覚醒ラットにおける口腔内味物質投与の間に高速スキャンサイクリックボルタンメトリーと迅速ドーパミンダイナミクスの検討

要約

Rapid fluctuations in extracellular dopamine (DA) mediate both reward processing and motivated behavior in mammals. This manuscript describes the combined use of fast scan cyclic voltammetry (FSCV) and intra-oral tastant administration to determine how tastants alter rapid dopamine release in awake, freely moving rats.

要約

Rapid, phasic dopamine (DA) release in the mammalian brain plays a critical role in reward processing, reinforcement learning, and motivational control. Fast scan cyclic voltammetry (FSCV) is an electrochemical technique with high spatial and temporal (sub-second) resolution that has been utilized to examine phasic DA release in several types of preparations. In vitro experiments in single-cells and brain slices and in vivo experiments in anesthetized rodents have been used to identify mechanisms that mediate dopamine release and uptake under normal conditions and in disease models. Over the last 20 years, in vivo FSCV experiments in awake, freely moving rodents have also provided insight of dopaminergic mechanisms in reward processing and reward learning. One major advantage of the awake, freely moving preparation is the ability to examine rapid DA fluctuations that are time-locked to specific behavioral events or to reward or cue presentation. However, one limitation of combined behavior and voltammetry experiments is the difficulty of dissociating DA effects that are specific to primary rewarding or aversive stimuli from co-occurring DA fluctuations that mediate reward-directed or other motor behaviors. Here, we describe a combined method using in vivo FSCV and intra-oral infusion in an awake rat to directly investigate DA responses to oral tastants. In these experiments, oral tastants are infused directly to the palate of the rat – bypassing reward-directed behavior and voluntary drinking behavior – allowing for direct examination of DA responses to tastant stimuli.

概要

Phasic DA release plays an important role in mediating reward-directed behavior ^[1-3]. However, isolating and studying how a primary reward alters phasic DA release is often complicated by co-occurring behavioral or cognitive processes that are also capable of altering phasic DA release - such as decision making processes or reward-directed motor behavior to acquire the reward. In the current work, we isolate phasic DA responses to tastants through the use of in vivo fast-scan cyclic voltammetry (FSCV) combined with tastant delivery through intraoral cannulae. This technique bypasses choice and action and allows us to examine extracellular DA release during direct infusion of a tastant to the palate of a rat.

FSCV is an electrochemical technique with high temporal and spatial resolution, permitting measurements of DA release in a discrete local area (approximately 100 µm) on a sub-second scale (10 Hz resolution). The combination of intra-oral delivery and FSCV provides the advantage of observing rapid, 'real-time' DA responses to a tastant, which cannot be examined using conventional microdialysis methods. Furthermore, phasic DA release in response to either rewards or reward-associated cues occurs at concentrations between 20-100 nM, which is above the 10-20 nM detection threshold for FSCV ^[4]. The high spatial resolution of FSCV also permits recording from sub-regions of small brain areas, such as the nucleus accumbens core (NAc). Thus, FSCV combined with intraoral infusions of tastants is an ideal model for studying how tastants or other stimuli alter phasic DA release in an awake, behaving animals. Indeed, these techniques have permitted experiments investigating how rewarding and aversive tastants alter extracellular DA release ^[5].

Over the last decade, FSCV analyses have been successfully combined with intravenous drug delivery ^[6] and rat self-administration paradigms ^{[7, 8]} to identify the role of phasic DA mechanisms in drug addiction models. In addition, combined intraoral delivery with FSCV has been used to examine how tastant cues paired with cocaine availability modulate phasic DA release and behavioral responses that reflect emotional affect ^[3]. This combined intraoral and FSCV methodology can also be powerfully utilized to examine phasic DA responses to flavorants, such as menthol and oral sweeteners, that are added to cigarettes and dissolvable tobacco products ^[9-11]. Although many of the flavorants added to tobacco products are appetitive ^[9-11], it is unknown if these flavorants increase phasic DA release in a manner consistent with a rewarding hedonic valence. Indeed, flavorants added to cigarettes and to dissolvable tobacco products may have direct effects on the DA reward system and may act through dopaminergic mechanisms to influence the rewarding valence of cigarettes and other tobacco products. Thus, intraoral delivery combined with FSCV can provide new understanding on how flavorants modulate rapid DA release. The use of combined intra-oral and in vivo FSCV methodology, and the data obtained from such studies, can also facilitate future studies to determine how flavorants and nicotine interact to alter DA signaling and to potentially modulate nicotine reinforcement. Further, the data gained from such studies can be used to inform regulatory decisions about tobacco product flavorants.

