梗塞エリアの中央動脈閉塞技術と可視化を使用したマウスにおける虚血性脳卒中および虚血 - 再灌流の誘導

要約

We describe a mouse model of stroke induced by the occlusion of the middle cerebral artery using a silicone coated suture. The protocol can be applied to induce permanent occlusion or a temporary ischemia, followed by reperfusion.

要約

Cerebrovascular disease is highly prevalent in the global population and encompasses several types of conditions, including stroke. To study the impact of stroke on tissue injury and to evaluate the effectiveness of therapeutic interventions, several experimental models in a variety of species were developed. They include complete global cerebral ischemia, incomplete global ischemia, focal cerebral ischemia, and multifocal cerebral ischemia. The model described in this protocol is based on the middle cerebral artery occlusion (MCAO) and is related to the focal ischemia category. This technique produces consistent focal ischemia in a strictly defined region of the hemisphere and is less invasive than other methods. The procedure described is performed on mice, given the availability of several genetic variants and the high number of tests standardized for mice to aid in the behavioral and neurodeficit evaluation.

概要

脳卒中などの心血管疾患の研究では、in vivoでのモデルの使用に依存しています。虚血、薬物毒性、および/または治療の可能な含意を理解するために、治療群間比較試験を可能にする疾患の、適切な標準化され、信頼性、および再現可能なモデルを使用する必要があります。本稿では、我々はトランスジェニックマウスおよび標準化された評価モデルの多数の利用可能性を考えると、マウスを使用しています。実験的虚血性脳卒中と後の回復後の運動や行動障害を評価するためにスコアをかき集め^1を開発されている^、2。

いくつかの虚血性脳卒中モデルは、このような完全なグローバル脳虚血、不完全なグローバル虚血、多病巣性脳虚血および局所脳虚血として、ご利用いただけます。後者のグループはまた、患者における最も一般的なストロークのカテゴリです。前夜の大多数NTSは、中大脳動脈（MCA）またはその付近塞栓や血栓性閉塞の形成によって開始されます。これらのパラメータが与えられると、密接に提示されたモデルは、人間の脳卒中の疾患の病因を模倣し、関連性の高い³得られた結果になります。それにもかかわらず、ヒトの疾患の治療に動物モデルからの発見の翻訳は、困難であることが判明しました。今までは、血栓組織プラスミノーゲン活性化因子の使用のみが急性虚血性脳卒中⁴の治療のために承認されています。

マウスにおける局所脳虚血のモデルの中では、大脳循環脳卒中モデルと脳静脈血栓症モデルは、その適用性を減少し、実行することができる分析の範囲を制限する、高度に侵襲的です。しかしながら、このような塞栓モデル、光血栓モデル、エンドセリン-1誘発性発作モデル、及び腔内縫合中大脳動脈閉塞（Mなどの他の技術、CAO）モデルは、そのような制限なしに使用できます。 MCAOモデルは、このプロトコルに記載されている技術です。それは容易に再灌流し、ハイスループット様式で行うことができる局所脳虚血を誘発する信頼できる方法を提供します。このモデル、すなわち、トウモロコシ・ロンガと小泉方法には2つのアプローチがあります。彼らは、閉塞縫合糸が血管系に挿入されている方法で若干異なります。トウモロコシ・ロンガの技術では、縫合糸を外頸動脈^5を介して挿入されています。ここに提示技術は、閉塞縫合糸は、総頚動脈^6を介して挿入された小泉方法から変更されます。

MCAOモデルは正常虚血性発作中に発生する様々なイベントを評価するために適用されています。再灌流後、脳浮腫は、血液脳関門の破壊に伴って観察することができます。ピーク神経細胞死は、通常、24時間で観察されます。しかしながら、それは再7日⁷後にベースラインレベルになります。ヒトでは、性別、年齢、脳卒中転帰を決定するとき、これはまた、マウスおよびラット^{8、 図9、図 10}に見られる重要な変数です。いくつかの刊行物は、処理効率^{11、12、13、14を}示すためにMCAOモデルを使用しています。

