剛性依存性細胞応答の研究のための簡単​​なポリアクリルアミド系マルチウェル剛性アッセイ

要約

Here, a method that enables quick, efficient, and inexpensive preparation of polyacrylamide gels in a multiwell plate format is described. The method does not require any specialized equipment and could be easily adopted by any research laboratory. It would be particularly useful in research focused on understanding stiffness-dependent cell responses.

要約

Currently, most of the in vitro cell research is performed on rigid tissue culture polystyrene (~1 GPa), while most cells in the body are attached to a matrix that is elastic and much softer (0.1 – 100 kPa). Since such stiffness mismatch greatly affects cell responses, there is a strong interest in developing hydrogel materials that span a wide range of stiffness to serve as cell substrates. Polyacrylamide gels, which are inexpensive and cover the stiffness range of all soft tissues in the body, are the hydrogel of choice for many research groups. However, polyacrylamide gel preparation is lengthy, tedious, and only suitable for small batches. Here, we describe an assay which by utilizing a permanent flexible plastic film as a structural support for the gels, enables the preparation of polyacrylamide gels in a multiwell plate format. The technique is faster, more efficient, and less costly than current methods and permits the preparation of gels of custom sizes not otherwise available. As it doesn’t require any specialized equipment, the method could be easily adopted by any research laboratory and would be particularly useful in research focused on understanding stiffness-dependent cell responses.

概要

体内のほとんどの組織は、ソフト軟骨100キロパスカルに脳0.1キロパスカルの範囲のヤング率を有する軟質の粘弾性材料であり、まだ、 インビトロの細胞研究のほとんどは、約1 GPaの弾性率を有する組織培養ポリスチレン（TCP）上で実施される^。1この剛性のミスマッチが大幅に細胞がその環境に対応方法に影響します。研究の成長体は、幹細胞を含む種々の細胞型^、2,3の運命の基板の剛性の影響を解明するこうして専用である^。4その結果、複数のヒドロゲルは剛性依存性細胞の理解を助けるために開発されている基板の剛性が細胞の運命に大きな影響を持っていることの証拠が増えている一方で、ポリアクリルアミド^{（PA）、5-7}ポリエチレングリコール^{（PEG）、8,9-}ジメチルシロキサン^{（PDMS）、10}およびアルギン酸塩を含む、生物^。11、ほとんどの研究は、上実施されるsの数が少ない小規模amples。細胞型または環境条件のアレイ用基板の剛性の影響に関する系統的、多次元研究は稀である^。12

いくつかの有望なハイスループットヒドロゲル技術は、PEGに基づくマイクロアレイ、アガロースヒドロゲルマイクロビーズを製造するための¹³のマイクロ流体デバイス^、14またはミクロ及び剛性がマイクロロッドの直径および高さによって変調されたナノロッドを含む、開発されてきた^。15ただし、そのような基板を製造するための技術が洗練された研究室の限られた数に利用可能である。剛性変調細胞応答に関与する多くの研究が実施が安価で簡単であるだけでなく、ポリアクリルアミド（PA）ゲルを利用するだけでなく、ヤング率、すなわち、0.3の生理学的に関連する範囲を示す-を300kPaにPAを製造する^16-22しかしながら、既存の方法細胞培養用ゲルは、労働集約的で、その結果、分取され小さなバッチでARED。細胞基質としてPAゲルの調製に関連する困難のいくつかは、ゲルを用意しなければならない要件から生じる：1）は、酸素の非存在下で完全な重合を可能にする、2）平滑な表面を有する均一なセルを可能にする付着及び拡散、および3）永久フローティング防止するための細胞培養皿の底に固定された。

いくつかのグループが、大きなバッチでの細胞培養のためのPAゲルを製造することを試みてきた。ゼムラーらパンチ、次いで「切断」であり、96ウェルプレートに入れ、PAゲルを調製した厚さのシート^23は、しかしながら、この方法は、より堅いゲル、 すなわち、> 1キロパスカルのヤング率で、より柔らかいために制限されゲルは、カットすることは困難であり、容易に損傷を受けた「スティッキー」である。 MIH らは、ゲルが直接ガラスボトムウェルプレート中で重合することができ、より洗練された技術を開発した。 6これは、官能化ガラス底プレート中にゲル溶液を注ぐとカスタムカバーガラス配列でそれらを「挟み込む」ことによりゲルを形成することによって達成された^。6にもかかわらず、非常に有望な、わずかなエッジ効果はまだ、この技術を用いて観察された。さらに、この技術は、多くの研究室だけでなく、高価なガラスボトムマルチウェルプレートにすぐにアクセスすることはできませんカスタムデザインの配列が必要です。

