コマーシャルからの副産物としてアルケノンの単離とバイオディーゼル生産のための実験プロトコール<em&gt;イソクリシス</em&gt;藻類バイオマス

要約

詳細な方法は、市販のイソクリシス微細藻類からの貴重な副産物としてアルケノンの同時分離と一緒にバイオディーゼルの生産のために提示されています。

要約

再生可能な、より環境的に持続可能な供給源からの選択肢で石油燃料を交換する必要性がますます重要です。バイオマス由来のバイオ燃料は、この点でかなりの注目を集めている、トウモロコシのエタノールやダイズバイオディーゼルなどの食用作物からしかし、第一世代バイオ燃料は、一般的に好意から下落しています。国内の優れた非食用源から液体燃料を製造するための方法の開発に大きな関心が存在します。ここでは、海洋微細藻類のイソクリシスから精製したバイオディーゼルの生産のための詳細な手順を説明します。また、多価不飽和長鎖アルケノンとして知られている脂質のユニークなスイートは、バイオディーゼル生産のコストを相殺するために潜在的に価値のある副産物として並列に単離されます。 イソクリシスのマルチキログラム量は2市販の供給源、最初の処理に先立って乾燥させる湿潤ペースト（80％水）として1、およびOTから購入されています彼女の乾燥粉砕した粉末（乾燥95％）。脂質は、伝統的な脂肪（ すなわち、トリグリセリド、w / wで46-60％）およびアルケノン（16-25重量/重量％）の両方を含む藻類油（「ヘキサン藻類油」）を生成するソックスレー装置においてヘキサンで抽出します。藻類油中のトリグリセリドの鹸化は、アルケノン含有中性脂質から得られた遊離脂肪酸（FFA）の分離を可能にします。 FFAは、その後アルケノンを単離し、結晶化による中性脂質から精製され、一方、酸触媒エステル化によって（ すなわち 、脂肪酸メチルエステル、脂肪酸メチルエステル）をバイオディーゼルに変換されます。我々は、高い多価不飽和脂肪酸含量（w / wの約40％）によって特徴付けられる、両方の商業イソクリシスのバイオマスからバイオディーゼルは、類似するが同一でないFAMEプロフィールを有することを示しています。ヘキサン藻類大井の低い量にさかのぼることができイソクリシス湿潤ペースト（w / wの対12％7％w / w）の、から起動する場合には、バイオディーゼルの収率は一貫して高かったです粉末イソクリシス製品から得られるリットル。

概要

最近、特に、バイオディーゼル¹および他のバイオマス由来の油のような液体燃料の生産のために、藻類からバイオ燃料への関心の偉大な復活がありました^。2案の利点は、燃料論争³と伝えられる高い生産性対特定の食品の回避を含みます従来の農作物よりもおよびCO ₂緩和機能を提供します。これは、次の⁴ほぼ20年米国部のエネルギーの水生生物種プログラム（ASP）は、藻類からの輸送燃料を調査する目的で1978年に開始しました。シーハンさんのレポートで概説したように^、5プログラムは、投影されたコストは、その時点（バレルあたり$ 18.46（159 L））で原油と競合しなかった主な理由は、1996年に終了しました。石油のコストは、藻類バイオ燃料研究にルネサンスに接続されている（2014年にバレル当たり$ ^87.39）6、いくつかの時間それ以来、劇的に増加したがaveが、それにもかかわらず、藻類バイオ燃料はコストがかかりすぎることを証明します。バイオ燃料生産コストを相殺するための⁷つとしての戦略を、付加価値の副産物の概念はのための重要な理由の一つとして、両方の批評家^7,8と支持者^9,10と機能の間で浮上していると主張しました米国エネルギー省（DOE）「国家藻類バイオ燃料技術ロードマップ」の藻類バイオ燃料を追求^。11

