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要約

We describe here a cost-efficient granzyme expression system using HEK293T cells that produces high yields of pure, fully glycosylated and enzymatically active protease.

要約

When cytotoxic T lymphocytes (CTL) or natural killer (NK) cells recognize tumor cells or cells infected with intracellular pathogens, they release their cytotoxic granule content to eliminate the target cells and the intracellular pathogen. Death of the host cells and intracellular pathogens is triggered by the granule serine proteases, granzymes (Gzms), delivered into the host cell cytosol by the pore forming protein perforin (PFN) and into bacterial pathogens by the prokaryotic membrane disrupting protein granulysin (GNLY). To investigate the molecular mechanisms of target cell death mediated by the Gzms in experimental in-vitro settings, protein expression and purification systems that produce high amounts of active enzymes are necessary. Mammalian secreted protein expression systems imply the potential to produce correctly folded, fully functional protein that bears posttranslational modification, such as glycosylation. Therefore, we used a cost-efficient calcium precipitation method for transient transfection of HEK293T cells with human Gzms cloned into the expression plasmid pHLsec. Gzm purification from the culture supernatant was achieved by immobilized nickel affinity chromatography using the C-terminal polyhistidine tag provided by the vector. The insertion of an enterokinase site at the N-terminus of the protein allowed the generation of active protease that was finally purified by cation exchange chromatography. The system was tested by producing high levels of cytotoxic human Gzm A, B and M and should be capable to produce virtually every enzyme in the human body in high yields.

概要

Gzmsは、CTLおよびNK細胞1の専門リソソームに局在高度に相同性セリンプロテアーゼのファミリーです。これらのキラー細胞の細胞傷害性顆粒はまた、排除2,3宛の標的細胞の認識にGzmsと同時にリリースされる膜破壊するタンパク質PFNとGNLYが含まれています。 （ - G、K、MおよびN GZMA）ヒトにおける5 Gzms（GZMA、B、H、KおよびM）、およびマウスでの10 Gzmsがあります。 GZMAとGZMBは最も豊富で広くヒトおよびマウス1で研究されています。しかし、最近の研究は、細胞死経路、ならびに健康と病気4の他、いわゆるオーファンGzmsによって媒介される追加の生物学的効果を検討し始めています。

PFN 5,6によって標的細胞に送達されたときGzmsの最もよく知られている機能は、GZMAおよびGZMBの、特に哺乳動物細胞におけるプログラム細胞死の誘導です。しかしながら、より最近の研究はまた、PFN 7,8によって独立細胞質ゾルデリバリーの、免疫調節および炎症に計り知れない影響を与えGzmsの細胞外効果を実証しました。 Gzmsの細胞質ゾルのエントリの後に効率的に殺された細胞のスペクトルはまた、最近、細菌9,10、さらには特定の寄生虫11に、哺乳動物細胞から広がりました。これらの最近の発見は、Gzmの研究者のための全く新しい分野を開きました。そのため、コスト効率、高収量哺乳動物発現系は、かなりのもの、将来の研究のための方法を容易にします。

天然ヒト、マウス、ラットGzmsが正常にCTLおよびNK細胞株12-14の顆粒画分から精製されています。しかし、我々の手で、このような精製技術の収量は0.1mg / L未満の細胞培養物（未発表の観察及び12）の範囲内です。また、パーソナルプラグインによる汚染のない単一Gzmのクロマトグラフィー分割R Gzmsおよび/ ​​または顆粒中にも存在するタンパク質は、（未発表データと12,14）に挑戦されています。組換えGzms 16は、酵母、昆虫細胞は17とでさえ、このようなHEK 293 18,19などの哺乳動物細胞において、細菌15で製造しました。のみが哺乳動物発現系は、天然の細胞毒性タンパク質と同じ翻訳後修飾を有する組換え酵素を産生する可能性を負います。翻訳後修飾は、エンドサイトーシスによる特異的な取り込みおよび標的細胞20-22内のプロテアーゼの細胞内局在に関与しています。したがって、Gzm発現のためのプラスミド骨格としてpHLsec 23（ラドゥAricescuとイヴォンヌ·ジョーンズの寄贈、オックスフォード、英国の大学）を使用することにより、我々は、高収量のタンパク質産生のための簡単な、時間とコスト効率の高いシステムを構築しましたHEK293T細胞。 pHLsecは、ニワトリΒアクチンプロモーターとCMVエンハンサーを組み合わせました。一緒に、これらの要素はdemonstraテッド種々の細胞株24最強のプロモーター活性。また、プラスミドは、ウサギΒグロビンイントロン、最適化されたKozakおよび分泌シグナル、Lysの-の6xHisタグおよびポリAシグナルが含まれています。インサートは分泌シグナル、適切なN末端 ​​ドメインを欠くタンパク質の最適な発現および分泌の効率を確保するのLys-の6xHisタグ（ 図1）との間で簡便にクローニングすることができます。 EK処理が分泌Gzmsを活性化（アクティブGzmsは、N末端で始まるようにGzmsの発現のために、我々は、エンテロキナーゼ（EK）のサイト（DDDDK）、続いて、ベクターが提供する分泌シグナルと内因性の分泌シグナル配列を置換しアミノ酸配列IIGG 25）。さらに、この方法のために有利なように、HEK293T細胞は、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）で、低価格媒体中で急速に成長し、コスト効率の高いカルシウムリン酸トランスフェクション法に適しています。

