ラットヘッドBranchiomeric筋肉から衛星細胞の単離とキャラクタリゼーション

要約

このプロトコルは、9週齢のラットのbranchiomeric頭筋からの衛星細胞の単離を記載しています。筋肉は異なる鰓弓に由来します。次いで、衛星細胞は、それらの分化を研究するためのミリメートルサイズのスポットコーティング上で培養されます。このアプローチは、衛星細胞の増殖および継代を避けることができます。

要約

Fibrosis and defective muscle regeneration can hamper the functional recovery of the soft palate muscles after cleft palate repair. This causes persistent problems in speech, swallowing, and sucking. In vitro culture systems that allow the study of satellite cells (myogenic stem cells) from head muscles are crucial to develop new therapies based on tissue engineering to promote muscle regeneration after surgery. These systems will offer new perspectives for the treatment of cleft palate patients. A protocol for the isolation, culture and differentiation of satellite cells from head muscles is presented. The isolation is based on enzymatic digestion and trituration to release the satellite cells. In addition, this protocol comprises an innovative method using extracellular matrix gel coatings of millimeter size, which requires only low numbers of satellite cells for differentiation assays.

概要

約1：500から1：1,000の新生児は、唇および/または口蓋（CLP）を含む割れ目を示します。このように、これは、人間¹における最も一般的な先天性奇形です。軟口蓋の筋肉は、音声、嚥下、および吸引時の軟口蓋の機能に重要です。軟口蓋の裂け目が存在する場合、これらの筋肉が異常口蓋骨の後方端部に挿入されています。

軟口蓋は鼻から脱出する空気を防ぐ、演説の中で上下に移動します。口蓋裂のある子どもでは、口蓋帆咽頭機能不全^2,3と呼ばれる現象が生じる。この制御機能を持っていません。治療プロトコルが可変であるが、軟口蓋の外科的修復は、幼児（生後6-36ヶ月^）4で行われます。軟口蓋の異常挿入筋肉が外科的に^5-7に補正することができるが、口蓋帆咽頭の機能不全は30％7％に持続します^2,3,8-10の患者。

衛星細胞（SCS）の作用を介して再生する骨格筋の能力は十分^11,12を確立されています。筋損傷の際に、SCが活性化され、損傷部位に移動します。そして、彼らは、増殖と分化、およびヒューズ新しい筋線維または修理損傷したもの^13を形成します。その子孫、増殖する筋芽細胞は、さらに、筋原決意因子1（MyoDの^）16を表現しながら、自己消費のSCは、転写因子PAX7 ^14,15を発現します。差別筋芽細胞は、ミオゲニン^{（MyoG）17を}表現するために開始します。筋芽細胞の分化は、筋線維の形成、およびそのようなミオシン重鎖^{（MyHC）16,18}などの筋特異的タンパク質の発現によって特徴付けられます。

最近、いくつかの戦略は、四肢の筋肉^19-23の筋肉再生を改善するために、再生医療に使用されてきました。上の特定の研究それが最近、彼らはいくつかの側面²⁴に他の筋肉とは異なることが示されたため、branchiomeric頭の筋肉も重要です。四肢の筋肉とは対照的に、それはbranchiomeric頭筋が少ないのSC ^25が含まれていることが示唆されている、再生遅く、多くの線維性結合組織が​​branchiomeric頭筋からのSCは、他の転写因子を発現する増殖性、さらに損傷²⁶の後に形成されています。例えば、Tcf21、頭蓋顔面筋形成のための転写因子が強く頭筋の再生ではなく、ほとんど肢の筋肉^25の再生中で発現されます。 CLP患者の軟口蓋の筋肉は、通常、サイズが小さく、通常の口蓋筋^27,28と比較して、よく組織されています。低速および高速繊維は、両方の軟口蓋の筋肉に存在するが、遅い繊維はより豊富です。これとは対照的に、割れ目筋肉が速い繊維のより高い割合で含有し、また低減毛細管供給通常の軟口蓋の筋肉^29-31と比較。高速繊維が収縮誘発性損傷^31-33になりやすいです。添付悪い毛細管供給も線維症^34,35を促進することができます。すべてのこれらの局面は、手術裂閉鎖³⁶の後軟口蓋の筋肉の悪い再生に寄与することができます。そこで、branchiomeric頭筋SCの単離および特徴付けのためのプロトコルは非常に重要です。これはbranchiomeric頭筋のSCの生物学を研究する可能性を提供します。さらに、組織工学に基づく新しい治療は、CLPおよび頭蓋顔面領域を損なう他の状態で手術後の筋肉再生を促進するために開発することができます。