ここでは、商業イソクリシスの微細藻類からの二つの別々の燃料流の共同制作のための方法を説明します。我々は、それがすでに工業的に生産されるので、部分的にはイソクリシスに焦点を当てた養殖のために採取し、そしてまたイソクリシスは、従来の脂質（ すなわち、脂肪酸）に加えて、独特のクラスを生合成藻類のわずか数種の一つであるためいます多価不飽和長鎖アルケノンとして知られている化合物は^、12アルケノンの構造は非常にLによって特徴付けられますオング炭化水素鎖（36-40炭素原子）、二つの非メチレン〜4は、 トランス -二重結合を遮断し、メチルまたはエチルケトン（ 図1）。アルケノン不飽和は、二不飽和C37メチルアルケノン（いわゆる"不飽和指数」）の割合は、過去の海面温度の代用として使用することができること^13,14、例えば、藻類成長温度に敏感である^{15 - 20}アルケノンされます細胞質脂質体中に存在するとトリグリセリド（タグ）をより豊富であることができると思った。窒素やリンの制限の下で^21,22、最大定常期における細胞炭素の10から20パーセントにアルケノンとして蓄積されている^。23,24から進化の観点から、そのトランス -二重結合の幾何学的形状は、エネルギー貯蔵のより安定した形を提供するため、アルケノン、タグよりも好まれている場合があります^。21

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図ポリ不飽和長鎖アルケノンの1構造共通アルケノンメチル37：長い炭化水素鎖長例示イソクリシスから単離した3（35 - 40個の炭素）を、 トランス非メチレン中断二重結合を、メチルまたはエチルケトンで終端します。 ＃炭素数を指す：命名法は、＃は脂肪酸に似ている。二重結合の数をこの図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

私たちは、アルケノンは、工業栽培の歴史を持つ一般的な藻類から有望な再生可能な炭素原料を表していると主張している^。25バイオディーゼルはイソクリシスの総脂質抽出物から直接製造は、アルケノンと汚染のかなりの量（w / wの10から15パーセント）によるが含まれていますこれらの高融点化合物は、乏しい低温流動燃料特性をもたらします。しかし、トンを使用して、彼はここで説明けん化/抽出技術、アルケノンを除去し、二次生成物の流れを生成しながら、バイオディーゼルの品質を向上させることにより回収することができます。最近では2ブテン（butenolysis）との交差メタセシスによる液体燃料へのアルケノンの変換を実証した^。26 butenolysis反応は、商業ルテニウムメタセシス重合開始剤を用いた低温で急速に発生し、きれいにジェット燃料の予測可能な混合物を提供します範囲の炭化水素です。この反応は、商業的に実行可能なイソクリシスのバイオ燃料生産のための「バイオリファイナリー」アプローチ²⁷に向かって最初のステップを示す、脂肪酸からバイオディーゼル合成と並行して行われます。

プロトコル

1.微細藻類とバイオマスの準備

注：海洋微細藻類のイソクリシスSPを。本研究で使用される「T-イソ」は購入することができます（材料のリストを参照してください）​​。 イソクリシスのマルチキログラム量は約80％の水と20％のバイオマスを含む凍結した湿潤ペースト（ 磯 -paste）として購入し、海の刺激臭の臭いと色のダークグリーン/近い黒であることができます。 イソクリシスもできます同じような匂いで乾燥（95％乾燥）、黄褐色粉末（ 磯 -powder）として購入すること。

1. はさみを使用して、プラスチック包装の隅に2インチの穴- イソクリシスペーストを乾燥させるために、1を切断して1キロのパッケージを開きます。
2. このイソクリシスの約300グラムをつまんで薄い層（〜20ミリメートル）を作成するために、結晶皿のx 75ミリメートル150ミリメートルに穴を通って貼り付けます。
3. それは（一般的に、48乾燥してフレーク状になるまで室温で空気乾燥にペーストを残します -96時間）。
   注：実際の乾燥時間が異なり、温度に依存している場合があります。しかし、違いは（最大2週間）であっても、より長い乾燥時間と歩留まりや製品品質に認められませんでした。乾燥工程は、より均一に、および/またはウォームプレートに結晶皿を配置することによって加速することができる（30 - 40°C〜）。
4. スパチュラを用いて結晶皿から乾燥バイオマスをスクレイプし、セルロース抽出シンブル（長さ：123ミリメートル、43ミリメートルのID）に収集します。ドライイソクリシスバイオマスの重量を記録します。