プロトコル

発現プラスミドpHLsec-Gzm 1.生産

  1. 適切なRNA単離法を用いて、ヒトNK細胞（一次細胞は、すべての5人のGzmsを発現するNK-92 26またはNK細胞株のように調製した）からの総RNAを調製し、第一鎖cDNAを合成しキットを用いての逆転写反応、manufacturer`以下の提言。 23（ラドゥAricescuとイヴォンヌ·ジョーンズの種類のギフト、オックスフォード、英国の大学）に記載されているように（ 図1）をAgeI及びKpnI部位を使用してpHLsecにPCRおよびクローンを使用してGzm cDNAを増幅。
    注： 表1に示し、以下のプライマーを使用してください。
  2. 配列決定によって正しい挿入を確認してください。 DH5α細胞中で発現プラスミドを展開し、エンドトキシンフリープラスミド単離キットを用いて精製し、製造者の指示に従ってください。
  3. を2mg / mlの濃度でエンドトキシンフリー滅菌水で精製したプラスミドを再懸濁し、店で-20°C untiL使用。

HEK293T細胞におけるGzmsの2式

  1. 試薬の調製
    1. 標準的な培養培地を準備します。ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）を含有する高グルコース（25ミリモル）、グルタマックス（4ミリモル）に、ピルビン酸ナトリウム（1mM）を（標準のウシ胎児血清（FCS）、ペニシリン（100単位/ ml）、ストレプトマイシンの10％を加えます100μg/ mlの）。
    2. トランスフェクション培地を準備します。ペニシリン - ストレプトマイシンを含まない培地に25 / mlのクロロキン（-20℃で保存し、PBSで1,000倍の株式、からトランスフェクションの日に、新たに追加）を追加します。
    3. 無血清培地を準備します。無血清培地にHEK293細胞は、グルタミン（4 mM）の、ペニシリン（100単位/ ml）、ストレプトマイシン（100μg/ mlの）、および2.5mgの/ LのアンホテリシンBを追加するため
    4. 表2に記載されたソリューションを用意し、使用前に0.45μmのフィルターでフィルター：
  2. HEK293T細胞を拡大
    1. 20ミリリットルカルトにHEK293T細胞を成長させます150×25 mm組織培養皿を用いてURE媒体。
    2. 80％の密集度で分割細胞（1のスプリット比：4、通常3日毎）。細胞が緩く取り付け、それらは機械的に厳密に上下にピペッティングによりトリプシン処理せずに取り外すことができます。
    3. プレートの細胞は、トランスフェクション前日に、トランスフェクション（播種密度約2×10 5細胞/ ml）の日に60〜70％の集密度を得ました。通常の準備のサイズは20〜25培養皿で構成されています。
  3. リン酸カルシウムトランスフェクション
    1. トランスフェクションの1時間前には、20ミリリットルのトランスフェクション培地に標準的な培養培地を変更します。この1時間のインキュベーション工程の終わり近く、10.95ミリリットルののddH 2 0〜50 mlチューブ中2MのCaCl 2の1.55ミリリットル（1チューブ/ 5皿）でプラスミドDNA400μgのを混ぜます。
    2. トランスフェクションの前に1〜2分、DNA-カルシウム溶液12.5 mlに2×HBS 12.5ミリリットルを加え、チューブの反転により混合し、室温で30秒間インキュベートします。
    3. 目を追加します。Eの混合物を滴下培地中に、細胞（皿当たり5ミリリットル）に直接2.3.2に用意しました。ややオレンジ色に培地を回し、全領域に均等に振りかけます。
