の使用<em&gt;生体外</em&gt;チャンドラーループ装置は、改質ポリマー血液導管の生体適合性を評価するための

要約

Blood exposure to polymeric blood conduits initiates the foreign body reaction that has been implicated in clinical complications. Here, the Chandler Loop Apparatus, an experimental tool mimicking blood perfusion through these conduits, is described. Appendage of recombinant CD47 results in decreased evidence of the foreign body reaction on these conduits.

要約

合成表面は、身体に導入されたときに異物反応が起こる。これは、術後の合併症につながる、血液タンパク質の吸着および血小板の付着およびそれに続く活性化、単球/マクロファージの接着性、および炎症性細胞シグナル伝達事象によって特徴付けられる。チャンドラーループ装置は、研究者が、血液の大量のは、ポリマーの導管を介して灌流されているときに発生する分子や細胞間相互作用を研究することを可能にする実験的なシステムです。そのために、この装置は、各種高分子表面修飾の抗炎症特性の評価を可能にex vivoでのモデルとして使用されてきた。当研究室では、共有結合した組換えCD47と光活性化化学により修正された血液導管は、ポリマー表面に生体適合性を付与することができることが示されている。ポリマー表面にCD47を付加することは、ポリマーの血液導管の有効性を促進するための有効な手段である可能性があります。彼女のEINはCD47修正されたと制御導管と血液の相互作用を調べるために臨床的に関連性ポリマー血液導管および ex vivo実験モデルとしてチャンドラーループの使用に組換えCD47を追加するために使用される光活性化化学を詳細に方法論である。

概要

そのような人工心肺や腎臓透析などの多くの臨床手順は、ポリマー血液導管の使用を必要とし、多くの場合、術後の合併症¹に関連している。血液で灌流すると、これらのポリマーは血液タンパク質および血小板、単球/マクロファージ付着の吸着、その結果、異物反応（FBR）を誘発（illicit）、および、術後の合併症に寄与する全てが炎症誘発性サイトカインの放出/またはデバイスの故障^2,3。したがって、この問題に対処するための戦略は、生体材料研究の重要かつ継続的な地域のまま。研究者らは、生体活性または生体不活性分子を^4-6と表面を接触させること、血液を変更することによってこの問題に対処しようと試みてきた。私たちの研究室での研究は、FBRを軽減し、これらの材料の有効性を高めるための戦略として、高分子生体材料への組換えCD47（recCD47）を追加に焦点を当てている。 CD47は遍在的に発現transmembrです細胞^7-10やショーを表現する際の免疫回避の既知の役割、付与「自己」ステータスを持つメタンタンパク質がポリマー表面^11-13に付加するとき、生体適合性を付与するに約束します。シグナル調節タンパク質α（SIRPα）、CD47のための同族受容体、および膜貫通タンパク質のファミリーを含有免疫受容体チロシンベースの阻害モチーフ（ITIM）のメンバーは、骨髄起源¹⁴の細胞に発現しています。私たちは、以前にCD47は、SIRPαを介した細胞シグナリングを介して、 インビトロ 、 エキソビボでポリウレタン（PU）、およびポリ塩化ビニル（PVC）に対する免疫応答を下方制御、およびin vivoモデル ^11-13 にすることを実証した。

私たちの研究の中心は化学的に反応性のチオール基が共有結合多官能性ポリマー（PDT-BZでチューブを反応させることによって、ポリマーのチューブに追加された、本明細書に記載され、比較的小説光活性化化学で2 -ピリジルジチオ（PDT）から成る）Phは、光反応性ベンゾフェノン（BzPh）とカルボキシ変性ポリアリルアミン^11-13。トリス（2 -カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩^（TCEP）11と共有結合的に付加さPDT基を還元すると、続いて治療的部分と反応させることができるチオール化表面が得られる。本明細書に詳述以前^12,13、さらなるC末端のポリ-リジン尾部^12,13の添加によって修飾されrecCD47は、スルホスクシンイミジル-4 - [N -maleimidomethyl]シクロヘキサン-1カルボキシレート（スルホ-SMCC）と反応させて1時間チューブとrecCD47 ¹¹との間のモノスルフィド結合形成を可能にする、チオール反応性基を生成する。 CD47官能化された表面の抗炎症能力がもともと血栓凝固¹⁵ のin vitroモデルとして1958年に記載されたヒト全血、チャンドラーループ装置を使用して、 元VIV O、試験した。この装置は、に依存していますチューブ部分的に空気を充填システムとチューブ¹⁵に血液を循環させる回転モータを閉じた。この実験モデルは、修飾および非修飾表面の際に血液暴露の影響、ならびに血液の細胞の生理時にこれらの表面修飾の効果を検討する機会を提供する。