ドライイソクリシスバイオマスの2ソックスレー抽出

1. ソックスレー抽出装置に- （60グラムの乾燥バイオマス典型的には50） イソクリシス -含有セルロース抽出シンブルをロードします。
2. 溶剤の色が暗緑色から消えてしまうまで（48時間 - 、ヘキサン（400ml）でソックスレーフラスコを埋める凝縮水や熱源をオンにし、24サイクルにソックスレーを許可）かすかな黄色。
3. 熱をオフにして、装置は、ソックスレー抽出器からフラスコを外した後、室温まで冷却します。
4. ロータリーエバポレーターを用いてヘキサンを削除し、ヘキサン抽出可能物質（「ヘキサン藻類油」（H-AO））の重量を記録します。

3.藻類油の鹸化および脂肪酸および中性脂質の分離

1. メタノールを用いて上記のステップ2.4​​から同じ丸底フラスコにH-AOを再溶解：ジクロロメタン（2：藻類油の1、体積= 10×質量）。
2. 攪拌棒を加え、還流冷却器を取り付け（コイル500ミリメートルの長さ）。
3. 追加のH ₂ O（体積=藻類油の2.67質量X）およびKOH（50％藻類油w / w）の、3時間60℃で撹拌しながら内容物を加熱します。
4. 室温に冷却した後、ロータリーエバポレーターで有機溶媒（メタノール、ジクロロメタン）を除去します。
5. 1に注ぐことにより、残りの水性混合物を移し-L分液漏斗。 、（水溶液中に体積が相当）ヘキサンを追加し、分液漏斗を振るし、層を分離することができます。
6. 三角フラスコに下部の水層を排出し、そして別々の三角に上部有機相を捨てます。
7. 有機層は、（一般的に1-2回以上）無色になるまで繰り返し、3.5と3.6を繰り返します。
8. 緑がかった固体として中性脂質を分離するために、ロータリーエバポレーター上で合わせた有機抽出物を濃縮する（融点≈60 - 70°C）。
9. （pH紙によって示されるようにpH約2になるまで6 M、）HClで水相を酸性化。
10. ステップ3.5および3.6に記載されているように1 Lの分液漏斗を使用してヘキサンで酸性化した水相からの遊離脂肪酸（FFA）（水相に等量）を抽出します。
11. 近い黒暗緑色油状残渣（> 30℃の温度で液体）としてのFFAを得るために、ロータリーエバポレーター上でヘキサンを除去します。

4。遊離脂肪酸のエステル化酸触媒とグリーンバイオディーゼルの生産

1. メタノールを用いてのFFAを転送：クロロホルム（1：1、藻類油の6×容積）最初のFFAを溶解した後、撹拌棒を備えた肉厚高圧反応フラスコに注ぐことによって。
2. 濃H ₂ SO _4（藻類油w / wの20％）を加え、フラスコを密封し、1時間攪拌しながら90℃まで混合物を加熱します。
3. 室温に冷却した後、分液漏斗に注ぐことによって混合物を移します。
4. 、H ₂ O（藻類油の2×量）を追加し、分液漏斗を振る、そして相を分離することができます。
5. 予め秤量した丸底フラスコに下層を排出し、ロータリーエバポレーターで濃縮します。得られたバイオディーゼルの質量を記録します。
6. DB-88 [（88％cyanopropy装 ​​備炎イオン化検出器^{（GC-FID）28（}ガスクロマトグラフを用いてガスクロマトグラフィーにより脂肪酸プロフィールを分析しますリットル）methylarylpolysiloxane]カラム（0.25ミリメートルのIDのx 0.20μmの膜厚30 MX）。
   注意：一般的な脂肪酸メチルエステルは、商業的に得られた真正サンプルと保持時間を比較することによって検証されます。また、ガスクロマトグラフィー - 質量分析（GC-MS、質量選択検出器に接続されたガスクロマトグラフ）は、C18などのコンポーネントを分析するために、温度プログラム及びカラムの同じ条件下で行われる：4いるない真正標準が利用できない結果を適用してGC定量します。