一般的には、SCが筋肉組織¹⁴の分離後に得られることができます。ミンチ、酵素消化、およびトリチュレーションは、一般的に、それらのニッチからのSCを解放する必要があります。 SCがコーティングされていない皿^{14,37,38、FR}にプレめっきにより精製することができますパーコール^39,40のactionation、または^41〜43のソートfluorescent-または磁気セル。ここでは、若い成体ラットのbranchiomeric頭筋からの衛星細胞の単離のための新たな経済と迅速なプロトコルを提示します。このプロトコルは、前の原稿¹⁴に基づいて、具体的に小さな組織サンプルのために適合されています。 ^第 1、 ^第 2、および^第 4鰓弓から生じる代表的な筋からのSCの単離が記載されています。単離後、衛星細胞の少数は、それらの分化を研究するためのミリメートルサイズの細胞外マトリックスゲルスポット上で培養されます。このアプローチは、SCの拡大と継代の必要性を回避します。

プロトコル

本明細書に記載の全ての実験は、オランダの法律および規制（RU-DEC 2013から205）に応じてラートボウト大学ナイメーヘンから動物実験のために地元の理事会で承認されました。

1.細胞外マトリックスゲルスポット

1. 分離前に1日以下の手順を実行します。
   1. 少なくとも1.5時間、4℃で一定分量外マトリックスゲル（100μl）を解凍します。ダルベッコ改変イーグル培地中で1:10に希釈し、 4,500 mg / Lのグルコース、4mMのL-グルタミン、および110 mg / mlのピ​​ルビン酸ナトリウム（DMEM）を有します。すべての回で4℃での細胞外マトリックスゲルを保管してください。注：急激な温度変化が塗布ムラや結晶形成をもたらします。
   2. 15分間氷上で希釈された細胞外マトリックスゲル溶液を保管してください。
   3. 10分間、20μlのマイクロピペットを事前に冷やし。
   4. 100ミリメートルペトリ皿に8ウェルチャンバースライドを入れ、10分間冷表面（ 例えばフリーザーパック）上に皿を転送します。
   5. 各ウェルに10μlの細胞外マトリックスゲルのドロップを入れて予備冷却マイクロピペットを使用してください。少なくとも他7分（ 図1A）、冷表面にペトリ皿にしてください。
   6. 完全に残っている細胞外マトリックスゲル（ 図1B）を削除し、37℃で一晩、ウェルを乾燥させます。