プロトコル

すべての手順は、国立衛生研究所（NIH）のガイドラインに従ってマイアミ施設内動物管理使用委員会（IACUC）の大学によって承認されました。滅菌設備及び無菌技術への使用が必要です。

1.閉塞縫合糸の準備します

1. 25グラムと25の間のマウスのための0.23ミリメートル - - 体重35グラム20の間のマウスのための0.21ミリメートルの直径の縫合糸を使用してください。 MCAO手順のための縫合糸の種類の選択は、動物の体重に依存します。
2. 銀のペンを使用して、シリコーンコーティングされた先端から始まる9ミリメートルで縫合糸をマーク。これは、挿入長のためのガイドとして機能します。

外科2.準備

1. 実験室麻酔システムを使用して、酸素と混合イソフルランでマウスを麻酔。商業マシン上で2時5と酸素の流れを設定するにイソフルランを使用してください（ 材料表を参照してください）。 surgerに動物を移しY面とノーズコーンを使用して麻酔を維持する（1.5を設定イソフルランを使用 - 2で2.5と酸素の流れを）。
   1. あえぎなしで毎秒2呼吸 - マウス呼吸数は約1であることを確認してください。また、動物はウィスカの刺激反応とペダル反射（つま先ピンチ）を示さないことを確認してください。手術中の呼吸数と労力、少なくとも5分ごとに監視します。
2. 手順中の乾燥からそれらを防ぐために滅菌綿棒を用いて、それぞれの眼に眼科用潤滑剤のドロップを入れてください。また、滅菌した医薬品管から眼に眼軟膏を適用します。
3. その背中に動物を裏返して、切開領域を剃ります。その後、十分に70％のクロルヘキシジン続いてエタノール、70％エタノールで、最終的な綿棒を使用して手術領域を消毒します。実体顕微鏡下で暖かい手術用表面に動物を置きます。

3.一般的な頸動脈の解剖と内部/エクステrnal分岐

1. （ - 4センチメートル約3）手術用ハサミとピンセットを使用して、顎の下に胸の骨の上から、首に浅い正中切開を行います。外科用ドレープは、非滅菌表面に接触から楽器を防止するために、手術領域の周囲に配置する必要があります。外科用ドレープは、撮影を支援するために、現在のビデオでは省略しました。
2. 鉗子、注意深く別個の脂肪および結合組織を使用して気管を露出させます。組織は、簡単かつ自然に両側に分離する必要があります。
3. さらに手術のための領域を露出させ、首を拡張するために、マウスの首の後ろに枕（丸い物体、直径約0.5cm）を配置します。
4. 組織リトラクターやフックのいずれかを使用して切開を開きます。
5. 気管の動物の左側に、慎重に左総頸動脈（CCA）を露出させる結合組織を離れてピンセットで抜きます。 CCAにバンドル神経や主要な血管を損傷しないように注意してください。
6. 下にある組織から分離するように注意して、CCAを露出し続けると、内部大脳動脈（ICA）と外部大脳動脈（ECA）の分岐トップ "Y"を公開します。 CCAを取り外すのを助けるために、結合組織を貫通するようにCCAの下に曲がった鉗子を挿入した後、ゆっくりとそれらを開くことができます。

MCAO縫合糸挿入用CCAの4準備

1. CCAの下の長さが約4cmのナイロン縫合糸の3つのセグメントを挿入します。これは劇的に縫合糸の挿入を複雑にするようCCAがねじれていないことを確認してください。
2. 可能な最低点で、永久的な結び目を用いたボトム縫合糸を閉じます。
3. ちょうどICA / ECAは、取り外し可能なスリップノットを使用して、分岐の下にトップ縫合糸を結びます。
4. 取り外し可能なスリップノットを使用して中間縫合糸を結ぶが、大きく開いて、それを維持します。縫合糸の挿入を妨げないように、十分なスペースを残すことが重要です。
5. 顕微解剖スプリング科学を用いて、ssorsは、底部と中央の縫合糸の間のCCAの切開を行います。下の縫合糸に近い0.2ミリメートルの切開を行います。