5.バイオディーゼル脱色

1. 攪拌棒を備えた丸底フラスコ中で60℃で暗緑色のバイオディーゼル燃料を加熱します。
2. モンモリロナイトK 10（MK10）粉末（バイオディーゼルのw / wの百分の10から20まで）を追加し、1時間撹拌します。
3. 熱から丸底を外し、溶液を室温まで冷却します。
4. 丸底フラスコからなるろ過装置を準備し、楽しみをフィルタリングネルは、セルロース濾紙（アッシュ0.007％）を含み​​ます。
5. 丸底フラスコをすすぐためにヘキサンの最小量を使用してフィルタ漏斗を通して冷却脱色バイオディーゼルを注ぎます。
6. 丸底フラスコからフィルター漏斗を外します（これは今脱色バイオディーゼルのヘキサン溶液を含有する）とオレンジ/赤のバイオディーゼルを得ロータリーエバポレーターでヘキサンを除去します。
7. 不溶性物質のいくつかの沈降（〜10％w / wの）が発生します、その間に4°Cで保存するサンプル。
8. 分析のための明確な均質なバイオディーゼル燃料を生産するためにステップ5.4および5.5に記載されているようにデカンテーションまたは濾過により不溶物を除去します。

中性脂質から6の単離とアルケノンの精製

1. ジクロロメタンの最小量（10 gで中性脂質に対して約50ml）中（ステップ3.8）、中性脂質を溶解し、クロマトグラフィーカラム（O.の上部にピペットで溶液を加えますシリカゲル（230-400メッシュ100 g）を含むD 60ミリメートル、ID 55ミリメートル、長さ18 "）。
2. 溶媒としてジクロロメタン（約150 ml）を用いて、圧力（約5 PSI）でシリカを通して溶液を溶出し、250mL丸底フラスコ中で溶離液を集めます。
3. オレンジ色の固体を得、ロータリーエバポレーターでジクロロメタンを除去します。
4. 溶液が均一になるまで（総体積〜150mL）で沸騰ヘキサン増分追加量続く沸騰ヘキサン約100mlを添加することによって固体使用ヘキサン再結晶化。そして、ゆっくりと結晶化を促進するために、溶液を室温まで冷却します。
5. フラスコをすすぎ、冷（0℃）のヘキサン少量を用いて、ステップ5.4に記載のように濾過装置を用いて結晶化アルケノンを集めます。

結果

処理に先立って、 イソクリシスペースト （ イソペースト）を最初に乾燥させました。これは便利に大きな結晶皿にISO -pasteを追加し、室温で空気乾燥に材料を可能にすることによって、より大きな規模で達成しました。乾燥中に、いくつかのプールされた水の形態は、乾燥プロセスを加速するためにデカンテーションまたはピペットにより除去することができる（一般的に着色された赤みがかりました）。後約48から96時間、今乾燥イソクリシスは結晶皿の外に掻き取り、海藻のような臭い（ 図2）と緑/黒の薄片状物質として得ることができました。乾燥バイオマスの収量は、w / wのアドバタイズとしてペーストより一般的に20％でした。対照的に、粉末イソクリシス物 （ イソ粉末）を黄褐色、微粉砕、さ ​​らに処 ​​理することなく直接使用した乾燥粉末（95％乾燥）（ 図2）でした 。

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商業イソクリシス 。 イソクリシスペースト （80％ウェット） の図2.比較は結晶皿の底部に沿って広がり、処理する前に、48から96時間、室温で空気乾燥に委ねられています。得られた乾燥イソクリシスは、市販の乾燥粉末イソクリシス （左）よりも外観が異なっている暗い色の薄片状物質（右）として得られる。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