2.解剖頭の筋肉（咬筋、顎二腹筋、及び挙ヴェリ口蓋）

1. 切開の前に、2％のペニシリン - ストレプトマイシン（P / S）を補充したリン酸緩衝生理食塩水（PBS）50mlのを準備します。氷の上に保管してください。
2. CO ₂ / O ₂と一人の若い成体ラット（9週）の安楽死の後、頭を刎ねると頭から皮膚を削除します。氷冷PBSにヘッドを移すを50mlチューブ中の2％P / Sを補充しました。
3. （第1鰓弓由来）咬筋
   1. シリコンパッド上の一側を上に頭を置き、皮下Nで固定eedles（ 図2A）。
   2. 耳下腺および顔面神経（ 図2A）を特定します。腺を覆う深い筋膜を露出させます。筋膜をカットし、解剖ハサミを使用して腺を削除します。外耳道を識別します。茎乳突孔から顔面神経をトレースし、慎重に手術用メスの刃の第15号で、時間的な頬骨と頬枝を削除します。
   3. 筋膜を除去することによって咬筋の表面的な頭を解放します。咬筋の表面と深部の両方のヘッドを特定します。上顎の頬骨突起に挿入されたその太い腱腱膜まで表面的なヘッドをトレースします。
   4. ストレートピンセットで頬骨突起を原点から腱を分離します。手術用メスの刃15号や解剖ハサミでそれをカットし、慎重に生活して（ 図2B）。
   5. その角度で挿入し、Tの下半分まで咬筋の表面的な頭を解剖彼は手術用メスの刃番15（ 図2C）と下顎の枝の表面を横。今、完全に筋肉を削除します。
4. （ ^第 2鰓弓由来）二腹筋の後方腹
   1. シリコンパッド上に仰臥位で頭部を置き、皮下注射針（ 図3A）で固定します。
   2. 舌下および顎下腺の両方の上に位置する皮下脂肪を除去します。次に、表在性筋膜と解剖ハサミを使用して腺を削除します。二腹筋（前方および後方腹）を公開します。
   3. ストレートピンセットで後方腹の前腱を持ち、それをカットし、鼓室胞（ 図3B）にその起源まで慎重に解剖。反対側で同じ操作を行います。
5. （第4鰓弓由来）口蓋帆挙筋筋
   1. 二腹筋の後方腹の切開後の（ 図4A）、横方向に引き、そして慎重に取り外し、茎突舌骨筋をローカライズ。
   2. 鼓膜胞（ 図4A）で挿入口蓋帆挙筋の腱をローカライズ。慎重にそれを分析し、両側にそれをカット。
   3. 気管およびその背後に実行食道を探します。食道を持ち上げ、咽頭、喉頭および軟口蓋を公開します。
   4. 口蓋帆挙筋が挿入された軟口蓋の領域を局所化した（ 図4B）緩いそれをカット。
      注：直接切開した後、慎重に実体顕微鏡下で各筋肉の腱および結合組織を除去します。エタノール70％に迅速に全ての検体を水没し、氷冷PBSに転送15mlチューブに2％P / Sを加えたもの。

衛星細胞の単離3

1. 筋肉の3つのグループからのSC単離するための以下の製造手順を実行します。
   1. DMEM中の0.1％プロナーゼの7.5ミリリットルを準備します。 0.22μmのフィルターを通してソリューションをフィルタリングします。分離前に10分間、水浴中で37℃で溶液を事前に温めます。
   2. 準備、10％ウマ血清（HS）および1％P / Sを添加したDMEMの35ミリリットル。また、事前に暖かい37℃の水浴中。
   3. 20％ウシ胎児血清（FBS）、10％HS、1％P / S、1％ニワトリ胚抽出物（CEE）を添加したDMEMから成る15ミリリットルの培地を調製します。水浴中で37℃でのプレ暖かいです。
   4. プレコート6プラスチックピペット使用前に少なくとも10分間、HSと（10ml）および乾燥。
2. 培養フードでは、6ウェルプレートのウェルに各筋肉を転送します。解剖ハサミを使用して、約2mmの小片に筋を切りました。あまりにも多くの組織をミンチしないように注意してください。
3. 慎重に各ウェルに0.1％のプロナーゼ溶液を2.5ミリリットルを追加し、37℃で60分間インキュベートします。静かに20、40、および60分後にプレートを横に振ります。注：正確なduratioインキュベーションのNは、動物の年齢や歪みなどの要因に依存します。
4. 顕微鏡下で監視します。筋肉の断片を確認し、繊維束が緩ん外観（ 図5）を取得するときに、酵素消化を停止します。
5. DMEM 2.5mlの10％HSおよび1％P / Sを補充した追加。 5分間400×gで15ミリリットルチューブと遠心分離機にチューブを転送します。デカンテーションにより上澄み液を捨てます。
6. 10％HSおよび1％P / Sを補充した5ミリリットルのDMEMを追加します。溶液をピペットで上下10ミリリットルのプラスチックピペット（トリチュレーション）で組織を均質化するために、少なくとも20回。
7. 4分間200×gでチューブを遠心。上清を回収し、15 mlチューブに移します。
8. 10％HSおよび1％P / Sを補充した5ミリリットルのDMEMを追加します。 10ミリリットルのプラスチックピペットを用いて、再びピペット組織断片をピペットを介して容易に通過するまで。
9. 4分間200×gでチューブを遠心し、15mlチューブ内の上清を収集します。
10. P50mlのチューブにセルストレーナー（40μm）をユタ、フィルター上に解離した細胞を含む上清を移します。最大の細胞回収のために1ミリリットルのDMEMで洗浄しました。
11. 10分1,000×gでチューブを遠心し、ピペットで上清を捨てます。
12. 300μlの培養液中にペレットを再懸濁し、血球計で細胞をカウントします。