プロトコル

すべての実験は、実験動物の管理と使用に関する健康（NIH）ガイドの国立研究所に従って行ったとエール大学施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって承認されました。

1）手術前の準備

1. 経口溶液の調製
   1. 10％のスクロースおよび脱イオン水（pH7.4）で0.005％のL-メントールのソリューションを作成します。室温で、密閉容器にこれらのソリューションを保存し、劣化を防ぐために、2週間毎にリメイク。
2. 電極較正溶液
   1. キャリブレーションの前に、任意の時点でのトリス緩衝液（pH7.4）にしてください。解決策は、12.0 mMトリス塩酸、140mMのNaClを、3.25のKCl、1.20 mMの塩化カルシウム、1.25ミリモルのNaH 2 PO 4、1.20のMgCl _2、および2.00 mMののNa ₂ SO ₄で構成されています。
   2. 0.1Mの過塩素酸中で、10 mMのドーパミン（塩酸ドーパミンDA）の原液を作成します。過塩素酸は、ドーパミンの酸化を防ぐことができますE。 -20℃で、このストック溶液を保存し、6ヶ月までのために使用します。一度だけ各アリコートを使用するために保管するDA原液のいくつかのアリコートを作成します。
   3. 10 mMのDAストックから、1μM、500 nMで、250 nMの、125 nMで、62.5 nMであり、31.25 nMの濃度にトリス緩衝液中の溶液を希釈します。
   4. pH値の校正のために、7.2、7.3、7.5、および7.6のpHを有するトリス緩衝液の溶液を準備します。これは、in vivo実験中に発生する可能性があるのpHシフトを模倣するソリューションを提供します。
3. 電極の製造
   1. 真空吸引によって、ホウケイ酸ガラスキャピラリー（直径0.4ミリメートルの内側長さ10ミリメートル、外径0.6ミリメートル）にT-650炭素繊維（7μmの直径）を吸引します。
   2. 垂直電極の引き手に炭素繊維を充填したガラスキャピラリーを置きます。最初のパラメータについては、55.0にヒーターを設定し、磁石をオフにします。ヒーター磁気両方の設定がFRを変化しかし、さらなる最適化が必要であり得ます研究室へのOMラボ。
      注：それは簡単にマイクロマニピュレーターに収まることができるとラット脳内に少なくとも6.9ミリメートル硬膜下に挿入されるように、電極は（テーパーを含む）は、少なくとも5.5センチメートル長さでなければなりません。電極が短すぎると、側坐核の腹の部分からの記録が達成されません。一方、全電極の長さ6.5 cmを越えてはいけませんそれ以外の場合は、マイクロマニピュレーターに収まらないほど長くなります。
   3. それはガラスの端を超えて75〜100ミクロンを拡張するように、光学顕微鏡を用いて、露出した炭素繊維をカット。電極は、その後の記録中に、最小限のノイズを生成するガラス電極と炭素繊維との間に非常にタイトな、かろうじて認識できる、シールを、持っていることを確認します。シール不良の指標であるガラスやシールが緩んでいるかの顕著な亀裂が存在する場合、電極を捨てます。詳細な手順は、[12]と[13]を参照してください。
4. マイクに電極を組み立てますromanipulator
   1. ワイヤの長さの半分に沿って絶縁ワイヤに直接銀塗料の薄い層を適用するために小さなブラシを使用されている30Gワイヤ、​​3を得ます。直ちに銀塗料を塗布した後、炭素繊維の物理的および電気的接続を提供するために、電極の上部の穴にワイヤーを挿入。顕微鏡下で、銀線が炭素繊維と接触することを確認してください。
   2. 熱収縮を使用してマイクロマニピュレータに銀線と電極を固定します。
   3. 電極表面をきれいにし、ドーパミンの後に感度を高めるために、少なくとも10分間、精製し、イソプロピルアルコール（IPA）中に調製した炭素繊維電極を置きます。 IPAに浸漬した後、IPAを除去するために、水道水で炭素繊維をすすぎます。
5. 参照電極の製造
   1. 、約6mmのAg / AgのClでメッシュ（単独の7mm銀線6ミリメートルメッシュ0.4ミリメートルの直径）を有する13ミリメートル銀線を取りダウンの約半分の元の長さに銀部を切断し、金のピンにワイヤの銀部をはんだ付けします。
   2. ピンのはんだの上にエポキシ樹脂を適用します。
   3. のAg / AgのClを各ディップの間に30分間空気乾燥期間と、5％のポリテトラフルオロエチレンとパーフルオロ-3,6-ジオキサ-4-メチル7octeneスルホン酸5回の共重合体に端をメッシュ浸し。
   4. コー​​ティングされたAg / AgのClを空気乾燥のO / Nにメッシュを許可します。
   5. 1時間120ºCのオーブンで硬化します。