recCD47は、この光活性化化学を用いてポリマー表面の多様に付加することができ、その抗炎症能力は、ポリマー表面^11,12の上に血液灌流を模倣する臨床的に関連エキソビボモデルを利用することによって評価することができる。 recCD47で修飾された臨床グレードの血液導管は、装置内のヒト血液にさらされたときに、未修飾ポリマーと比較して有意に低い血小板および炎症細胞の付着を示す。この変形プロセスのステップバイステップの説明は、以下に詳述する。

プロトコル

recCD47 1.変更高分子表面

注：プロトコルは、図1に概略的に要約されているが、 図1Aは、チオール反応性ポリマー表面の生成を示す図1Bは、チオール反応性recCD47の生成を示す。

1. 1日目
   1. 滅菌水中PDT-BzPhの溶液（1 mg / ml）で、および重炭酸カリウム（KHCO _3）（0.7 mg / mlで）を調製。 4℃（ 光から保護する ）で一晩撹拌する。
2. 2日目
   1. （回転車輪の周りにフィットするのに十分な長）長さ40cmの片に、ポリマーチューブをカットします。
   2. シェーカー上またはチャンドラーループ装置上で室温で90分間hexacylpyridiniumの0.1％水溶液中でチューブを浸す。 90分浸した後、滅菌水で3回でチューブを洗浄します。
   3. （15％水性リン酸二水素カリウムを添加することにより、1日目からPDT-BzPhの溶液を酸性KH ₂ PO _4）。曇ったミセル溶液を形成し、PDT-BzPhの1ml当たり50μlのKH ₂ PO _4を追加します。
   4. シェーカー上又は装置上で室温で40分間、酸性化PDT-BzPh溶液中にチューブを浸す。
   5. 一度：希酢酸（千1）で管を洗浄します。
   6. 60分の合計時間のための紫外線照射にチューブを公開します。チューブを回転させて¼表面領域全体を照射するために15分毎に回す。
   7. シェーカー上又は装置上で室温で20分間、20 mg / mlの炭酸水素カリウム（KHCO _3）の溶液中にチューブを浸す。
   8. 滅菌水で4℃で滅菌水の3倍と店舗との管を洗浄します。
3. 3日目
   1. （：ドラフト内で実行します。注意 ）200μlのジメチルホルムアミド（DMF）中に5mgのスルホSMCCを溶かす。
   2. recCD47のポリリジン溶液をステップ1から0.1 mg / mlの中で調製スルホSMCC溶液50μlを追加し、ROで60分間攪拌オム温度。
   3. 60分攪拌中に、ドガはダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（DPBS）を無菌で、取っておく。
   4. 浄化スルホ-SMCCは、製造業者の説明書に従って7K分子量カットオフスピン脱塩カラムを使用してrecCD47を反応させた。最終的なフロースルー（高品質のチオール反応recCD47）を収集し、コートDPBSでチューブの内部に必要な容量まで希釈する。
   5. 無菌で2日目からのチューブを洗浄し、DPBS 3倍を脱気。
   6. 以下で2​​分間、脱気DPBS中の20 mg / mlのとトリス（2 - カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（TCEP）の溶液をチューブの表面修飾反応する。無菌脱気DPBS 4倍で管を洗浄します。
   7. チューブにスルホSMCC反応recCD47を追加し、シェーカー上または装置上で4℃で一晩インキュベートする。

