酸化ストレスに赤/近赤外光療法の波長および強度の範囲の効果の評価のための手法<em&gt;インビトロ</em

要約

Non-coherent Xenon light was passed through narrow-band interference and neutral density filters to deliver light of varying wavelength and intensity to cultured cells. This protocol was used to assess the effects of red/near-infrared light therapy on production of reactive species in vitro: no effects were observed using the tested parameters.

要約

レーザーまたは発光ダイオード（LED）によって送達赤/近赤外光療法（R / NIR-LT）は、おそらく酸化ストレスを減少させることによって、in vivoでの中枢神経系損傷の範囲内の機能的および形態学的転帰を改善する。しかし、酸化的ストレスに対するR / NIR-LTの効果は波長や照射強度に応じて変化することが示されている。治療パラメータを比較した研究は、スループットインビトロ最適化研究において高適し複数の波長または強度を提供し、商業的に入手可能なデバイスが存在しないこと、に起因する欠けている。このプロトコルは、与えられた損傷モデルに必要な治療用量を最適化するための波長および強度の範囲で光を送達するための技術が記載されている。我々は、波長および強度のパラメータを容易に変更することができた光を送達する方法は、活性酸素種を減少させるためのR / NIR-LTの最適用量の決定を容易にすることができるという仮説を立てin vitroで（ROS）。

非コヒーレントキセノン光は、光の各波長（440、550、670及び810nmの中心波長）とフルエンス（8.5×10 ^{-3 -1×10} 3.8 J / cm ²程度） ^を送達するために狭帯域干渉フィルターを通して濾過し培養細胞へ。装置から出力された光は、各波長の光の治療に関連する、同じ量子的用量を放出するように較正した。グルタミン酸は、DCFH-DAとH ₂ O ₂感受性蛍光色素を使用して、光で処理した細胞を強調に反応種が検出された。

我々は成功し、CNS損傷のモデルとしてグルタミン酸に曝露された培養細胞に、生理的におよび治療に関連する波長および強度の範囲で光を配信。現在の研究で使用したR / NIR-LTのフルエンスは、培養細胞によって生成されたROSに影響を及ぼさなかったが、光送達の方法は、他のシステム経験にも適用可能であるemsのは、単離されたミトコンドリアまたはそれ以上の生理学的に関連する器官型スライス培養モデルを含む、酸化的代謝のアウトカム指標の範囲への影響を評価するために使用することができる。

概要

活性酸素種（ROS）は、シグナル伝達経路および神経保護¹のものを含む細胞代謝の正常な反応の範囲のために必要とされる。内因性の抗酸化機構がROSの産生を制御することができないしかし、細胞が酸化ストレス^2,3に屈することができる。 CNSへの傷害後、ROS及び酸化ストレスの存在下での関連する増加は、損傷^4,5の進行において重要な役割を果たしていると考えられている。評価されている酸化ストレスを減衰させるための戦略の大規模な数にもかかわらず、神経外傷⁶以下の臨床使用においてROS産生と関連した酸化ストレスを減衰させるには完全に有効な、臨床的に関連する抗酸化戦略は現在のところ存在しない。そのため酸化ストレスの減衰が治療的介入⁷のための重要な目標である。

改善が続くるR / NIR-LTは、傷害、おそらく酸化ストレスを減少させることによって噴門梗塞サイズ、糖尿病時の腎臓および肝臓の合併症、網膜変性、CNS損傷および脳卒中⁸の減少を含む、広範囲の疾患において報告されている。 CNS損傷に特に関連して、670nmの光の効果の前臨床試験は、網膜変性^9-11、脊髄損傷^12、ニューロン死¹³のモデルにおいて良好な効果を示した。臨床試験は、乾燥加齢黄斑変性症のために実施し、ストローク¹⁴のために、現在進行中でされてきた、しかし、これらの試験の結果はおそらく効果的な治療パラメータ^15を採用する障害のため、有望な表示されません。このように、R / NIR-LTが広く、管理が容易な、非侵襲的で比較的安価な治療にもかかわらず、神経外傷の通常の臨床診療の一部として採用されていない。臨床翻訳への障壁は、CLの欠如、早期の標準化された効果的な治療プロトコル^16,17の作用と不在の仕組みを理解していた。現在の光療法に関する文献は、照射源（LEDやレーザ）に対する治療パラメータの変動の過多を明らかにし、照射の波長（ 例えば 、630、670、780、810、830、880、904nm）、総投与量（ジュール/単位面積）、持続時間（露光時間）、タイミング（前または後の傷害）、配信の治療頻度及びモード（パルスまたは連続^）8。研究間の治療パラメータの変動は、比較を困難にし、有効性¹⁶に関して懐疑的な見方に貢献してきました。