細胞外マトリックスゲルスポットの衛星細胞の分化4

1. 培地10μl中1.5×10 ^3個の細胞を得るために、細胞懸濁液を希釈します。
2. テープでチャンバースライドのカバーを固定して、オブジェクトのガラスの下側に黒のマ​​ーカーでスポットをマークします。
3. マイクロピペットを使用して、細胞外マトリックスゲルスポットに10μlの細胞懸濁液の液滴を置きます。細胞懸濁液の低下がその場で正しく配置されているかどうかを顕微鏡で確認してください。 37℃で6時間インキュベートします。
4. 注意深いですLYは、培養培地（20％FBSを補充したDMEM、10％HS、1％P / S、1％CEE）の400μlを添加し、37℃で3日間インキュベートします。
   注：この時点では、新たに単離されたSCは、大規模な外傷（酵素消化および過酷なトリチュレーション）にかけ、彼らが回復する必要があります。第三日37時の次に細胞を乱さないで、培養培地は、実験の種類に応じて変更することができます。
   細胞外マトリックスゲルスポットを分化アッセイのための高細胞密度（1.5〜2.5×10 20分の^3μL）を播種することができます。培養媒体（DMEM、20％FBS、10％HS、1％P / S、1％ニワトリ胚抽出物を補充した）三日毎に交換することができます。
5. あるいは、拡張および通過を希望する場合は、次の手順に従います。
   1. 少なくとも1.5時間、4℃で一定分量外マトリックスゲル（500μl）を解凍します。 DMEM中で1:10に希釈し、ポイント1.1.1の推奨事項に従ってください。
   2. 4で10分間プレ寒10ミリリットルピペット＆＃176; C。
   3. 10分間の冷表面（ 例えばフリーザーパック）に3 T75フラスコを転送します。
   4. 各フラスコに1ミリリットルの細胞外マトリックスゲルを入れて予備冷却したピペットを使用してください。表面が完全に覆われていることを確認してください。少なくとも他7分（ 図1A）、冷表面にフラスコを保管してください。
   5. 完全に10ミリリットルピペットで残っている細胞外マトリックスゲルを除去し、37℃で1時間、ウェルを乾燥させます。
   6. カウントした後、培養培地を予め被覆T75フラスコおよびシード（20％FBS、10％HS、1％P / S、1％ニワトリ胚抽出物を補充したDMEM）10ml中の新たに単離したのSCを再懸濁します。
   7. 80％のコンフルエンスに到達するまで、3日後、培地（と3日ごと）に変更します。継代のために、PBSでT75フラスコを3回洗浄します。次に1ミリリットルを、0.25％トリプシン溶液を添加し、37℃で3分間インキュベートします。培地9mlの再懸濁は（DMEM、10％HS、1％P / S、20％FBSを補充し1％ニワトリ胚抽出物）と5分間、200×gで遠心します。上清を捨てます。カウントした後、培地1000μlの1×10 ⁶細胞を再懸濁し、細胞を凍結します。

結果

このプロトコルを使用して、咬筋（片側）は0.8〜1×10 ^6個の細胞、二腹筋（事後腹）1.5〜2×10 ⁵個^の細胞が得られると、挙筋ヴェリ口蓋筋利回り1〜1.5×10 ⁵個^の細胞が得られます。細胞収率は、筋肉型、株、および動物の年齢に依存します。 3筋肉群間の比較のために、新たに単離されたSCが同一の細胞密度（1.5×10 10分の^3μL）で播種しました。直接単離後に、新たに単離した細胞の90％以上がPAX7（ 図6）を発現します。