修飾された表面上のrecCD47 0002イムノアッセイ定量

1. 3日目ウィットから定量化するように変更さのチューブをすすぐ時間DPBS 3倍。店舗チューブは4℃で、DPBSで定量化のために使用されていません。
2. 重複チューブサンプルを作成し、96ウェルプレートのウェル中の生検パンチを配置し4mmの生検パンチを使用する。
3. 検出抗体で処理されていない未修正のチューブサンプルからなるネガティブコントロールを準備します。検出抗体で処理された未修正のチューブサンプルからなる抗体コントロールを準備します。検出抗体で処理された修飾されたチューブ試験サンプルを調製する。
4. シェーカー上で室温で60分間、DPBS中の0.4％ウシ血清アルブミン（BSA）でブロック·サンプル。
5. 、吸引BSAをブロッキングした後、トリス緩衝生理食塩水を加えた1％のTween-20（TBST）シェーカー上で3倍、10分ごとに洗い流してください。
6. 免疫アッセイのための製造業者の推奨希釈率に応じて、0.4％BSA中での抗体の使用希釈を準備します。ヒトCD47抗体B6H12-FITC 1に希釈する：0.4％BSA中100。
7. 適切なウェルに抗体希釈液200μlを追加します。 Incubaわずか0.4％BSAを含むTEネガティブコントロール。 （ 光から保護する ）シェーカー上で60分間室温でインキュベートする。
8. TBSTで3回、シェーカー上で10分間ずつで洗い流してください。最後TBSTリンスを吸引し、チューブのサンプルウェルに200μlのDPBSを追加。
9. 最終的なフロースルー、高品質なチオール反応性の組換えCD47をある収集し、コートDPBSでチューブの内部に必要な容量まで希釈する。
10. FITC励起（485 nm）を発光（538 nm）の設定で、マイクロプレートリーダーを用いて、FITCシグナル強度をお読みください。
11. 計算recCD47は、自己蛍光および非特異的抗体対照試料からの結合を占め、標準値に基づいて、ポリマー表面に結合した。

3チャンドラーループ装置プロトコル

採血プロトコル前ヒト血液サンプルの収集の開始にインフォームドコンセントの書類の治験審査委員会（IRB）の承認を受けてください。情報を入手rmedヒト血液ドナーの同意。
注：装置の説明図が図2に示されている。

1. 約1/2車輪が水没している直径になるまで蒸留水で水浴を埋める。 10％の漂白剤溶液を作るために、水浴に十分な漂白剤を追加します。 37℃に水浴を設定し、温度が平衡化させる。
2. 金属アダプタ（ 図1Bに示されている）、非修飾および修飾チューブチューブを収集し、 図1Cに示すように、装置のホイールの周りに組み立てる。チューブが所定の位置に金属製のアダプタを備えている車輪の周りにぴったりとフィットしていることを確認してください。
3. クエン酸塩、または他の抗凝固剤の2ミリリットルを予め充填したバイアル中、IRBが承認したプロトコルを使用して、30ミリリットルの血液サンプルを入手し、検体が収集された後、凝固防止するために、転倒混和。
4. チューブ内のいくつかの空気を残して、金属バルブとシリンジを使用して、各チューブへの血液の約10ミリリットルを追加します。バルブキャップとrを固定します3時間otate。
5. 10％の漂白剤溶液で処理された廃棄物のビーカーに血液を排出（または施設の方針によって必要とされるような）。
6. 静かに、血液の痕跡をすべて削除するDPBSで配管内部を洗浄します。フロースルー廃棄物のビーカー内を収集します。制度的方針に基づき、血液廃棄してください。
7. 装置および任意の血液の10％漂白剤溶液を用いて、接触面または施設のポリシーに応じて駆除。
8. 蛍光顕微鏡または走査型電子顕微鏡のための処理サンプルは、下記のように。

4。蛍光顕微鏡および細胞計数

1. 4％パラホルムアルデヒド（PFA）溶液（ 注意：ドラフト内で実行します ）を準備します。
2. 4℃で一晩4％PFA溶液中でチューブをインキュベートする。
3. 一晩インキュベートした後、4％PFAを削除し、DPBSで非常に優しくフィルムをすすぐ。
4. 染色のために内腔面を露出するセクションにチューブをカットします。
5. 染み室温で30分間、4 '、6 -ジアミジノ-2 -フェニルインドール（DAPI）でメディアを装着する数滴のチューブ部（ 光から保護 ）。染色した後、バックグラウンドDAPIシグナルを減らすためにDPBSで非常に優しくチューブをすすいでください。
6. 200X倍率の下で見ると9盲目的選択されたフィールド内のセルの数をカウントするためにDAPIフィルタとデジタルカメラを装備した蛍光顕微鏡を用いた画像。
7. レコードのセルは、視野当たりのカウントし、結果の統計的有意性を決定するために、適切な統計分析を行う。