従って、R / NIR-LTの最適化が明らかに複数の変数を比較するために必要なハイスループットスクリーニング機構を提供することができる細胞培養系で、必要とされる。しかしWA上に十分な柔軟性と制御を提供することができ、いくつかの市販の照明システムがあるvelengthおよび強度は、このような最適化実験を行う。市販のLEDデバイスは、一般に、強度だけではなく変化し得る異なるメーカーからの複数のLED素子を用いた研究者らは、その結果、複数の波長または強度を、提供することができ、また、発光波長のスペクトルではない。我々は、狭帯域干渉フィルターを通して濾過し、広帯域キセノン光源を用いて光の波長およびフルエンスの範囲を生成し、R / NIR-LTのパラメータの近くに、正確な制御を可能にすることによって、この問題に対処している。

これは、処置の治療用量は、R / NIR-LTの場合、シトクロムcオキシダーゼ ^（COX）18であると仮定され、photoacceptor（発色団）と相互作用する光子の数によって定義されることに留意することが重要である。配信光子エネルギーは、波長に応じて変化する。異なる波長におけるエネルギーの等しい用量を意味するであろうコム光子の異なる数の珍重。したがって、装置から出射された光は、試験されるべき選択された波長の各々についての光子の数と同じ数を放出するように較正した。我々は、in vitroでの細胞への波長および強度の範囲でR / NIR-LTを送達するために用いることができるシステムを開発したが施さ細胞におけるROS産生に対する配信R / NIR-LTの効果を測定する能力を実証しているグルタミン酸ストレス。

プロトコル

1.光学的較正：光出力を測定する

1. 光送達装置を調製するために、適切な電源に広帯域光源（ 例えば 、キセノン又はタングステンランプ）を接続する。光の平行ビームを生成する光源の前にコリメートレンズを配置します。光ビームからの熱の大部分を除去するために液体の熱フィルタを通して光を通過させる。用途に応じて、光のより柔軟な送達を提供する液体光ガイドの入口開口部上にコリメートされたビームの焦点を合わせる（ 例えば 、インキュベーター内に）。
2. 液体ライトガイドの他端側に、第2コリメートレンズと、干渉および中性密度フィルタ用のホルダーを配置する。この配置は必要な波長帯と強度の光の均等に照射スポットを生成することを確認してください。
   注：光ガイドと試料面の端部との距離が依存して変化する必要があるかもしれ点灯しますが、ライトガイド増加の端からの距離が、光強度が減少することを覚えなければなりません領域。本研究では、この距離は14センチメートルで均等に96ウェルプレートに3×3のウェル領域を照明ビーム断面を生成する。
3. ランプと関連する光学部品からの迷光が試料に到達できないことを確認してください。
4. 液体熱フィルタ用のウォータークーラーの電源を入れ、フィルターのジャケットを通る水の交換があることを確認。ランプ電源をオンにして、安定させるために広帯域光源のために少なくとも5分間待ちます。注：水冷却器の使用は、装置の過熱を防止するために必要とされる。
5. 照明の所望の波長帯を生成するために（通常、中心波長、ピーク透過率及び半値（FWHM）帯域幅全幅によって記述）狭帯域干渉フィルタを選択する。注：現在の研究で使用した狭帯域干渉フィルタは4であった42ナノメートル、550ナノメートル、671 nmおよび810 nmの。
6. 標本は、処理中に置かれるべき面でランプの光を測定します。製造業者の説明書に従って適正ソフトウェアを使用して、適切な分光放射計に接続された較正された放射照度プローブ（コサインコレクタ）を使用して光を測定する。
7. 所望の出力が得られるまでの光の強度を調整するために減光フィルタを使用する。注：本研究では、各干渉フィルタを通過した光の強度は、4つの治療波長帯の各々で同じ量子的出力を与えるように調整される。ランプ出力を変更することがありますようにそれは、定期的にキャリブレーションを確認することが重要です。
   注：装置のセットアップ後、細胞を照射することができる状態にある図1現在の研究で使用される光伝送装置の図である。