2）複合口腔内手術および頭蓋内カニューレ挿入手術（約75分）

1. 経口カテーテル製造
   1. 経口カテーテルを作成し、少なくとも10日手術前に、エチレンオキシド滅菌によって滅菌します。
   2. 長さ6cmのセグメントにPE 100チューブをカットします。
   3. はんだごてを用いて、PEチューブの一方の端部を溶融し、すぐにPEチューブを冷却するために、固体表面に押し付け。結果は、作成する必要がありますPE管の一方の端部にある小さな、平らなディスクとフランジすべきではありません。針（18 G）を使用するか、このディスクの中心に穴を作成するためにピンを押してください。
   4. PEチューブのもう一方の端には、ぴったりのチューブに18 G針の鈍端を挿入します。
   5. 標準の用紙穴パンチャーを使用して、ポリテトラフルオロエチレンのワッシャーを作成するために、ポリテトラフルオロエチレンシートのいくつかの円形片（3.18ミリメートルの厚さ、直径6mm）をパンチ。
   6. ワッシャの中央に穴を作成します。 PE管に取り付けられた針を取るとワッシャを通し、それを完全に押し込みます。針が通過したら、それは洗濯機にぴったりになるように、PE管の底部にワッシャーをスライドさせます。
2. 口腔外科
   1. （滅菌前台座下2.5mmまでトリミング）手術器具、カニューレ、および参照電極を滅菌した後に、ケタミン（100mg / kg）およびキシラジン（10mg / kg）の腹腔内注射でラットを麻酔。
      1. AFター5分、麻酔のレベルを評価するために、有害刺激試験（足や尾のピンチ）を適用します。被験者が（呼吸や心拍​​数の増加、応答を尻込み）侵害刺激試験への物理的な反応を示した場合は、元の投与量の10％〜15％のケタミンブーストを投与し、上記の侵害刺激プロトコルを繰り返します。
   2. ラットが完全に麻酔をかけていると侵害刺激試験に対する反応を示していない後、耳の後ろから約2mmの目から、ラットの毛を剃るために動物バリカンを使用しています。そして、手術中の体温を維持するために薄い水循環加熱パッド上にラットを置きます。目の潤滑剤を塗布します。前の任意の切開を実行する前口腔内カニューレを挿入する腹腔内注射により、非ステロイド性抗炎症薬（NSAID）薬、カルプロフェン（5ミリグラム/キログラム）を投与します。すべての回で無菌技術を使用してください。
   3. 肌をきれいにするために、70％エタノールに続いてベタジンを適用します。 3回繰り返します。
   4. ナンプラーその背中にラットを、CE、および滅菌綿棒を使用して、口を開いてください。最初の上部臼歯を探します。
   5. 直後の針が終了するまで頬と第一上部臼歯との間の組織に針を挿入し、耳に正中。
   6. ピアースは、PEチューブまで皮膚を通して針が皮膚から出て、アクセス可能です。
   7. （カニューレ自体ではなく針で把持）カニューレを引き上げ、カテーテルが所定の位置に残るように臼歯にポリテトラフルオロエチレン洗浄器を固定します。