本論文では、簡単に任意の研究室によって採用することができ、マルチウェルプレートにPAゲルを組み立てるための簡単​​で安価な方法について説明します。撥PAゲルに疎水一つ、共有結合、堆積時PAゲルに結合する親水オン、 - ここで、柔軟なプラスチック支持体は、2つの側面を有し、利用される。 PAゲルシートは、可撓性プラスチック支持体に固定され永久に堆積された後は、任意の厚さまたは剛性のゲルを処理し、任意の所望の形状にして切断を可能にする。このAPPRoachは、PA結合溶液で、ガラスカバースリップまたは高価なガラスボトムマルチウェルプレートのウェルのいずれかを他の方法で市販されていないサイズのカスタムプラスチック「カバーガラス」を生成するだけでなく、ガラス表面-御馳走事前に必要がなくなるだけでなく、退屈で時間のかかる工程。最後に、均一なPAゲルシートは、大きなバッチで調製し、数ヶ月デ水和格納することができる。

要約すると、ここで提示アッセイは、いくつかの態様において、既存の方法の改良である。まず、マルチウェルプレートアセンブリのプロセスが効率的であり、必要な材料の全体的なコストが低い。第二に、ヒドロゲルは、単一の均質ゲルフィルムに大きなバッチで製造される。最終的に、市販されている唯一の材料が必要とされる。アッセイの有用性は、細胞形態の基板の剛性の影響を探索し、面積を広げることによって示されている。

プロトコル

ヒドロゲル関連ソリューションおよびアリコートの調製

1. ポリアクリルアミドゲル前駆体溶液の調製。
   1. アクリルアミド（A）を混合することにより、ポリアクリルアミドゲル前駆体溶液を製造（w / vの40％、Mは_、rは 71.08グラム/モル）、架橋剤ビスアクリルアミド（B）（2％w / vの、Mは、154.17グラム/モル_rの ）、およびデ表1に指定されたボリュームの割合でイオン水。
      注：これらのソリューションは、大きなバッチで調製し、数ヶ月まで4℃で保存することができる。
      1. 注意：アクリルアミドは特に、とき粉末状の、吸入または摂取時に有毒である：従って、好ましくは、毒性のリスクを減らすためにw / v溶液40パーセントを使用します。そのような手袋、ゴーグル、そして白衣として、防護服を着ている間だけハンドル。冷蔵庫の中の光耐性、しっかりと密閉容器（<23℃、換気の良い場所）に保管してください。
      2. 注意：ビス ​​- アクリルアミドは特に、吸入または摂取時に有毒である、時粉末形態で：従って、好ましくは、毒性のリスクを減らすために2％w / v溶液を使用しています。そのような手袋、ゴーグル、そして白衣として、防護服を着ている間だけハンドル。冷蔵庫の中の光耐性、しっかりと密閉容器（<4℃、換気の良い場所）に保管してください。
2. 調製およびN -Sulfosuccinimidyl -6-（4'-アジド-2'-ニトロフェニルアミノ）ヘキサノエートの使用アリコート（スルホSANPAHは、Mは、492.40グラム/モル_rを）。注意：スルホSANPAHは深刻な眼刺激を引き起こす。手袋と適切な保護眼鏡または保護面を扱う。ストア受信時に-20℃で前分注する。
   1. スルホ - SANPAHを保存するには：50 mg / mlのでdimethylsulfoxane（DMSO）にスルホSANPAHを溶解する。チューブあたり20μlに50マイクロ遠心チューブにストック溶液を分注し。ドライアイス上または液体窒素中でフラッシュ凍結-80℃で、店舗（最大架橋剤効率を維持するために任意であるが好ましい工程）。
      注：一定分量は、CAnは、数ヶ月間保存すること。
   2. スルホ - SANPAH使用するには：簡単にアリコートを解凍し、脱イオン水480μlの希釈する。すぐに使用してください。スルホSANPAHは水に迅速に加水分解する：ので、すぐに上記の手順をすべて実行するために注意を取る。
3. 過硫酸アンモニウム（M _rは 228.18グラム/モル）のアリコートを調製する。
   注：過硫酸アンモニウムは、目、皮膚、呼吸器への刺激の原因となる。取り扱いの際に適切な個人保護具を着用する。化学ヒュームフードの過硫酸アンモニウム粉末を扱う。ドライ、風通しの良い場所に保管して粉末。分注した後、希釈溶液は、作業台の上に使用することができる。
   1. w / vの10％の最終の硫酸アンモニウム濃度を達成するために、脱イオン水に過硫酸アンモニウムを溶解する。 -20℃で小分けし、保存。使用直前に解凍します。
4. I型コラーゲン溶液の調製。
   1. そうストックを希釈することによって0.2 mg / mlのコラーゲン溶液を調製pH7.4での1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）中リュー。簡単に氷の上に保管してくださいまたは希釈するとすぐに使用しています。