光送達装置。イラストの図1の画像は、光動力源、ハウジング、コリメートレンズ、水フィルター、入口開口部は、液体ライトガイド、第2コリメートレンズ、フィルターホルダー、処理フレームとマットブラックカードとキセノンランプである。狭帯域波長および強度フィルタが示されていないことに注意してください。

2.細胞調製

1. 記載R / NIR-LT配信方法は、任意の細胞型またはin vitroモデル系で適用することができる。細胞培養のような以下の説明は、培養褐色細胞腫（PC12）、ミュラー（RMC1）及び一次混合網膜細胞への十分に確立された技術を用いて、一般的なものである。
2. 光線処理および酸化ストレスアッセイのための細胞播種の前に、培養物は、T75のトロボの活用の適切な補助剤（ 例えば 、FBS、抗生物質）を含有するそれぞれの増殖培地中で細胞を不死化70〜80％コンフルエントになるまでKS。
3. 例えば 、試験される細胞型に適した方法を使用して、T75フラスコから不死化細胞を剥離。、トリプシン。 96ウェルアッセイプレートを、1時間のために10μg/ mlのポリ-L-リジンで被覆アッセイプレートのウェル（ 例えば 、PC12細胞）またはのための10μg/ mlのポリ-L-リジンでの細胞の播種に進む前に、必要に応じて10μgのとO / Nインキュベートし1H / mlのラミニン（ 例えば 、混合した網膜細胞）。
4. 遠心分離し、細胞のような適切な収集する（ 例えば 。、RMC1細胞用218×gでPC12細胞または10分間405×gで3分）、適切な細胞培養培地の8ミリリットルで上清と再懸濁を削除します。
5. 混合した網膜細胞を使用する場合は、確立された手順¹⁹に従って、酵素消化（パパイン）によるP0-5新生児ラットの子から準備
6. 血球計を使用して、0.4％（w / v）のトリパンブルー色素を除いた生存細胞の数を数える。
7. 細胞密度のSUCを調整細胞は、培養中の24または48時間後に約70〜80％コンフルエントになる時間。 （PC12細胞のための播種密度はRMC1細胞については、2.5×10 ⁵生存細胞/ mlで、混合網膜細胞を、8×10 ⁵生存細胞/ mlで、4.0×10 ⁵生存細胞/ mlである）。透明または黒色96ウェルプレート（それぞれH ₂ O ₂またはDCFH-DA分析のために使用される）のいずれかにセルを追加した後、適切な増殖培地100μlに、プレートを37℃で平坦な表面の上に座ってすることができ、5 ％CO ₂細胞接着を可能にするために、少なくとも24時間（または任意の条件は、特定の細胞型に適している）。
8. 適切な96ウェルトレイ内の増殖培地で培養細胞彼らは70〜80％コンフルエント（PC12とRMC1細胞について24時間、混合網膜細胞のために48時間）になるまで。

3.細胞にグルタミン酸ストレッサーを追加する

1. 適切なフルグローにおける0-10mMのL-グルタミン酸モノナトリウム塩の水和物ストレッサー濃度を準備第培地。
2. 細胞から培地を除去し、静かにPBS（PC12）またはHBSS（RMC1および混合網膜細胞）で細胞を3回洗浄する。洗浄後、100μl/ウェルの総容積にグルタミン酸含有培地を追加します。