4日目、7と10の文化をPAX7、MyoDの、MyoGとMyHC免疫染色に対する抗体で染色しました。五任意のフィールドが20倍の対物レンズを用いて培養あたりで計数しました。 4日目にパックス7ミオDは、すべての筋肉群において発現される（ 図6、図7、図8）、しかし咬筋からSatCsの子孫と顎二腹筋の筋肉がEXPRESを開始しますミオゲニン以前口蓋帆挙筋筋（ 図9）よりも歌います。 10日目において、MyoGの発現が強く、すべてのグループ（ 図9）に低減されます。数日の細胞外マトリックスゲルスポットに播種後​​、増殖細胞を融合し、ミオシン重鎖を発現する多核筋管を形成し始めます。小さ ​​な筋管は、7日目（ 図10）ではっきりと見えます。 10日目に、筋管のけいれんを（ ビデオ1）を観察することができます。

図1：チャンバースライド中の細胞外マトリックスゲルスポットは、（A）簡単操作のため、100ミリメートルペトリ皿に8ウェルチャンバースライドを配置します。ピペットで10μlの細胞外マトリックスの各チャンバ内のゲルと冷たい面（7分）の上に置きます。過剰な細胞外マトリックスG後（B）チャンバースライドELが除去されます。

図2：側面図で動物の咬筋の解剖（A）ヘッド。耳（E）、耳下腺（P）と、顔面神経（VII）。 （B）咬筋（MS）と頭筋（T）の表面的なヘッドの腱腱膜（TE）。ピンセットでその挿入から腱を分離します。 （C）慎重に下顎骨の枝でその挿入まで筋肉を解剖。 E：耳、P：耳下腺、VII：顔面神経、T：頭筋、MS：咬筋の表面的なヘッド、テ：腱、融点：咬筋の深いヘッド。

図3：二腹筋の後方腹の解剖（。仰臥位での動物のA）ヘッド。顎下腺（SG）、咬筋（M）、顔面神経（VII）と胸鎖乳突筋（SCM）をローカライズします。顎下腺を削除します。 （B）二腹筋の前方（AD）および後方腹（PD）をローカライズします。ストレートピンセットで、それをカットし、鼓膜胞（TY）を起源まで慎重に解剖、後部腹の前腱を取ります。 E：耳、Sgは：顎下腺、VII：顔面神経、M：咬筋、SMC：胸鎖乳突筋、AD：前腹二腹筋、PD：後部腹二腹筋、Tyの：鼓膜水疱。

図4：二腹筋（後部腹）の解剖後口蓋帆挙筋筋の解剖（A）一般ビュー。茎突舌骨筋（ST）と挙筋の腱ヴェリの口蓋をローカライズすることができます。その背後に実行されている気管（T）と食道（エス）に注意してください。気管と食道咽頭（P）が露出して昇降した後（B）。軟口蓋に口蓋帆挙筋の挿入が表示されるようになりました。矢印は、両側の口蓋帆挙筋の筋肉と解剖軟口蓋を示しています。 E：耳、セント：茎突舌骨筋、VII：顔面神経、M：咬筋、AD：前腹二腹筋、PD：後部腹二腹筋、T：気管、エス：食道、P：咽頭、*口蓋帆挙筋。

図5：プロナーゼで酵素消化後の前に筋肉組織（A）の外観と（B）。筋束は酵素消化後に緩めているように見えることに注意してください。

図6：パックス7免疫染色新たに単離したSCが、（約6時間の初期組織消化後の）分離の終了時に細胞外マトリックスゲルに適用されます。五任意のフィールドは、フィールド当たり210細胞の平均で10×対物レンズを用いて計数しました。細胞の約90％がパックス7陽性です。 DAPI：青、PAX7：赤。スケールバーは100μm。

図7：パックス7、MyoDの免疫染色 4日目、7と10の文化をPAX7に対する抗体、およびMyoDの免疫染色で染色しました。 （A - C）と（D - F）4日目の代表的な顕微鏡写真および咬筋から7の文化。 （GとH ）PAX7 ⁺とのMyoD ⁺顕微鏡視野あたりの核の数をカウントし、核（DAPI）の合計数の割合として表しました。 DAPI：青、PAX7：赤、とのMyoD：緑。スケールバー、100μmである。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。