2.ハイドロゲル準備（図1を参照してください）

1. 疎水性スライドガラスの調製。
   1. ガラス板上に疎水性溶液を数滴を置き、表面全体に広がってティッシュペーパーを使用しています。空気が乾燥してみましょうと疎水性コーティングを均等に再びティッシュペーパーで拭いてください。
      注：RTで可燃性のキャビネットに保管して疎水性のソリューション。取り扱う際は保護具を着用。換気の良い場所で作業します。
2. 可撓性プラスチック支持体の作製。
   1. 疎水性コーティングされたガラス板のサイズに合わせて柔軟なプラスチック支持体を切断した。
   2. 軽くそのような外科用メスなどの鋭利な工具で表面を引っ掻くことにより、柔軟なプラスチック支持体の疎水性側をマークします。
      注： - 完全に透過的である - ゲル一度乾く、スクラッチマークは、柔軟なプラスチック製の支持体側がゲルを含む区別しやすくなります。
      注：可撓性プラスチック支持体は、疎水性および親水性の側面を有する。蒸着後、ポリアクリルアミドは、恒久的に簡単に後続のヒドロゲルの取り​​扱いを容易にプラスチック支持体の親水性側に付着する。
3. ゲルの調製（例えば容積5mlのゲル前駆体溶液のために与えられている）。
   NOTE：ゲルの初期厚さが0.5mmである場合を5ml〜40のゲルを生成するのに十分であろう。ゲルの厚さを小さくすれば、よりゲルを製造することができる。
   1. 50ミリリットルコニカルチューブに所望の最終濃度（ 表1）のポリアクリルアミド前駆体溶液の4972.5μLを置 ​​きます。キャップで30分間脱ガスチャンバ内の場所を開け。
      NOTE：酸素ラジカル捕捉剤として作用し、存在する、重合を阻害する。
   2. 過硫酸アンモニウムw / vの10パーセントの25μlを加え、最終的に達成するために（1.3を指すように参照してください。）0.05％の過硫酸アンモニウムの濃度。
   3. N、N、N '、N'-テトラメチルエチレンジアミンの2.5μl加え、0.5％の最終TEMED濃度を達成するために脱気したゲル溶液に（TEMED、Mは116.24グラム/モルを_R）。
      注：RTで可燃性のキャビネットに保管TEMED。適切な個人保護具を身に着けているときに、化学ドラフト内で取り扱ってください。それは非常に空気や水分に敏感であるように、しっかりと不活性ガス下で閉じておいてください。
   4. 5回 - ダウン3をピペッティングにより穏やかに溶液を混合する。ゲル前駆体溶液への酸素の拡散を回避するためにボルテックスしないでください。
   5. 疎水性コーティングされたスライドガラスを有する可撓性プラスチック支持体とサンドイッチの親水性側上にゲル溶液をピペット。所望の厚さ（ 例えば、0.5ミリメートル）のシリコーンスペーサーを2スライドを区切ります。ゲル化の指標として使用する50mlの円錐管中でポリマー前駆体溶液の少量（約100μl）を残す。
      注意：任意のスペーサーを使用することができる。 120μmで - 例えば、パラフィルムの単一のストリップは、100の最後の膨潤ゲルの厚さを与えます。
   6. 重合時にさえヒドロゲル表面を確認するために柔軟なプラスチック支持体/ゲルサンドイッチの上に別のガラス板を置きます。
   7. 所望であれば、より少ない時間でより高い重量％のゲルのために使用することができるゲルを、45分間重合してみよう。ゲルが重合したことを確認するため、50ミリリットルコニカルチューブ中の残留溶液を観察する。残りの溶液がゲル化していれば、それはガラス板上にゲル化が同様に開始された可能性がある。しかし、金型の早期開口部が完全な重合を防止することに注意。
   8. ゲルが形成されると、上に共有結合したポリアクリルアミドゲルを有する可撓性プラスチック支持体から剥離し、空気乾燥ゲル側を上向きにして設定。
      NOTE：対流または熱乾燥は、このステップを加速するためにも使用することができる。可撓性プラスチック支持体上に乾燥した後、ゲルをストアすることができ無期限dは。
      1. ポリアクリルアミドゲルは、気泡のために形成されなかった柔軟なプラスチック支持体、のいずれかの裸のスポットをマークします。ゲルが乾燥したら、これは柔軟なプラスチック支持体に溶け込むようマークゲルはまだ水和されている間。