      注：台形形状にワッシャーを切断し、頬に面した平坦な側面と大臼歯に対してそれを保護するには、この手順は簡単になります。
   8. 別のポリテトラフルオロエチレンワッシャを取り、プラスチックチューブダウン、および切開当接し、露出した針の上にスライドさせます。
   9. ワッシャーが上にスライドしないようにポリテトラフルオロエチレンワッシャを確保するために、三角形の「フラグ」を作成する滅菌テープを使用します。洗浄を確保ラットの皮膚や滅菌テープに対してえー。
   10. チューブ2-4 CMは、ラットの頭の上に露出されるように露出されたカテーテルをカット。
   11. 繰り返しは、口の反対側のために2.2.10を介して2.2.1を繰り返します。
3. ボルタンメトリーのための頭蓋内手​​術
   1. （3サイクルの繰り返しで行い、70％エタノールのスクラブに続いてベタジンスクラブ）定位フレームにおけるラットを置き、2段階のスクラブを使用して、動物の頭皮をきれいに。
   2. 頭皮組織の15×15ミリメートルのセクションを離れてカットする滅菌ニードルノーズピンセットと手術用はさみを使用してください。
   3. 静かに滅菌綿棒のアプリケーターを用いて、頭蓋骨の表面を清掃してください。さらに3％の過酸化水素の2〜3滴を適用することにより、頭蓋骨をきれい。
   4. 基準エレクト用ネジのその後の挿入のための頭蓋骨の3小（直径1mm）穴、ガイドカニューレのための1の穴、刺激電極のための1の穴と、1ホールを作るために定位ドリルを使用して、乗りました。
   5. 側坐核コア中の記録のために、1.2ミリメートルの前部とブレグマへ横1.4ミリメートルでガイドカニューレを配置します。プラスチックベースが頭蓋骨と同じ高さになるまで、カニューレ装置を下げます。
   6. ガイドカニューレに半球反対で滅菌参照電極を配置します。約2mmの硬膜下の基準を下げます。
   7. 5.2ミリメートルの後部とブレグマに1.0ミリメートル、横に刺激電極を配置し、腹側被蓋野（VTA）を標的とするために硬膜下の8.0ミリメートルを下げました。
   8. 頭蓋骨にネジを固定するために滅菌小さな手術用ドライバーを使用します。次に、電極を刺激する、参照電極を挿入し、カニューレを導きます。最後に、cranioplasticセメントを使用してすべてのコンポーネントを固定します。
   9. 術後ケアの最初の48時間については、皮下注射（5ミリグラム/ kg）をすることにより、非ステロイド性抗炎症薬（NSAID）、カルプロフェンを投与します。前voltamを実行する完全な外科的回復のために、少なくとも1週間を許可メトリ記録。
      1. 術後のケアの間、毎日の水で洗い流し経口カテーテル。咀嚼や食事に動物を助けるために2日間水に飽和食品を提供します。 （5ミリグラム/ kgで防腐剤の局所投与、流体の投与を含む、およびまたはNSAIDカルプロフェン投与）（これは、軽度の感染症や脱水症状に）痛みのストレスの潜在的な徴候について毎日モニタリングを提供し、必要に応じて適切な介入を提供します。