図8：咬筋、顎二腹筋と挙筋ヴェリ口蓋筋から培養物中の単核細胞からの培養物中のPAX7±/ MyoDの±の分布（A - C）4日目、7と10の文化はPAX7に対する抗体、およびMyoDの免疫染色で染色しました。細胞の総数は、核の総数（DAPI）に基づいています。セル画±PAX7±/ MyoDのの（D）データの定量化LS。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。

図9：ミオゲニン免疫染色 4日目、7と10の文化はミオゲニンに対する抗体で染色しました。 （A - D）代表4日目の顕微鏡写真と挙筋ヴェリの口蓋筋から7の文化。 （E）MyoG ⁺顕微鏡視野あたりの核の数をカウントし、核の総数（DAPI）の百分率として表しました。 MyoG +細胞の（F）のデータの定量化。 DAPI：青、ミオゲニン：グリーン。スケールバー、100μmである。 このFIGURの拡大版を表示するには、こちらをクリックしてくださいE。

図10：ミオシン重鎖免疫染色 4日目、7及び10の培養物は、ミオシン重鎖（MyHC）に対する抗体で染色しました。 4日目の代表的な顕微鏡写真、顎二腹筋（DIG）筋から7と10の文化。日に10の長とよく組織化筋管が明らかであるが7日目に、小さな筋管が存在します。スケールバー、200μmである。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。

ビデオ1：筋管けいれんけいれん筋管との2つの代表的なフィールドの例としては、日に二腹筋から10の文化を示しているこのビデオを見るにはこちらをクリックしてください。

ディスカッション

異なるbranchiomeric頭筋からのSCが膨張前および継代することなく、1 9週齢のWistar系ラットおよび細胞外マトリックスゲルスポットの直接培養から単離しました。単離後、細胞を計数し、同じ細胞密度で播種しました。三つの異なる筋の並列単離のために、この方法は、約4時間を要します。培養の汚染を回避するために、重要なステップは、筋肉の切開後、アルコール70％の急激な洗浄です。

SC分離中にそれを小片（約2mm）に筋肉組織を切断するが、これが原因で、細胞損傷の小さい細胞収率をもたらすようにあまりにも多くのミンチを回避することが重要です。また、酵素消化の期間は、さらなる損傷を避けるために、顕微鏡下で慎重にチェックする必要があります。消化の目的は、筋線維を解離することです。単離された細胞の90％以上がPAX7を発現するので、さらなる精製は（ 図6-8）を必要としません。これは、パーコール^39,40、または^41,43をソートfluorescent-または磁気細胞に、コーティングされていない食器^14,37,38にめっき前分画のような他の方法で追加の精製工程を回避します。磨砕のためには、これはSCの機械的な放出を可能にするように、組織断片及びピペット先端の開口部との間に剪断力を誘発することが不可欠です。 （直径チップ内部さ1mm）を10 mlピペットで粉砕が困難である場合は、（直径の先端内側さ2mm）を5mlピペットを最初に使用することができます。あるいは、ガラスパスツールピペットを所望の直径に切断することができ、使用されます。この方法は効率的で、シンプルであり、異なる筋肉サンプルからSCの同時単離を可能にします。

SCに培養プレートは、ゼラチン又はコラーゲンでコーティングすることができるが、我々の以前の研究は、細胞外マトリックスは、コラーゲンゲル³⁸より筋電位の維持のためにはるかに優れていることを示しています。細胞外マトリックスゲルスポットミリサイズ（10μL/ O 2ミリメートルまたは20μL/Ø4ミリメートル）は、細胞の限られた数とSCの増殖および分化の研究を可能にします。分化アッセイのために、約8〜20倍少ない細胞を24ウェルプレート（O 15.6ミリメートル）と比較要求され、より少ない、約80〜200倍を35mmペトリ皿（Ø35ミリメートル^）14,38と比較します。