3.マルチウェルプレートアセンブリ、コラーゲンコーティング、および滅菌

1. マルチウェルプレートアセンブリ。
   1. 乾燥させた後、所望の形状にPAゲルをカット。
      1. 96ウェルプレートの場合は、〜6ミリメートルの直径を有する大型穴パンチを使用しています。正方形または長方形の形状にゲルをカットする大型ペーパーカッターを使用してください。代わりに、はさみを使用しています。
   2. 製造元の指示に従って、96ウェルプレート当たりPDMSの約500μlのを準備します。マルチウェルプレートの底にゲルを接着するために、各ウェルの中心にポリジメチルシロキサン（PDMS）の小滴（〜5μl）を配置します。鉗子を使用して、1つのポリアクリルアミドを配置ダウン各ウェル、可撓性プラスチック支持体側の電子ゲル。 PDMSを硬化できるようにするには、4時間の最小37℃で組み立てられたプレートを残す。
2. ポリアクリルアミドゲルのコラーゲンコーティング。
   1. 転送ピペットを用いて、少量プレイス - スルホ - SANPAHの（7 8μl）をゲル表面に均一にコーティングするために左右によくスワールそれぞれに（1.2.2を指すように参照）。スルホ - SANPAHは水中で安定していないので、速やかに作業します。
   2. 5分間 - 高強度UVランプ（365nmの強度= 37ミリワット、λ= 302）の下でウェルプレートを置きます。過剰スルホ - SANPAHを除去してPBSでゲルを洗浄します。
   3. 0.2ミリグラムのピペットを50μl/ mlのI型コラーゲン溶液（1.4ポイントを参照）を各ウェルに。 4℃で少なくとも2時間またはO / N RTで​​覆われたプレートのままにしておきます。
      NOTE：コラーゲンコーティングのプロセスをスピードアップするために、ピペットは、コラーゲン溶液を追加するために使用することができる。一般的に、1 - 溶液2滴が完了するのに十分であるべきであるLYゲル表面をカバーしています。
   4. コラーゲン結合を可能にするために、少なくとも2時間室温でウェルプレートにしておきます。
   5. 2時間、組織培養フード中の過剰コラーゲン溶液を除去し、UV（λ= 200 nm）の下で殺菌するためにPBSで洗浄すること。
   6. 水和平衡化するO / N（培地組成はセクション4.1を参照のこと）完全培地中でゲルを浸す。最大2日間すぐに播種細胞ま​​たは冷蔵庫に店舗に使用します。