光処理のまず投与量

1. 直ちにグルタミン酸または任意のストレッサーを添加すると、準備された光送達装置の下に配置することによって、所望の波長および強度の光治療に細胞をさらす。投与されている波長に応じて減光フィルタの確立組み合わせを使用して光ビームの量子的出力を変更してください。
   注：現在の実験では^{、37°C ​​の}ヒートパッド96ウェルプレートを休止することによって温度を維持するために3分間光治療に細胞をさらす。必要に応じて処理時間を変化させてもよい。
   1. 96 WEL内の隣接するウェルに光反射を防止するために、細胞の下にマットブラックカードを置きますLトレイは、他の治療パラメータに指定された。
2. 治療は、時間のより長い長さのために所望される場合、細胞培養培地のpHを維持するか、理想的には、CO ₂ CO ₂ 5％に調整濃度、または最適な条件下でインキュベーター内装置および処理プレートを配置し、25mMのHepes緩衝液を追加特定の細胞型のために。
3. 光処理の終了後、水平な面に細胞を置き、24時間37℃、5％CO _2（または細胞型のための最適なあらゆる条件）でインキュベートする。
   注：上記のように必要に応じて、R / NIR-LTの追加の投与量は、投与することができる。

ROSの光処理と検出5.最終剤

1. 光治療の最終ラウンドを実行する前に、試薬はROSの検出に使用する準備。 50mMのクエン酸緩衝液（pH6.0）、トリトンX100、およびH ₂ O ₂検出試薬加工を準備溶液（1：2：10mMのH ₂ O ₂検出試薬原液の97比; 10 U / mlの西洋ワサビペルオキシダーゼ、50mMのクエン酸ナトリウム（pH6.0）中）。適切なメディアで100μMの最終濃度でDCFH-DAを準備します。
   注：PC12細胞についてのDCFH-DA試薬RPMI培地中で、RMC1細胞のためのDCFH-DA試薬は、DMEM培地である。市販の検出試薬は、特定のROS差動感度を有しており、試薬は、個々の用途のために必要な情報を提供するように慎重に選択されるべきであることに留意されたい。
2. ステップ4.1-4.1.2で説明したように、細胞に光治療を管理します。細胞が光の所望のフルエンス/波長で治療を受けていることを確認してください。
3. 直ちにグルタミン酸含有培地を除去し、適当な緩衝溶液で2回洗浄し、光処置後（PC12細胞のために、PBSを使用し、RMC1細胞について、HBSSを用いている）。次のように細胞上のROSアッセイを実行します。
   1. H ₂ O ₂ のアッセイ：各ウェルに50mMのクエン酸緩衝液（pH 6.0）の45μlを添加し、5μlのトリトンX100。穏やかに30秒間、オービタルシェーカー上で細胞を振って15分間CO _2を 37℃でインキュベートし、5％。 H ₂ O ₂の検出作業溶液50μlを加え、室温で30分間インキュベートする。 530nmの励起波長および480nmの発光波長でプレートリーダーを用いて蛍光を測定する。
   2. DCFアッセイ：各ウェルにDCFH-DAの100μM溶液100μlを添加し、37℃で30分間インキュベートし、5％CO _2。 100μMDCFH-DAを含む培地を除去し、（上記のように）を2回適当な緩衝液で洗浄する。各ウェルに緩衝液90μlのと10μlのトリトンX100を加え、穏やかに37℃で15分間のインキュベーションの前に30秒間のオービタルシェーカー上振る。 480nmでの励起波長および発光ヴァヴェルでプレートリーダーを使用してDCF由来の蛍光を測定する530nmののength。
   3. エクスプレスROSタンパク質1mgを計算するために標準曲線を用いて、製造者の指示に従ってタンパク質濃度を定量するための比色キットを使用して、ウェル内に残っている細胞のタンパク質濃度に相対値。

結果

670nmの波長で照射される光の出力は、以前に、生体内 （0.3 J / cm ^2）を20 で有益であることが示さ670nmの光の量を包含するフルエンスの範囲で細胞を照射するために減光フィルタを用いて較正した。光源の前に減光フィルタの数が増加するにつれて、強度（W / m ^2）が少ない光がターゲット領域に通過させる、減少した。表1は、波長フィルターを取り付けた光源か?...

