分離して細胞をペレットにし、上清を捨てる。所望の場合、これは、サイトカイン分析のために保存することができる。
11. 10％FBSを1〜5ミリリットルRPMI1640中で細胞を再懸濁し、血球計数器でカウントされます。刺激されていないマウスでは、BALによって採取された細胞の> 95％が細胞学によって確認することができるマクロファージであることが期待される。

3。培養および収穫菌

> アスペルギルスフミがライフサイクルの全段階を通して、GFPを発現し、このプロトコルで使用される"：胞子、germlingsと菌糸この菌株は、博士のマーゴ·ムーア、サイモンフレーザー大学、バーナビー、BC州、カナダから提供された。

1. クロラムフェニコール（0.05グラム/ L）およびゲンタマイシン（0.5 g / L）とを有する斜面寒天サブローブレインハートインフュージョン（BHI）上にGFPを発現するアスペルギルス·フミガタス株の分生子板。
2. 緩く室温で7〜10日間頂いた暗闇の中でインキュベートする。
3. DPBS中0.01％のTween20を10mlで洗浄傾斜による収穫生子。軽く緩めstripetteで真菌をこすり。収率を高めるために傾斜を数回すすいでください。
4. 50ミリリットルコニカルに100μmのセルストレーナーを通して生子懸濁物を渡す。
5. 10分間400×gで遠心分離してペレット生子。
6. 50ミリリットルのDPBSに再懸濁分生子と血球計数器を用いてカウントします。
7. DPBSで二回洗浄し、希望concenに希釈するtration。

4。真菌チャレンジおよび共焦点顕微鏡

宿主防御におけるマクロファージNADPHオキシダーゼの役割を調査するために、貪食アスペルギルス胞子の成長を制御するための3つの遺伝子型のマウスからの単離された肺胞マクロファージの能力を評価した。本研究で用いた遺伝子型が含まれる。 / 1）は、野生型マウスは、2）NCF1 * / *マンガンマウス自然発生NCF1変異を有する（NCF1は彼らにNADPHオキシダーゼ欠損を残しP47の^phoxの 、食細胞NADPHオキシダーゼの必須コンポーネント）をコードし、3）NCF1 * NADPHオキシダーゼ活性は、単球/マクロファージ集団^10,11で再構成された*のMn +トランスジェニックマウス（MNは、ヒトCD68プロモーターの制御下で野生型NCF1を保有するトランスジーンを示す）。

共焦点顕微鏡は、存在のために、このアッセイに最適ですそして、スライド上の非貪食分生子の成長。共焦点顕微鏡は、Z軸内の個々の面の可視化を可能にし、周囲に成長しているのではなく、マクロファージ内部の菌との区別が可能になります。すべての共焦点画像を、63X油浸対物レンズを用いて取得される。 Zスタックは、2.5の電子ズーム倍率で取得されています。 Zスタックの厚さは、視野の上部と下部を見つけるためにDAPIおよび明視野画像を用いて決定される。 Zスタックは、〜1μmの厚さの個々のスライスを14から24ミクロンの範囲であった。マクロファージの定量化のために、1X電子ズームの単一スキャンは遺伝子型につき10視野で行った。無傷のマクロファージはそれぞれPKH26および膜および核のDAPI染色に基づいて同定した。分生子は、FITC発現と明視野像に基づいて同定した。