覚醒中3）ボルタンメトリーレコーディング、自由に動くラット

1. 電極を下げ、DAのトレーニングセットを取得します。
   1. 実験の日に、水200μlを注入し、口腔顔面の応答を観察することにより、口腔カニューレの開通性を確認する（ラットが水を試飲していることを確認するため）。
   2. 双極刺激電極cannuに（ヘッドステージ上の）刺激電極を挿入することにより、ラットにFSCVのヘッドステージを取り付けラ（ラット上）。このように、ヘッドステージ（小型化、電流 - 電圧変換器）は、双極刺激電極に直接接続します。
   3. カニューレ装置からダミーカニューレを取り外し、カニューレに50％ヘパリン溶液2滴を適用します。そして静かに続いて、実験中に挿入される炭素繊維電極が壊れます発生した可能性のある血餅またはグリア瘢痕を、クリアする（以前に削除されたダミーカニューレがいることを少し長い）ダミーカニューレを挿入します。頭蓋骨下の血栓3〜4ミリメートル（記録部位より少なくとも2ミリメートル）をクリアするために使用されるカニューレを拡張します。
   4. ガイドカニューレに、電極を、マイクロマニピュレーターを挿入し、「ロック」位置にオメガリングを配置します。
   5. 適切なピンにヘッドステージから基準電極線を接続します。そして、ヘッドステージ上の適切な配線にマイクロマニピュレーターから作用電極線を接続します。
   6. ELECを下げ頭蓋骨の下約4〜4.5ミリメートルにtrode。
   7. 三角波（400 V /秒、-0.4 1.3 V）を適用するためにポテンショスタットを使用してください。その後の実験記録は10 Hzに波形アプリケーション周波数を変更する、少なくとも10分間、60 Hzで電極に波形を適用します。
      注：60Hzの波形塗布工程は、安定した炭素繊維の表面を生成し、電気的なドリフトを防止するために役立ちます
   8. DA放出およびpHの異なる濃度を呼び起こすために、全ての2ミリ秒/位相のパルス幅で様々な周波数（10〜60ヘルツ）パルス（10〜30パルス）と電流（50〜150μA）を使用して、VTAに電気刺激を適用します移行します。 DA放出の少なくとも5つの異なる濃度および異なるpH 5シフトを取得します。水疱リロード[14]を可能にするために、刺激の間 - （3分間の最小2）を待ちます。
      注：これは、後続の中に収集される全範囲にわたってDA濃度を生成する刺激を得ることが重要です彼らは主成分分析（セクシ​​ョン5.1を参照）のためのトレーニングセットとして使用されますので、実験。
   9. 側坐核コア（硬膜に6.3ミリメートル腹側）に電極を下げます。一過性のDAリリースイベントは毎分1以上の周波数で観察されるまで、その後のNACコア内の100ミクロン単位で電極を下げます。
   10. シリンジポンプに取り付けられた20ミリリットルの注射器にチューブ（内径1/32 "、外径3/32"）を接続します。チューブのもう一方の端には、ラットのカニューレにチューブを接続するために面取り23 G針を使用しています。チューブは、所望の味物質で完全に充填されていることを確認し、気泡がチューブ内に存在しないことを確認します。
       注意：一般的に、前の記録のための最初の注入は、完全な注入量ではなく、チューブ内の残留水や空気を提供することを確実にするために記録にラットの口の中に味物質を少量投与します。また、これは、動物が、いくつかの経験ウィットを持つことができH小説味物質、でも食欲ものは、、その目新しさに最初は嫌悪することができるので、味物質。
   11. データ収集のために、味物質の200μlの（ポンプ、前述のチューブを使用して、6.5秒）を注入します。味物質ごとに1-3分を注入。味物質あたり25回の合計を注入。各注入は、溶液200μlを提供します。
   12. 複数の味物質は、1回の実験で配信されている場合は、1味物質のデータを収集した後に水で経口カテーテルをフラッシュし、新しい味物質を注入する前に、少なくとも20分待ってください。
   13. DA記録セッションの後、記録部位の小さな病変を作成することで、組織学的検証のために準備します。その後のキャリブレーション用の炭素繊維電極を保持するには、第一の電極を撤回し、マイクロマニピュレーターを削除します。次に、元のカーボンfとして（硬膜下）と同じ深さに（ガラスチップを越えて100ミクロンを拡張する）ガラス微小電極とタングステン線で新しいマイクロマニピュレーターを使用iber微小電極。
   14. 10 Vの設定に達するまで組織学的検証については、タングステンワイヤで3 Vを印加し、1 V単位、10秒毎の電圧を増加させることにより、小さな病変を作成します。
   15. 標準濃度曲線は、既に複数の炭素繊維電極を使用して作成されている場合は、直接炭素繊維電極の電位を印加することにより、（3.1.14）上記病変のステップを実行します。
       注：この病変方法は、炭素繊維を損傷し、その特定の電極と、その後のキャリブレーションを防ぐことができます。
   16. 致死注射をペントバルビタール（150mgの/ kg、腹腔内）を用いて動物を安楽死させます。
   17. ヘッドキャップに直接上向きに引っ張ることによりプライヤーを使用して、カニューレとヘッドキャップを取り除きます。これは、脳への不必要な損傷を引き起こし、組織学中に電極の位置を特定することが難しくなりますので、ヘッドキャップをねじったりしないでください。
       1. 30％suコマンドが続く3日間の4％ホルマリンで脳と場所を削除します1週間crose。 、クライオスタットを用いて、30μmの切片を作成し、炭素繊維やタングステン病変の位置を特定するために、光学顕微鏡下でスライスをカバースリップ上にマウントして調べます。
          注：灌流は3.1.17のためのオプションです。