PA剛性アッセイ4.細胞播種

注：一般的な哺乳動物細胞株のための代表的なものの、ここで説明するプロトコルは、特に乳癌MDA-MB-231細胞株で使用される（ 図4及び図5を参照）。

1. 37℃で5分間、5％トリプシン/ EDTAに暴露することにより組織培養フラスコから細胞を収集する。 〜培養フラスコ領域の各1cm ²当たりのトリプシン/ EDTA80μlのを使用します。例えば、トリプシン/ EDTA foの2 mlを使用RA T25細胞培養フラスコ。再懸濁所望の最終細胞濃度で、10％ウシ胎児血清（FBS）および1％ペニシリン/ストレプトマイシンを補充した完全培地中で回収された細胞である。細胞は、アッセイに播種される時間だけでなく、時間の長さを倍にアカウントセルに入れて、適切なサブコンフルエント細胞濃度を選択する。添加した培地を完全にヒドロゲルを沈めるのに十分であることを確認してください。
   NOTE：ヒドロゲル培地で予め平衡化されているために十分であるべきで100μlの体積（3.2.6ステップを参照）。ゲルは前のステップでメディアで事前に平衡化されているので、マルチウェルプレートに使用される典型的なメディアのボリュームは十分なはずです。
   注：このアッセイは、任意の付着依存性細胞型のために適切であろう。
   1. 血球計を使用して、倒立顕微鏡下で細胞数をカウントする。負荷10の各血球計ポートに細胞懸濁液μlの少なくとも8象限から細胞数を平均化する。取得するため最終細胞濃度は、10 ⁴細胞数を掛ける。
      注：各血球計象限における細胞数が20である場合、最良の細胞計数結果が得られる - 50。
2. 培養物を37℃で加湿インキュベーター中でPA剛性アッセイ上に細胞を、5％CO _2。 3日間 - すべての2メディアを変更します。 5分間37℃で5％トリプシン/ EDTAに暴露することによって、必要なときに、細胞を収集する。組織培養フラスコの1cm ²当たりのトリプシン/ EDTAの〜80μlのを使用してください。ヒドロゲルに触れるのではなく、わずかに横マルチウェルプレートを傾けると、各ウェルの側壁にピペットチップに触れることにより、吸引またはピペット媒体：全細胞操作工程の間に、ヒドロゲルの表面を破壊しないように特別な注意を払う。
   注：標準的な組織培養処理時のヒドロゲルの表面を損傷しないように十分注意し除き、細胞は、それらが上に播種されたかのように剛性のアッセイは同じように操作することができる上に播種定期的なマルチウェルプレートに。

PA剛性アッセイ上に播種された細胞の5イメージング

1. 直接PA剛性アッセイにおける画像セル。
   注：すべての顕微鏡 - 倒立蛍光または共焦点顕微鏡は、細胞イメージングのために使用することができる。
   NOTE：剛性アッセイを構築するために使用される可撓性プラスチック支持体は、完全に透明であり、autofluoresceまたは細胞画像化を妨害しない。しかし、可撓性プラスチック支持体自体が透明であっても、イメージング機能は対物レンズの作動距離によって制限される。柔軟なプラスチック支持体は、0.23ミリメートルの厚さを有し、10倍の対物レンズの典型的な作動距離が急激に高倍率のために減少〜4mmである。
   1. 生細胞イメージングのための顕微鏡のプレートホルダー及び画像中の位置PA剛性アッセイ。 2時間の下でイメージングセッションを保持し、またはより長い撮影時刻のための環境室を備えた顕微鏡を使用しています。
   2. ときに生細胞イムエージングが目的ではない、0.1％の界面活性剤を補充した4％ホルムアルデヒド溶液で細胞を固定する。 2時間の最小室温で固定液中で細胞を浸す。二回PBSですすぐ。指定された廃棄物容器内の固定液の廃棄物を捨てる。
      注：細胞は、直ちに画像化することができる、または2週間まで4℃でPBS中に沈めて格納。注意：ホルムアルデヒドは吸入と接触した際に有毒である。化学ヒュームフード中で手袋を取り扱ってください。
      注記：特定の固定剤は、いくつかの細胞タンパク質に損傷を与えるので、細胞の固定プロトコルは、その後の細胞染色および処理プロトコルに基づいて選択されな​​ければならない。
   3. 蛍光イメージングのために、染色は、マルチウェルプレート中で直接所望の細胞染色で細胞を固定。画像をすぐに。

結果

ポリアクリルアミド（PA）ヒドロゲルは広く剛性依存性細胞応答を試験するために使用される^。17,24アクリルアミド（A）とビスアクリルアミド（B）の種々の濃度を混合することにより、一つのほとんどの軟組織の剛性の範囲に及ぶPAゲルを作ることができるボディ- 0.3 -ここで300kPaのヤング率¹が、ポリアクリルアミドゲルの調製が面倒であり、時間は、多くの場合、例えば薬?...