1. 無菌カバーグラス、プレートを準備します
   1. 生物学的安全キャビネットの下で、70％のエタノで22×22ミリメートルのカバーガラスを浸す5〜10分間リットル。
   2. 滅菌PBSでカバーグラスをすすぐ。
   3. 滅菌ピンセットを使用して、穏やかに無菌充填単独で6ウェルプレートの各ウェルの底に単一のカバースリップを置く。
2. シード〜1×10 ⁶個の収穫PKH26は、各カバースリップ上に300μlのRPMI 1640、10％FBSに懸濁し、肺胞マクロファージを標識した。正確な数は、収穫量に応じて変えることができる。
3. マクロファージは、一晩で5％CO _2、37℃でインキュベートすることにより接着させる。
4. 翌朝、〜1×10 ⁷ GFP発現Aを追加フミガーツス分生子を100μlの予め温めた（37℃）RPMI 1640、10％FBSに懸濁した。
5. 5％CO ₂で37℃のインキュベーターにプレートを返します。
6. 細胞を室温で2時間、最低固定または4℃で一晩されるべきである3,7、および14時間の修正セルの各ウェル（最終濃度1％ホルムアルデヒド）、2％ホルムアルデヒドの等容量を添加することによって。ための場所プレート一晩4℃での初期の時点。最終時点（14時間）の場合は、2時間室温で細胞を固定。
7. 固定後、静かにピンセットを用いてカバースリップを削除し、DPBSですすぐ。
8. 折り畳まれたキムワイプにカバースリップの端を配置することで余分な水分を取り除きます。
9. ガラス顕微鏡スライドにDAPIで6μlの蛍光封入剤を適用します。
10. スライドにカバーガラスの一端を置き、ゆっくりと封入剤に分解セル側にドロップします。メディアをマウントすると、拡散し、カバーグラスの下に均一な層を形成することになる。カバースリップ上に押す必要がない。
11. 明確なマニキュアでカバースリップの端をシールし、空気乾燥させ。
12. ストアは、共焦点顕微鏡によって分析することができる状態になるまで、室温で（遮光して）スライドボックススライドを用意しました。

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結果

刺激されていないマウスからBALによる肺胞マクロファージの収集は、細胞診に基づいて> 95％純粋な集団になります。 3と7時（ 図2）の時点では、真菌増殖の菌糸段階に先行し、遺伝子型間生子の貪食効率の比較を可能にします。遺伝子型は、組織浸潤性菌糸のステージ（ 図3）に貪食された分生子の転移を阻害する能力に関して比較することができる場合に14?...

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ディスカッション

一緒にin vivoで真菌のチャレンジでマクロファージの抗真菌活性のex vivo分析のためにこのアプローチを使用して、我々は以前に、マクロファージにおけるNADPHオキシダーゼはA.に対する防御において重要な役割を果たしていることが実証されフミ^4。孤立した肺胞マクロファージの使用は、生体内でのアスペルギルスに対する防御他の免疫細胞（ 例?...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling	Sigma	PKH26GL-1KT
2,2,2 Tribromoethanol	Sigma	T48402	Used to make AvertinAnesthetic
2-methyl-2-butanol	Sigma	A-1685	Used to make AvertinAnesthetic
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (without calcium and magnesium)	Corning	21-031-CV
NH4Cl	Sigma	A0171	Used to make ACK red cell lysis buffer
KHCO3	Sigma	P91444	Used to make ACK red cell lysis buffer
EDTA	Sigma	E6758	Used to make ACK red cell lysis buffer
22 G x 1.00 inch i.v. catheter	BD	381523	Insyte Autoguard Winged
Insulin syringes
6 ml Syringes
4-way stopcock	Fisher Scientific	50-700-077
Suture thread
50 ml conical centrifuge tubes
gauze sponges (4 inch square)
RPMI 1640 with L-glutamine	Corning	10-040-CV
Fetal Bovine Serum	Hyclone	SH30396.03	heat inactivated
Hema 3 Stain Set	Fisher Scientific	22-122-911
Cytoseal 60	Thermo Scientific	8310-4
Sabouraud Brain Heart Infusion Agar with Chloramphenicol and Gentamicin Slants	BD	297252
Aspergillus fumigatous strain expressing green fluorescent protein			provided by Dr Margo Moore, Simon Fraser University, Burnaby, BC, Canada
100 μm Cell strainers	BD Falcon	64753-00
Scissors
Forceps
Biological Safety Cabinet Class II
Sorval ST40 Centrifuge with swing bucket rotor
Leica DM1000 light microscope
Hemocytometer
Cytospin 2 centrifuge	Thermo Scientific
Cell culture incubator			37 °C, 5%  CO2
22 x 22 mm micro cover glass	VWR	48366-227	glass coverslips
6-well Cell culture plates	Corning	3506
10% Neutral Buffered Formalin	VWR	BDH0502-1LP
Vectashield mounting medium with DAPI	Vector Laboratories	H-1200
Leica TCS SP2 system with a laser point scanner			Mounted on DMIRE2 fluorescence microscope