4）電極のキャリブレーション

1. 現在の濃度変換係数を作成するために、フローセルを使用します。
   1. 電極の感度を決定するために、フロー「T細胞」装置を用いて、各実験後に電極を較正します。トリス緩衝液、pH溶液、またはDAの溶液（2 ml /分の速度で）電極表面上に洗浄している間に「T細胞」に電極を下げます。緩衝液およびpHまたはDA溶液との間で前後に切り替えることが6位エアソレノイドアクチュエータを使用してください。
   2. 各キャリブレーションのために、20秒のAに続いて、pHまたはDA溶液を5秒間適用続いトリス緩衝液（ベースライン）の5秒の塗布中ボルタンメトリーデータを収集しますトリス緩衝液（30秒全ファイル）のpplication。各校正標準濃度、各標準の異なる濃度間の釣り合いのためにそれぞれの実行を3回繰り返します。
   3. 各サンプル採取のために、ピークDAまたはpH誘発電流を測定します。ピーク電流の関係対濃度を得るために各試験全体でピーク電流を平均化します。詳細な手順は、[12]と[13]を参照してください。

5）データ解析

1. 主成分分析（PCA）に設定されたトレーニングの使用
   注：ボルタンメトリー実験中に、出力は、ドーパミンの酸化と還元はpHシフト、および電気化学ノイズの結果である、現在のように製造されます。一つは所望の成分（DAおよびpH）を分離し、（より詳細な説明については^、15、16参照）は、所望の信号を歪ませる可能性のある追加の成分を除去することができるように、PCAは、これらの要素を分離することができます。
   1. 目に校正係数を割り当てE出力電流PCA後（約5-10 NA /μM）は、分析物の濃度値を決定することができるようにします。
   2. "電車" PCAモデルはDA、pH、およびその他の要因を分離するための実験中に得られたトレーニングセットを使用してください。 PCAは、（セクション3.1.8に回収）トレーニングセットサイクリックボルタモグラムを取り、ボルタモグラムの本質的な特徴は、インビボボルタンメトリーの録音中に収集された各検体を識別するために使用することができるかを決定します。
   3. 維持するために主成分の数を決定するために、マリノフスキーF検定を使用しています。典型的には、通常、データの分散の約95から99までパーセントを説明するのみ2または3の主成分を保持します。マリノフスキーF検定を実施する上で詳細な説明については^、17を参照してください。
      注：部品の数が決定されると、PCA分析を効果的に保持されている主成分にDAおよびpHトレーニングセットから測定されたボルタモグラムを投影します。結果だけDA（またはpH）のデータようにフィルタリングされたデータセットである（期待される出力のための代表的な結果を参照してください）​​のままであり、DAまたはpHに似ていない残存データが削除されます。ボルタンメトリー分析のためにPCAを使用するためのステップの指示によってさらに詳細な説明とステップのための材料のシートと^16、17を参照してください。