ヘキサンでソックスレーにより乾燥磯 -pasteまたはイソ粉末のいずれかの抽出は、ヘキサンを除去した後に、与えた、としてダークグリーン/ニア黒の固体（融点外観が似ていた藻類油（H-AO）。〜50 -60°C）。ペースト（「 イソペースト-HAOから出発したh-AOの収率イソ粉末-HAO」）wの15％であった/「商用粉末イソクリシス （のソックスレー抽出によりH-AOの収率は一方^）26、我々の以前の結果と一致し、一般的にw / wの乾燥イソクリシスバイオマスの20％でした" W（ 表1）。

生成物（G）	磯 -paste	-powder-1 イソ	-powder-2 イソ
乾燥バイオマス	30	20	20
ヘキサン藻類油	5.86	2.87	3.11
FFAを	3.52	1.34	1.38
中性脂質	2.34	1.38	1.61
アルケノン	0.94	0.63	0.74
注：イソ粉末-1及びイソ粉末2は、並列に処理された粉末イソクリシスの二つの試料からの結果を表します。アイソペーストから、これらの製品の収率で他の報告については参考文献26、32、および33を参照してください。

表1。 商業イソクリシスバイオマスから生成物の収率。

H-AOでアシルグリセロールは、メタノール/ CH ₂ Cl ₂中のKOH水溶液を添加して、対応する水溶性のカルボン酸塩（ 例えば、石鹸）に変換しました。アルケノンを含む中性脂質は、その後ヘキサンで選択的に分配することにより、この水性混合物から抽出しました。中性脂質を除去した後、石鹸の再酸性化は、その後、同様に水溶液から抽出することができ、対応する遊離脂肪酸（FFA）製造しましたヘキサンでueous相。 イソペーストHAOまたはアイソ -powder-HAOのいずれかからの結合のFFAおよび中性脂質の全体的な質量回収率は定量的に近く、一貫していました。しかしながら、生成物の比率（ すなわち、中性脂質+のFFA）が異なっていました。 イソペーストHAOから、我々は、60％（w / w）のFFAを40％（w / w）の中性脂質（ 表1）を得ました。逆に、 イソ粉末-HAOは、 表1に詳述されるように、中性脂質（平均= 54％中性脂質+ 46％のFFAを）で濃縮されたことが判明しました。

H ₂ SO ₄およびメタノールでのFFAのエステル化は、その後、90％以上の収率（ 図3）における黒色油状液体周辺暗緑色のように脂肪酸メチルエステル（FAME、 すなわち 、バイオディーゼル）を生成しました。モンモリロナイトK10 ^29（MK10）粘土の上に加熱することにより脱色は、他の商業双方向に外観が似た黄色/オレンジ色の製品を与えましたodiesel燃料（材料のリストを参照してください）（ 図3）。脱色イソクリシスのバイオディーゼル燃料のFAME分析の結果を表2に示します。

イソクリシス大豆バイオディーゼル燃料の図3比較グリーンイソクリシスバイオディーゼル（中央）が抽出され、精製された遊離脂肪酸のエステル化により製造されます。脱色は、市販のバイオディーゼル燃料に似た特性を持つ製品を（右）（左）を生成します。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

FAME A	磯 -paste	磯 -powder
14時00分	16.4	19.4
14：01	-	0.3
午前15時	トレース	0.3
16時00分	10.1	8.8
16：1Δ9	7.6	5.5
夜04時02分	ND	0.3
午後04時03分	ND	0.5
午後06時	トレース	0.2
18：1 B	12.1	14.3
夜六時02	8.1	7.1
18：3 C	8.5	13.5
夜06時04分	19.8	10.4
18：05	ND	3
午前20時05分	ND	-
22時05分	ND	2
午前22時06分	6.9	11
ΣD	89.8	96.2
注：＃ シス -二重結合のBコンバインド18：：1Δ9+ 18：脂肪酸の命名法は#carbonsです。1Δ11C複合Δ6,9,12とΔ9,12,15異性体Dの残りの材料は約50です。 ：50他のFAMEと非FAMEコンポーネント（合計〜95％FAME）。 ND =検出されていません。