ディスカッション

我々が正常にR / NIR-LT インビトロの最適化の研究のためのメカニズムを提供するための正確かつ較正された送達システムを適応している。 R / NIR-LTの波長および強度のパラメータは、このシステムを使用して、正確かつ効率的に操作されることが可能である。我々は、ROSは、試験した細胞型において、送達波長および用量で減少しなかったが、細胞の光治療は、細胞死をもたらさなかっ...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
OxiSelect Intracellular ROS Assay Kit (Green Fluorescence)	Cell Biolabs	STA-342
Amplex UltraRed Reagent	Molecular Probes	A36006
300 Watt Xenon Arc Lamp	Newport Corporation	6258	Very intense light source, do not look directly into the lamp. Ensure there is sufficient cooling to the lamp whilst it is switched on
USB4000-FL Fluorescence Spectrometer	Ocean Optics
CC-3-UV Cosine Corrector for Emission Collection	Ocean Optics
200μm diameter quartz fibre optic	Ocean Optics
SpectraSuite Spectroscopy Platform	Ocean Optics
2300 EnSpire Multimode Plate Reader	Perkin Elmer
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23225
Triton X-100	Sigma-Aldrich	9002-93-1	Acute toxicity, wear gloves when handling.
L-Glutamic acid monosodium salt hydrate	Sigma-Aldrich	142-47-2 (anhydrous)
Pheochromocytoma rat adrenal medulla (PC12) cells	American Type Culture Collection	CRL-2522
Roswell Park Memorial Institute (RPMI1640) Media	Gibco	11875-119
Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin	Gibco	10082-147	Warm to 37 °C in water bath before use
Horse Serum, New Zealand origin	Gibco	16050-122	Warm to 37 °C in water bath before use
GlutaMAX Supplement	Gibco	35050-061	Warm to 37 °C in water bath before use
100 mM Sodium Pyruvate	Gibco	11360-070	Warm to 37 °C in water bath before use
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140-122	Warm to 37 °C in water bath before use
100X MEM Non-Essential Amino Acids Solution	Gibco	11140-050	Warm to 37 °C in water bath before use
Retinal Muller (rMC1) cells	University of California, San Diego
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	11965-118	Warm to 37 °C in water bath before use
75 cm2 Flasks	BD Biosciences	B4-BE-353136
Poly-L-lysine hydrobromide	Sigma-Aldrich	25988-63-0	Aliquot and store at -20 °C
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)	Gibco	14025-134	Warm to 37 °C in water bath before use
Phosphate-Buffered Saline (PBS)	Gibco	10010-049	Warm to 37 °C in water bath before use
Laminin Mouse Protein, Natural	Gibco	23017-015	Aliquot and store at -20 °C
1X Neurobasal Medium	Gibco	21103-049	Warm to 37 °C in water bath before use
Trypan Blue Solution, 0.4%	Gibco	15250-061
165U Papain	Worthington
L-Cysteine	Sigma-Aldrich	W326305
Corning 96 well plates, clear bottom, black	Corning	CLS3603-48EA
Costar Clear Polystyrene 96-Well Plates Untreated; Well shape: Round; Sterile.	Costar	07-200-103
Seesaw Rocker	Standard lab epuipment
Centrifuge	Standard lab epuipment
Neutral Density Filter Paper (0.3)	THORLABS
442 nm Bandpass Filter	THORLABS	FL441.6-10
550 nm Bandpass Filter	THORLABS	FB550-10
670 nm Bandpass Filter	THORLABS	FB670-10
810 nm Bandpass Filter	THORLABS	FB810-10e
Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.1)	THORLABS	NE01B
Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.2)	THORLABS	NE02B
Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.3)	THORLABS	NE03B
Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.5)	THORLABS	NE05B
Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.6)	THORLABS	NE06B
Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (1.0)	THORLABS	NE10B