結果

口腔内カテーテル注入と組み合わせFSCVはどのようにスクロース、食欲味物質を試験するために使用した、側坐核コア内の相性DA放出を調節します。以前は味物質の点滴に、電気刺激（150μA、60ヘルツ、24パルス、赤いバーで示される）VTAのは、側坐核における相性DA放出（ 図1）において強い増加を生成図1上の電位のカラープロットを示します。 z軸上のy軸、x軸上の?...

ディスカッション

FSCVと組み合わせた口腔内味物質の送達は、経口香味料に「リアルタイム」DA応答の分析を可能にします。成功したDAの測定のために必要とされるプロトコルにおける3つの重要なステップがあります。まず、経口カテーテルの適切な注入は、風味剤を送達するために重要です。カテーテルは、第一大臼歯の後ろに挿入し、所定の位置にくさび止めされていることを保証することは開通性を失う...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stimulating electrode	PlasticsOne	MS303/2-A/SPC	when ordering, request a 22 mm cut below pedestal
Cannula for electrode	BioAnalytical Systems	MD-2251
Glass capillary	A-M systems	624503
Carbon fiber	Thornel	T650
Electrode puller	Narishige International	PE-22
Neurolog stimulus isolator	Digitimer Ltd.	DS4
Heat shrink	3M	FP-301
Insulated wires for electrodes	Squires electronics	Custom	L 3.000 x 1.000s x 1.000s UL1423 30/1 BLU
Micromanipulator	Univ. of Illinois at Chicago, Engineering Machine Shop
Epoxy	ITW Devcon	14250	"5 minute epoxy"
Copolymer of perfluoro-3,6-dioxa-4-methyl-7octene-sulfonic acid and tetrafluoroethylene	Ion Power	LQ-1105	i.e., Nafion
Silver paint	GC Electronics	22-023
Power supply	BK Precision	9110
Tubing for intra-oral catheters	Intramedic	427426	PE 100, I.D. = 0.86 mm; O.D. = 1.52 mm
Tubing for intra-oral infusion	Fischer Scientific	02-587-1A	I.D. 1/32"; O.D. 3/32"
Syringe pump for flow cell	Pump Systems Inc.	NE 1000
Surgical cement	Dentsply Caulk	675571 and 675572
Air actuator	VICI	A60	6 position digital valve interface
Digital valve interface	VICI	DVI	230 VAC
Quad headstage	Univ. of N. Carolina, Electronics Facility
UEI power supply	Univ. of N. Carolina, Electronics Facility
UEI breakout box	Univ. of N. Carolina, Electronics Facility
Power supply for tastant syringe pump	Med Associates	SG-504
Tastant syringe pump	Med Associates	PHM-107
Tungsten microelectrode	MicroProbes	WE30030.5A3
Silver wire reference with AgCl	InVivo Metric	E255A
Sucrose	Sigma	80497
Magnesium chloride	Sigma	M8266
Sodium chlroide	Sigma	S7653
Perchloric acid	Sigma	244252
Hydrochloric acid (4 M)	Sigma	54435
Soidum hydroxide	Sigma	306576
Hydrogen peroxide	Sigma	H1009
Dopamine hydrochloride	Sigma	H8502
TarHeel HDCV Software	University of North Carolina-Chapel Hill		Must request software: click here for link to software request page