イソクリシスバイオマス-powder商業磯の -pastと磯から製造されたバイオディーゼルの 表2 FAME組成物。

中性脂質は、w / wのイソ -paste-HAOおよび54％（平均）からイソ粉末-HAO（ 表1）から40％で緑がかった固体混合物として得ました。使用してシリカを通して溶解中性脂質のフィルタリングDCM溶媒、白色固形物として、分析的に純粋なアルケノンを得、ヘキサンで再結晶することができる赤みがかっ/オレンジ色の固体を除去した後に得られました。この手順では、 イソからアルケノンの16％（w / w）の単離収率が得られたペーストHAOおよびイソ -powder-HAO（ 表1）から25％収率。

ディスカッション

イソクリシスは、プライマリ貝類飼料の成分、及びバイオ燃料生産のために必要な規模の、したがって代表として収穫工業的に養殖藻類種の唯一の選択された数の一つです。本研究で用いた藻類を利用し、標準的な方法の可用性は、プロトコルはさらなる調査のための他のグループにも広くアクセス可能に提示してください。重要なステップは、空気乾燥藻^（33を凍結乾燥^するとは対照的に）、溶剤抽出、鹸化、およびエステル化が含まれます。これらの事業活動を通じ1が利用可能な様々なイソクリシス ³⁰から脂質および他の副産物の収率を調べることができます。なお、これらは、株や栽培方法^、31の異なる結果と異なる場合があり、また、製品の性質および任意の追加の処理業者が利用する（ 例えば 、乾燥または凍結）によって影響を受ける可能性があることが予想されます。我々はここで実証したように、プロトコルを開発しますEDは正常湿潤ペーストの乾燥粉砕した粉末の範囲、 イソクリシス製品の異なるタイプに適用することができます。バイオディーゼルの収率は、藻類油の低い量（H-AO）に対応した粉末状のバイオマス（12％w / wの乾燥ペーストから7％w / wの乾燥バイオマスの対）、からしかし低い抽出しました。これはソックスレー装置以外の代替抽出プロトコル^32は、乾燥粉末イソクリシス製品のためのより適していることを示唆している場合があります。本研究で用いたイソクリシス粉末は、我々が実験的に乾燥したイソクリシスペーストから得られたものと類似の23から25パーセントの脂質を含むとして宣伝されている^。33,34,26

出発乾燥バイオマスの異なる色にもかかわらず、 イソペースト-HAOおよびISO -powder-HAOは、約50℃の融点を持つ黒い固形物に近い/ダークグリーンの両方、本質的に区別できませんでした。興味深いことに、中立唇へのFFAの比率2ヘキサン抽出物内のIDが異なっていました。ケンと中性脂質を分離した後、我々は、ISO -paste-HAOから60％（w / w）のFFAを40％（w / w）の中性脂質を得ました。 イソ粉末HAOは平均46％（重量/重量）のFFA及び54％（w / w）の中性脂質の生成しました。結果は、出発粉末バイオマスがイソクリシスペーストよりもFA誘導体に比べて中性脂質の高い量を含んでいる、または粉末イソクリシスのソックスレー抽出は、中性脂質のために幾分選択的であることをいずれでもよいことを示唆しています。