    4. 組織培養インキュベーター（37℃、加湿空気中5％CO 2）で7から11時間、培養皿をインキュベートします。インキュベーション後、微細な沈殿物が見えます。予め温めておいたPBSで丁寧に洗い流し、トランスフェクション培地を除去し、2.1.3で調製した20ミリリットルの無血清培地を追加します。組織培養インキュベーター中で72時間インキュベートします。
    5. SDS-PAGE上での細胞の上清のサンプル（〜20μl）を実行し、グランザイムバンドを可視化するために、クマシーブリリアントブルーで染色することにより、トランスフェクション及び発現効率を分析します。
  4. ニッケルIMACにより培養上清からのGzmsの精製
    1. インキュベーション後、250ミリリットルチューブに細胞培養上清をデカントし、遠心分離により明確。最初のスピンを行う（400×gで、10分間、4°剥離した細胞からの培地をクリアしますC）。残りの細胞破片を除去し、4℃で4,000×gで、30分で新鮮な250ミリリットルチューブとスピンで上清を転送します。
    2. 5 M NaClを5mlの、透明な上清の250ミリリットル当たり0.25 MのNiSO 4の6.25 2 M Tris塩基（pHは8）のミリリットルと1ミリリットルを追加します。 500ミリリットル真空フィルターユニット（0.45 mm）を用いて上清をフィルタリングします。
    3. 適切なFPLCシステムを使用して彼の結合緩衝液A（10カラム体積、CV）とニッケルIMACカラムを平衡化します。
    4. 4℃で0.5ml /分の流速で平衡化したカラムに透明な上清を適用します。
    5. 上清を適用した後、UV吸光度がベースラインに達するまで、（通常、10 CV）のHis結合バッファーでカラムを洗浄します。
    6. 0.5ml /分の流速で20ミリリットルの線形勾配（0~250 mMイミダゾール）で溶出Gzms 2ミリリットル画分を収集しました。 SDS-PAGEおよびクーマシー染色により溶出画分を分析します。
  5. エンテロキナーゼ（EK）治療および陽イオン交換クロマトグラフィーによる最終クリーンアップ
    1. ≤10MWCOに透析チューブ内の画分を含むプールGzm。前EK制御などの-20℃での少量のサンプルを保管してください。
    2. 透析チューブに直接にプール画分に0.02単位/初期上清を50 mlのEKを追加して、O / N EK-バッファーで室温、（少なくとも16時間）（4 L、一度変更バッファ）を透析。
    3. 次の日、EKは、SDS-PAGEおよびクマシー染色による事前EKコントロールと比較してGzmsを処理し分析します。
    4. N末端の処理が完了すると、SバッファーA（4 L）に透析緩衝液を変更して、室温でさらに4時間透析します。フィルター透析液（0.45ミクロン）。
    5. 4℃で0.5ml /分の流速でカラムにサンプルをロードS緩衝液AでS-カラムを平衡化します。
    6. UV吸光度のベースラインに達するまで、試料ローディングの後、（約10 CV）S緩衝液Aでカラムを洗浄します。 30ミリリットルの直線勾配（150〜1000 mMのNaCl）でGzmsを溶出。 GZMA E〜750mMのNaClで〜700mMのNaClおよびGzmMで〜650のNaCl、GZMBでリュート。
    7. SDS-PAGEおよび比色アッセイ（下記参照）による溶出画分を分析します。 Gzmsおよび濃縮物を含むプール画分（約30倍、約100μMの濃度に）スピンフィルターで（15ミリリットル、10 MWCO）。 -80℃で濃縮さGzm製剤およびストアを等分。