ディスカッション

もともと電気泳動のために開発され、ポリアクリルアミドゲルは^、28は、現在日常的に細胞の形態、運動性、および他の細胞特性のうち通信^3,24,29上の基板の剛性の影響を研究するために細胞培養基質として使用される。ポリマー前駆体濃度の単純な変化- （300キロパスカル^0.3）1（ 図2、表1も参照^{17,25,26参照} ）、ポリアクリルアミド、体内のすべて...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
40% Acrylamide	Bio-Rad	161-0140
2% Bis-acrylamide	Bio-Rad	161-0142
Ammonium Persulfate	Bio-Rad	161-07000
TEMED	Sigma Aldrich	T9281
Sulfo-SANPAH	Thermo Scientific	22589
Collagen Type 1, from Rat tail, 3.68 mg/ml	BD Biosciences	354236
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Fisher Scientific	BP231-100
Hydrophobic solution — Repel Silane	GE Healthcare Bio-Sciences	17-1332-01
PBS (1x), pH 7.4	HyClone	SH30256.01
Polydimehylsiloxane (PDMS) [Slygard 182 Elastomer Kit]	Elsworth Adhesives	3097358-1004
Tyrpsin/EDTA (10x)	Sigma Aldrich	44174
RPMI-1640 Medium (1x)	HyClone	SH30027-02
Fetal Bovine Serum	HyClone	SH30073-03
Penicillin Streptomycin	MP Biomedicals	1670046
Detergent: Triton-X	Sigma Aldrich	T8787
Formaldehyde 37% Solution	Sigma Aldrich	F1635
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma Aldrich	A2153
BSA-based cell adhesion blocking kit — ECM Cell Adhesion Array Kit	Chemicon International	ECM540
Disposable lab equipment
flexible plastic support — GelBond PAG Film for Polyacrylamide Gels	GE Healthcare Bio-Sciences	309819
Glass Plates	Slumpys	GBS4100SFSL
50 ml conical tubes	Fisher Scientific	3181345107
15 ml conicals tubes	FALCON	352097
Micro centrifuge tubes	Fisher Scientific	2 ml: 02681258
96-well plate (flat bottom)	Fisher Scientific	12565501
Disposable Pipettes (1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml, 25 ml, 50 ml)	Fisher Scientific	1 ml: 13-678-11B, 2 ml: 05214038, 5 ml (FALCON): 357529, 10 ml: 13-678-11E, 25 ml: 13-678-11, 50 ml: 13-678-11F
Glass Transfer Pipettes	Fisher Scientific	5 3/4": 1367820A, 9":136786B
Pipette Tips (1-200 μl, 101-1000 μl)	Fisher Scientific	2707509
Plastic Standard Disposable Transfer Pipettes	Fisher Scientific	13-711-9D
Parafilm	PARAFILM	PM992
Powder Free Examination Gloves	Quest	92897
Silicone spacers — Silicone sheet, 0.5 mm thick/13 cm x 18 cm	Grace Bio-Labs	JTR-S-0.5
Large/non-disposable lab equipment
Light and Flourescent Microscope (Axiovert 200M)	Zeiss	3820005619
Microscope Software	Zeiss	AxioVision Rel. 4.8.2
UV oven	UVITRON	UV1080
Vacuum chamber/degasser	BelArt	999320237
Vacuum pump for degasser	KNF Lab	5097482
Tissue Culture Hood	NUAIRE	NU-425-600
Chemical Fume Hood	KEWAUNEE	99151
Inverted Microscope (Axiovert 25)	Zeiss	663526
Incubator	NUAIRE	NU-8500
Pipette Aid	Drummond Scientific Co.	P-76864
Hemacytometer	Bright-Line	383684