5.中大脳動脈閉塞

1. 鉗子を使用して、トップにそれを案内する、CCAの切開部にMCAOの縫合糸を挿入します。 CCAの開口部の凝固および閉鎖を防止するために、ステップ4.5の後すぐに、この手順を実行します。縫合糸の挿入がブロックされている場合には、切開を再開するために鉗子の先端を使用します。
2. 穏やかにその周りの血流を制限するスリップノットを使用して、MCAO縫合シリコーン部分に中間縫合糸を縛り付ける、それは自由に移動することを可能にするのに十分な緩み。
3. 慎重にMCAOの縫合糸が抜けていないことを確認して、一番上の縫合糸を元に戻します。
4. ミリメートルのカップルがICAにおけるMCAOの縫合糸を挿入して、ステップ5.2で説明したのと同様に、トップの縫合糸を再び閉じます。
5. オクルージョン領域にMCAOの縫合糸を案内します。挿入が成功の指標でありますCCA切開からの血液の逆流の量が少ないことにより、シルバー9ミリメートルマークがCCA切開およびICA / ECAの分岐部との間に位置していることは明らか。成功した閉塞のさらなる確認は、レーザードップラー血流監視システム^15、16のようなモニタリング方法を用いて得ることができます。
   注：閉塞した領域側ミドル脳領域への血流の90％の低下が成功した閉塞を示しています。
6. 成功閉塞した後、しっかりとミドルとトップ縫合糸を縛り付けます。偽の挿入を行う場合は、縫合糸を再閉鎖ではなく、すぐに7.3に進みません。

6.切開閉会と術後ケア

1. 切開領域への縫合糸でタック。
2. 開創または組織フックと枕を削除します。
3. 滅菌生理食塩水と綿棒を使用して、きれいな縫合エリア。
4. ナイロン縫合糸/針とピンセットを用いて切開を閉じます。
<李>は、抗炎症（ 例えば 、カルプロフェンを10mg / kg、皮下）と鎮痛剤（ 例えば 、ブプレノルフィンを0.1mg / kg皮下、一日二回）術後の不快感を緩和する薬管理します。低体温症を防ぐため、水と軟化食品への広告陰唇へのアクセスを与えるために加熱されたパッドの上に置いケージにマウスを置きます。
5. 動物の回復をモニター（5から10分）、脳卒中の兆候。彼らは軽度の横麻痺によって異なり、反対側の脇腹やローリングの深刻な収縮に旋回することができます。いくつかの評価点が議論に記載されています。呼吸困難または重度の発作の兆候を示す動物を安楽死させなければなりません。
6. 虚血再灌流プロトコルに応じて、30分〜120分以上に場所にMCAOの縫合糸を残します。閉塞時間を短縮する死亡を防止します。
7. 永久閉塞のために、24時間の場所にMCAOの縫合糸を残して、しかしかなりの死亡率が予想されます。この時間経過後、STEに進みますP 7。
   1. 永久閉塞モデルを使用している場合、エンドポイントまでケージにマウスを保持します。その時、（7.8から7.1ステップ）縫合糸を取り除きます。この手順は、安楽死の後に行うことができます。

7.再灌流

1. （2.1の指示に従ってください）、再び動物を麻酔し、創傷閉鎖縫合糸を除去します。
2. 鉗子および組織セパレータを使用して、切開部を再オープンし、CCAを露出させます。
3. 慎重トップ縫合糸を除去し、シリコンコーティングされた部分は真ん中の結び目に位置されるまで、そっとMCAO縫合糸を引っ張ります。
4. （それはスリップノットである必要はありません）縫合糸を渡す流れるから血を防止するために、縫合糸の一番上の結び目をやり直します。
5. 慎重に中央の結び目を元に戻すとトップ結び目過去の縫合糸を引っ張るが、CCAの内側にそれを維持。
6. しっかりと動脈の血流を遮断するために、トップ結び目を閉じます。
7. 完全にMCAOの縫合糸を引き出して、しっかりと真ん中の結び目を閉じます。
8. MCAOの縫合糸とすることができます数回の再利用。各使用後、滅菌ガーゼを使用して汚染物質（ 例えば 、血液または組織）を除去するために70％エタノールで慎重に縫合糸を清掃してください。その後、滅菌袋に縫合糸を配置し、それを滅菌します。
9. 6.4と動物の回復を監視 - 繰り返して、6.1を繰り返します。