異なる2つの市販イソクリシスのバイオマスから得られた生成物の収率が、また、得られたバイオディーゼルの脂肪酸プロフィールであっただけではなく。バイオディーゼルの燃料特性は、個々のFAMEの性質や内容に直接依存しているように、これは、重要である^。35実用化するには、すべてのバイオディーゼルは、文書のASTMに記載の基準に準拠している必要がありD6751または米国やヨーロッパではEN 14214それぞれ。仕様は、セタン価と酸化安定性のための潤滑性および動粘度のための範囲、および最小値を含みます。その他の重要な勧告は、曇り点（CP）またはコールドフィルター目詰まり点（CFPP）の形で低温流動性に関連しています。我々は以前イソペーストから調製されたバイオディーゼルの総合的な燃料試験の結果を報告している^。36本研究で磯の -powderから製造したバイオディーゼルのFAMEプロファイルは、以前に試験されたものと同様であるので、我々は似ているように、特定の燃料特性を予測することができます両方のバイオディーゼル燃料について。例えば、両方のFAME混合物の約40％（35.2％および39.9％ を表2）のための多価不飽和脂肪酸（PuFAMEs、二つ以上の二重結合）アカウント。これは、貧しい酸化安定性と良好な低温流動になります。2 biodieのFAMEプロファイルのわずかな違いは、しかし^、35がありますSEL燃料。 0（19.4ミリグラム/グラム対16.4ミリグラム/グラム）、18：3（13.5ミリグラム/グラム対8.5ミリグラム/グラム）、および22：6（11.0ミリグラム/粉末イソクリシスから製造されたバイオディーゼルは14のより多くの量を含んでいましたグラム対6.9ミリグラム/グラム）のFAME、まだ18の低い量：4（10.4ミリグラム/グラム対19.8ミリグラム/グラム）。 ASTM規格に含まれる様々な燃料特性上、これらの違いの影響範囲については、今後検討を要します。

両方の商業イソクリシス藻類から得られた初期のバイオディーゼルは、クロロフィルの存在によって説明することができる色が同様に暗緑色であった^。36クロロフィルおよびその誘導体は、植物油およびそれらの対応するバイオディーゼル燃料の安定性に負の効果を有することが報告されています。 ^36,29バイオディーゼル生産に関連してgreenseedキャノーラ油を脱色するためのIssariyakulとダライの方法に基づいて、1時間60℃で10％（w / w）のMK10を超える当社のグリーンバイオディーゼル燃料を攪拌^29が劇的になりました目視で顔料含有量の減少（文献 図2）。脱色プロセスからの質量回収率は平均90％でした。

イソペーストハオとイソ粉末-HAO中性脂質から精製されたアルケノンの収率は（ 表1）40％で同等であったと46％w / wのそれぞれ。中性脂質は、 イソ粉末-HAO（w / wの54％w / wの対40％）に含まれる材料の割合が高く、 イソ粉末-HAOはイソペーストHAOアルケノンの収率を超えてからのアルケノンの収率を表すので、 （w / wで/ワット対16％wの25％）は約10％。しかし、 イソ粉末-HAO自体の収率はイソペースト-HAO（15％対20％w / w）でより低かったことを考慮すると、両方のドライイソクリシスバイオマスからのアルケノンの全収率は、x 0.2×0.4（もっと似ています0.4 = 3.2％w / wの乾燥イソクリシスペーストからであり、x 0.54のx 0.46 0.15 = 3.7％ イソクリシス粉末から）。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isochrysis	Reed Mariculture	Iso, Raw, Unprocessed, 20%dw	Live culture paste, 20% w/w biomass
Isochrysis	Necton, S.A	AADISS004	PhytoBloom Prof Isochrysis (Freeze-dried)
Hexanes	Fisher Chemical	H291-4	ACS Certified
Methanol	Fisher Chemical	A452-4	HPLC Grade
Dichloromethane	Fisher Chemical	D37-4	Certified/Stabilized
Soxhlet Apparatus	Sigma Aldrich	64826
Extraction Thimble	Sigma Aldrich	64842
Büchner Funnel	Chemglass	CG-1406-25
High Pressure Reaction Vessel	Chemglass	CG-1880-12
Whatman Filter Paper	GE Life Sciences	1442-042	Grade 42, Ash 0.007%, circle, 42.5 mm
Biodiesel (B100)	Bellingham Shell		The biodiesel (B100) in Figure 3 was purchased at a local filling station: Bellingham Shell, Bellingham, WA 98226
Isochrysis	Aquacave		In addition to Reed and Necton, Isochrysis can also be purchased from Aquacave (Gurnee, IL) at: www.aquacave.com (accessed September 30, 2015).
Isochrysis	Brine Shrimp Direct		Isochrysis can also be purchased from Brine Shrimp Direct (Ogden, UT) at: www.brineshrimpdirect.com (accessed September 30, 2015).