3.テストGzm活動

  1. 試薬の調製
    1. 50mMのトリス塩基、pHは7：比色アッセイ緩​​衝液を準備します。
      1. GZMAの測定のために、0.2mMの及び5,5'-ジチオ - ビス（2-ニトロ安息香酸）の最終濃度までアッセイ緩​​衝液へのNa-CBZ-L-リジンをチオベンジルエステル（S-Bzlの）（BLT）を追加0.22 mMの濃度に（DTNB）。 GZMBについては、0.2 mMののBoc-ALA-ALA-ASP-S-Bzlの（AAD）および0.22 mMのDTNBを含みます。 GzmMについては、0.2 mMのあるSuc-ALA-ALA-PRO-Leuの-p-ニトロアニリド（PNA）（AAPL）が挙げられます。合成ペプチドは、DMSO中で（適切なストック溶液から追加され、STORアッセイの前に、新たにバッファに）-20°Cで編。
    2. 切断アッセイバッファーを準備します。100mMのNaCl、50mMのトリス塩基、pHは7.5
  2. 比色アッセイ
    1. 96ウェル平底プレート中の溶出画分または濃縮されたストックから小さなGzmサンプル（<5μl）を配布します。ポジティブコントロール（試験したGzm製剤または粗製のNK細胞溶解物）および陰性コントロール（緩衝液のみ）も含めます。
    2. （マルチチャンネルピペットを使用して）各ウエルに、アッセイ緩​​衝液100μlを加えます。 37℃で10分間インキュベートします。マイクロプレートリーダーで405nmでODを測定します。
  3. 切断アッセイ
    1. 精製された基板を使用して切断アッセイのために、タンパク質基質を共インキュベート（天然または組換え、100から400 nMの、効率的なGzm基板のいくつかの例は、このセクションの最後に結果の項でノートに示されている）の連続希釈でGzmの様々な時間のためにアッセイ緩​​衝液で（400nmで開始します）。SDS-PAGEおよびクーマシーまたは銀染色によって分析します。または特異的抗体を用いたウェスタンブロッティングによって。
    2. 細胞溶解物を使用して切断アッセイのために、37℃で三回でエタノール/ドライアイス浴融解に凍結することによってアッセイ緩衝液と溶解1ml中10 6のHeLa細胞（または任意の利用可能な腫瘍細胞株）をサスペンド。 （4°Cで10分間15,000×gで）を、遠心分離によって細胞破片を除去。
    3. 上記のように様々な濃度と時間でGzmsでクリアした溶解物を共インキュベートします。切断は、適切な抗体を用いたイムノブロッティングによって検出されます。
      注：市販の抗体が利用可能な善意の基板のいくつかの例：GZMB 27,28によって切断入札（BH3相互作用ドメイン死アゴニスト）およびカスパーゼ3; GZMA 29によって切断され、複数の異種核リボ（hnRNPA1、A2およびU）; GzmM 30によるサイトメガロウイルスリンタンパク質71。

結果

次のセクションでは、この方法を照明するGZMA準備の完全なドキュメントを紹介します。また、正常に精製効率および活性に関して同様の結果を生成する、GZMBとGzmMを精製しました。しかし、それらの後に調製物から、我々は、データの選択したいくつかの作品が表示されます。現在のプロトコルに従って293T細胞からGZMB調製物は、様々な生物学的ア ​​ッセイ系9,29,31-34でそれらの活?...

ディスカッション

GZMAとGZMBの古典と広範囲に研究の役割は、孔形成タンパク質PFN 1によるそれらのサイトゾル送達後、哺乳動物細胞におけるアポトーシスの誘導です。最近、Gzmsの細胞傷害性スペクトルは、細菌9,10、ならびに特定の寄生虫11に、哺乳動物細胞から大幅に広がりました。また、GZMAとGZMBの非古典的、細胞外の機能だけでなく、様々な孤児Gzmsの生物学的意義は依然として不?...

開示事項

The authors have nothing to disclose.

謝辞

This work was supported by grants from the Novartis Foundation for Medical-Biological Research and from the Research Pool of the University of Fribourg (to MW). We thank Li Zhao, Zhan Xu, and Solange Kharoubi Hess for technical support, as well as Radu Aricescu and Yvonne Jones (Oxford University, UK) for providing the pHLsec plasmid, and Thomas Schürpf (Harvard Medical School) for helpful discussions.

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
TRIzol ReagentInvitrogen15596-026Total RNA isolation kit
SuperScript II Reverse TranscriptaseInvitrogen18064-014
Phusion High-Fidelity DNA PolymeraseNEBM0530L
EndoFree Plasmid Maxi KitQIAGEN12362
EX-CELL 293 Serum-Free Medium for HEK 293 CellsSigma14571C
DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvateGibco31966-021
SnakeSkin Dialysis Tubing, 10K MWCOThermo Scientific68100
Enterokinase from bovine intestineSigmaE4906recombinant, ≥20 units/mg protein
HisTrap Excel 5 ml columnGE Healthcare17-3712-06 Nickel IMAC
HiTrap SP HP 5 ml columnGE Healthcare17-1152-01 S column
N-α-Cbz-L-lysine thiobenzylester (BLT)SigmaC3647GzmA substrate
Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl (AAD)MP Biomedicals2193608 _10mgGzmB substrate
Suc-Ala-Ala-Pro-Leu-p-nitroanilide (AAPL)BachemGzmM substrate
5,5′-dithio-bis(2-nitrobenzoic acid) (DTNB)SigmaD8130Ellman`s reagent

参考文献

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