8.組織分析

1. ストローク量を監視するには、脳を解剖します。
   1. 二段階プロセスを使用して、マウスを安楽死させます。まず、停止を呼吸するまで、イソフルランの過剰摂取に動物を公開します。 TTC染色のために、すぐにマウスを刎ねると脳の抽出に進みます。切片脳（免疫染色分析などのために）のために、断頭前に心臓穿刺を介して灌流を行います。
   2. 頭蓋底で頭をカットオフと目の間までの頭蓋骨の上部に首の開口部から頭皮をカット。頭蓋骨を露出すると、頭蓋底の開口部から始まる両側に沿って骨を切ります眼窩まで。頭蓋骨の広い部分に沿ってカットしてください。脳の損傷を防ぐためにハサミであまり深く到達しないように注意してください。
   3. その後、2眼窩間の骨を切りました。
2. 鉗子を使用して、脳を露出させるために頭蓋骨の上部を持ち上げます。わずかな抵抗があるはずです。それが簡単に持ち上げていない場合は、頭蓋骨の切開が不完全である可能性があります。優しく鈍曲がったピンセットを用いて脳をこじあけます。脳は、まだいくつかの神経によって取り付けられている可能性があります。道に沿って添付ファイルを除去し、ゆっくりと進みます。
3. 、1ミリメートルの脳マトリックス中に新鮮な脳を置き、PBSの滴のカップルを追加し、カミソリの刃やクライオスタットブレードを使用して行列に沿ってスライスします。
4. 100ミリメートル皿に脳を移し、皿の底をカバーするために、染色溶液（2％2,3,5-塩化トリフェニル[TTC] PBSに溶解）を追加します。 2鉗子を使用して、個別のすべての脳切片は、（前面下に向いている）と皿の底に順番に配置します。
   注：染色は、非生存組織は、白残りで、赤の生存組織に変わります。 37°Cの解決策を温めることは染色を加速していきます。ストローク領域（白）の徴候は90分後に脳卒中限り迅速に見られ、7日以上のために表示されたままにすることができます。イメージングは​​、ストローク量の計算を可能にするために、定規に沿って行われるべきです。
5. このプロセスは、免疫染色、タンパク質の単離、または他の手順^17、18、19の様々なセクショニングのための脳を解剖しました。

結果

閉塞縫合糸の挿入経路を図1に示されています。 MCAOの縫合糸は、ICAに分岐、オクルージョン領域にルーティングされます。 MCAの成功閉塞は、TTC染色によって可視、組織損傷につながります。 図2は、偽処置動物（ 図2A）から、60分MCAO虚血再灌流動物（90分または24時間の閉塞後に染色、 図2B）からの染色の画像を提示?...

ディスカッション

記載MCAO方法の成功した利用は、脳血流の解剖学の理解に大きく依存します。縫合糸の正しい配置が原因で、直接視覚的な手がかりがないために識別することは困難であるので、反復練習は、調査研究のためにそれを使用する前に、手順を習得することが重要です。行程容積は、一貫した結果を保証するために分析されるべきです。レーザードップラーシステムの付加は、血流の正常咬合を決...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
MCAO suture 0.23 mm	Doccol	702345PK5Re
MCAO suture 0.21 mm	Doccol	702145PK5Re
Silver pen	staples	503205
Anesthesia machine	Vetequip	901806
Surgical scissors	Fine science tool	14558-09
Surgical forceps straight tip	Fine science tool	00108-11
Surgical forceps angled tip	Fine science tool	00109-11
Spring scissors	Fine science tool	15000-08
Nylon suture	Braintree scintific	SUT-S 104
Closing suture	VWR	95057-036
Isoflurane	Piramal
2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride	FisherSci	50-121-8005
Brain block	Braintree scintific	BS-A 5000C
Cryostat blade	VWR	89202-606
Optional:
Periflux Laser doppler system	Perimed	Periflux 5000
Monitoring unit	Perimed	PF 5010 - LDPM