細胞外マトリックスゲルは高価であるため、この方法は、よりコスト効率的です。また、チャンバースライドは、さらにコストを削減するためにプラスチック製カバースリップで置き換えることができます。チャンバースライドの細胞外マトリックスゲルスポットを一晩乾燥の調製のために不可欠です。細胞外マトリックスゲルスポットが透明であるように、バックライトを使用して下側のスポットをマークする必要があります。チャンバースライドを簡単に操作するためのペトリ皿に固定されています。さらに、細胞培養拡大はSmalのののSCを検討する可能性を提供する、必要はありませんLERの筋肉や小さな筋肉のサンプル。あるいは、より多くの細胞が必要とされる場合は、上記したように、新たに単離したSCSは最初T75フラスコ中で拡大することができるPCRまたは筋肉構築物について、例えば 。

SCがすぐに分離した後、フローサイトメトリーでさらに精製するには適していませんにこのプロトコルを使用して単離しました。プロナーゼによる消化は、表面抗原¹⁴の広範な消化を引き起こします。異なるロット番号を差動筋芽細胞の増殖および分化に影響を与えたように、細胞培養に使用されたウマ血清およびウシ胎児血清は最初に適切に、分離前に特徴付けされなければなりません。

近年では、鰓のアーチとヘッド中胚葉（ 例えば、外眼筋^）24から誘導された筋の関心が高まっています。これは、明らかに頭と手足の筋肉が非常に異なる特性を有することが実証されています。古い動物からの咬筋は再ようです四肢の筋肉^25,26と比較して、その再生能力をTAIN。外眼筋からのSCは頭筋からのSCに匹敵する堅牢な増殖および分化能力を有しており、手足の筋肉のSC ²⁴より大きい生着の可能性を示しています。

ファイバ型分布とミオシン組成物は、筋肉群の間で、また、種間で変化します。ヒトでは第一鰓弓から発信筋肉は心筋を開発するための典型的な低速および高速の両方の繊維（サブタイプIIAおよびIIX）、新生児のミオシンとミオシンが含まれています。げっ歯類では、これらの筋肉は約95％高速繊維ミオシンIIAおよび^{IIb）44-46を}含んでいます。鳥類の筋肉の研究は、異なる筋線維タイプからSCSが分化能が変化することを示しています。遅い繊維からのSCSは、両方のファイバタイプ⁴⁷に分化することができるしながら高速繊維からのSCのみ、速筋線維に分化します。また、速筋におけるSCの割合繊維は、遅筋線維^48,49におけるよりも低いです。これは、ファイバ型分布は頭蓋顔面領域の筋肉の研究のために考慮されなければならないことを示しています。口蓋裂の筋肉と同様に、げっ歯類におけるLVPは、ほぼ独占的に高速繊維^50が含まれています。そのため、LVPからのSCは、口蓋裂の分野での前臨床試験に適しています。

このプロトコルは、branchiomeric頭の筋肉や他の小さい筋肉や小さい筋肉サンプルから誘導されたのSCを研究するための新たな可能性を提供しています。これは、口蓋裂などの状態で顎顔面領域にも小さい筋肉に影響を与える他の条件の筋肉の再生を改善するための新しい治療法の開発を容易にします。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hypodermic Needle 25 G 0.5 x 25 m	BD Microlance	300400
Dissecting scissors	Braun	BC154R
Micro forceps straight	Braun	BD330R
Surgical Scalpel Blade No. 15	Swann-Morton	0205
Alcohol 70%	Denteck	2,010,005
Permanox Slide, 8 Chamber	Thermo Scientific	177445
6 well cell culture plate	Greiner bio-one	657160
Cell Culture Dishes (100 x 20 mm)	Greiner bio-one	664160
15 ml sterile conical centrifuge tube	BD Biosciences	352097
50 ml sterile conical centrifuge tube	BD Biosciences	352098
Cell strainer (40 μm)	Gibco	431750
10 ml serological pipette	Greiner bio-one	607180
20 µl FT20	Greiner bio-one	774288
Matrigel, Phenol-Red Free	BD Biosciences	356237	10 ml
Pronase	Calbiochem	53702	10 KU
Phosphate Buffered Saline	Gibco	14190-144	500 ml
Dulbecco's Modified Eagle Medium, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate	Gibco	10569-010	500 ml
Fetal Bovine Serum	Fisher Scientific	3600511	500 ml
Horse Serum	Gibco	26050088	500 ml
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml)	Gibco	15140-122	100 ml
Chicken Embryo Extract	MP Biomedicals	2850145	20 ml