5。走査型電子顕微鏡

1. 2％グルタルアルデヒド溶液（ 注意：ドラフト内で実行します ）を準備します。
2. 4℃で一晩、2％グルタルアルデヒド溶液中でチューブをインキュベートする。
3. 一晩のインキュベーションの後、静かにDPBSでチューブ3回すすいでください。
4. 四酸化オスミウムの1％溶液を準備します（ 注意：重度吸入の危険性！ ）ドラフト内で使用してください。
5. 室温で15分間、四酸化オスミウムの1％溶液中でチューブをインキュベートする。
6. 静かにDPBSでチューブ3回すすいでください。
7. エタノール濃度のシリーズ（25％、50％、75％、95％、および100％エタノール）を調製。
8. エタノール濃度の一連のインキュベーションによりチューブを脱水。 25％、50％、75％、20分ごとに、95％エタノール中でインキュベートする。 30分間、100％エタノール中でインキュベートする。
9. 臨界点は、すべての水分を除去するために45分間CO ₂を有するチューブを乾燥させる。
10. 銀ペーストまたはグラファイトで試料スタブ上のマウントチューブセクション。
11. 金 - パラジウムの12.5 nmのとコートチューブセクション。
12. 走査型電子顕微鏡で調べます。

結果

SMCCを用いて、チオール反応recCD47のポリリジンと一緒にPDT-BzPhおよびTCEPを使用することにより、チオール反応性高分子表面の生成は、ポリマー表面にrecCD47の取り付けが可能になります。修正処理は、 図1に概略的にまとめられている。この変更処理の利便性タンパク質は、アミン含有リジンのような十分な化学的反応基で修飾することができると仮定すると、それは多くの異な?...

ディスカッション

（ 図1に要約する）光活性化化学は、光活性化PDT-BzPhをするPDT-BzPhの付着およびそれに続くUV照射を容易にするために十分な炭化水素を有する実質的に任意のポリマー表面の改質を可能にする。反応性チオール基を有するポリマー表面を官能することは興味のある検証可能な分子の範囲のその後の取り付けを可能にします。私たちの特定の研究において、本発明者らは、組換えCD47 ...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
16% Paraformaldehyde (PFA)	Thermo Scientific	58906	Caution! Use in fume hood
25% Glutaraldehyde	VWR	AAA17876-AP	Caution! Use in fume hood
2-pyridyldithio,benzophenone (PDT-BzPH)	Synthesized in lab	N/A
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	A3059-100G
Citrate	Sigma	S5770-50ML
Digital Camera	Leica	DC500	Out of production
Dimethylformamide (DMF)	Sigma	270547-100ML	Caution! Use in fume hood
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS)	Gibco/Life Technologies	14190-136
Fluorescent Microscope	Nikon	TE300
Glacial Acetic Acid	Fisher Scientific	A38-212	Caution! Use in fume hood
Human CD47 (B6H12) – FITC Antibody	Santa Cruz Biotechnology	SC-12730
Osmium Tetroxide	Acros Organics	197450050	Caution! Use in fume hood
Potassium Bicarbonate (KHCO3)	Sigma	237205-100G
Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4)	Sigma	P5655-100G
PVC Tubing (Cardiovascular Procedure Kit)	Terumo Cardiovascular Systems	60050	Most clinical-grade tubing will work
Scanning Electron Microscope	JEOL	JSM-T330A
Sodium Chloride (NaCl)	Fisher Scientific	BP358-212
Microplate Reader	Molecular Devices	Spectramax Gemini EM
Sulfo-SMCC	Sigma	M6035-10MG	Moisture Sensitive!
tris (2-carboxyethyl) phosphine (TCEP-HCl)	Thermo Scientific	20491
Tween-20	Bio-Rad	170-6531
Vectashield with DAPI	Fisher Scientific	H-1200	Light sensitive!
Zeba Spin Desalt Columns – 7 K MWCO	Thermo Scientific	89891