破壊強度試験および定量的CTベースの有限要素解析のための近位の死体大腿骨の準備

要約

我々は慎重に維持し、破壊試験および定量的コンピュータ断層撮影用の死体大腿骨を準備する方法の堅牢なプロトコルを提示します。この方法は、骨密度、破壊強度との関係を決定し、有限要素モデルの幾何学的形状および特性を定義するために入力条件を正確に制御を提供します。

要約

死体の破壊試験を日常的に、近位大腿骨の強度に影響を与える要因を理解するために使用されます。 ex vivoでの生物学的組織は経時的にその機械的性質を失う傾向があるので、実験的試験のための準備を慎重に行わなければならない、インビボ条件下で表す信頼できる結果を得るために、検体。そのため、私たちはその機械的性質は、最小限の変更を経験したように、大腿骨の標本を準備するためのプロトコルや備品のセットを設計しました。大腿骨は、調製工程及び機械試験中以外は冷凍状態で維持しました。全股関節及び大腿骨頸部骨密度（BMD）の関連する臨床尺度は、臨床デュアルX線吸収測定（DXA）、骨密度計を用いて得られ、3Dジオメトリ及び骨ミネラルの分布は、較正ファントムのためでCTを用いて得られましたグレースケール値に基づいて定量的推定。すべての可能な骨疾患、骨折、またはインプラントまたは骨構造に影響を及ぼすアーチファクトの存在は、X線スキャンで除外されました。調製のために、すべてのボーンを慎重に余分な軟組織を洗浄し、そして関心の内部回転角にカットし、鉢上げました。切断器具は、骨の遠位端が所望の長さで近位大腿骨を残して遮断することを可能にしました。後でCTスキャンおよび機械的テスト中に所定の角度で大腿骨頸部の位置決めを可能にするために、大腿骨近位部シャフトは、所望の配向のために特別に設計された固定具を用いて、ポリメチルメタクリレート（PMMA）で鉢植えしました。我々の実験から収集されたデータは、その後、定量的コンピュータ断層撮影（QCT）の検証のために使用された別のプロトコルに記載のように、有限要素解析（FEA）をベース。本稿では、我々は機械的試験及びその後のQCT / FEAモデリングのための正確な骨の調製のためのプロトコルを提示します。現在のプロトコルは、成功し、約200 CADを作製するために適用されました6年の期間にわたるaveric大腿骨。

概要

Determining the true cadaveric proximal femoral fracture strength with mechanical testing is a destructive method that requires a rigorous testing approach for accurate measurements. In particular, proper bone preparation methods are necessary to maintain near in vivo integrity of the bones prior to mechanical fracture testing¹. This is achieved by proper bone storage and minimizing handling at room temperature. This test data is extensively used to validate QCT/FEA models of femoral fracture which have the potential to be used clinically to understand the fracture risk, especially in osteoporotic patients. Unfortunately, there is no current standard procedure to prepare proximal femur samples for mechanical testing. A good testing procedure should ensure repeatability and reproducibility of the preparation process. Therefore, fixtures required for sample preparation need to be carefully designed and fabricated to minimize the likelihood of various testing errors. We also need to minimize the preparation time for which bone tissue is at room temperature and thus in danger of degradation with irreversible changes in mechanical properties.

To this end, we have developed a procedure that preserves bone tissue across multiple preparation steps. This is important to ensure minimal exposure time at room temperature while also minimizing the number of freeze/thaw cycles which can affect tissue physical properties². The entire procedure is long and nontrivial as the steps occurred over multiple weeks and required scheduling for scanning procedures and personnel availability. The steps included thawing bone samples, screening the samples using DXA scanning to obtain bone mineral density (BMD) values, X-ray to rule out any diseased specimens, and finally CT scanning to estimate distribution of bone mineral and femoral geometry. All the specimens were prepared for testing by removing extraneous soft tissues from the bone surface, cutting the femur to a length required for testing, and potting the femur in a desired orientation for simulating a sideways fall on the hip during subsequent testing. It is essential to keep the time period for all these operations as short as possible. A robust protocol is thus mandatory for consistent specimen preparation, tissue preservation between steps, and for reducing the overall preparation time.

The aim of this paper is to present in detail the procedures involved in the preparation of femoral samples for subsequent mechanical testing under various conditions. Preservation of the bone tissue is crucial in this process and we achieved it by keeping specimens frozen between steps and keeping them carefully wrapped in saline saturated towels at all times except when scanning and mechanically testing the bones. Femora were also kept wrapped in saline wet towels during the steps involving PMMA curing to prevent dryness of the bone tissue.

プロトコル

注：このプロトコルで提示されたすべての研究はメイヨークリニックでの治験審査委員会（IRB）により承認されました。骨は様々な機関からの6年間にわたって得られました。全ての検体は、生理食塩水飽和タオルに包まれ、そして準備まで-20℃で保存し、死の72時間以内に採取しました。

1. DXAを用いて骨密度を測定

1. 約24時間室温で解凍し、-20℃の冷凍庫に保た標本を削除します。標本はほとんどの軟組織が除去された場合は、元の梱包から削除する必要はありません。
2. 軟組織を考慮するために、米の2つの5ポンドの袋を使用してください。汚染を防ぐためにビニール袋にDXAテーブル上の2つの米の袋をカバーしています。米袋は、 図1に示すように、走査中に（in vivoで ）、軟組織を取り囲むシミュレートします。
3. プラスチック並ん紙でDXAスキャナの表面を保護し、2プラスチック包まれた里を配置スキャナテーブル上のceバッグ（ 図1A）。
4. このような（大腿骨頭を含む）近位端がバッグを中心にして、後方側がダウンした （ 図1B）であることを米俵の上に2大腿骨（左右）を置きます。これは彼らの背中の上に横たわる患者を模倣します。
5. 表紙前方/追加の2つの5ポンド米の袋（ 図1C）と近位大腿骨の端部を露出しました。
6. 近位大腿骨の上に位置マシンヘッドと患者のBMD測定のための標準的な制度的手順（ 図1C）によると、大腿骨をスキャンします。特定のDXAメーカーの指示に従ってください。
   1. DXAマシンソフトウェア・インターフェースから、通常の大腿骨のスキャンを実行します。 、大腿骨試験を選択DXAアームに応じて左または右矢印を押して、死体大腿骨の上にDXAアームを配置し、「開始」ボタンをクリックすることで試験を開始します。 「分析」をクリックすることで、BMD分析を実行します。
      NOTE：スキャンから得られた自動Tスコアは、（ 図1D）、正常な骨減少症または骨粗鬆症のような骨を分類します。特定のDXAメーカーの指示に従ってください。

2.クリーニング、骨の遠位端部を切断し、ドリル

1. 慎重に骨から残りの軟組織を除去することにより、大腿骨の最も近位の300ミリメートルを清掃してください。このステップは、PMMAは、機械的試験の準備のためにポッティングプロセスの間に骨に連絡することを可能にするために必要とされています。骨は、このプロセスのために、室温に解凍する必要はありません。
2. 70％イソプロピルアルコールでワークスペースを消毒し、片側にプラスチックフィルム（ 図2A）との吸収紙パッドを使用してテーブルをカバーしています。 （2Hに図2A）を切断するクリーニングから始まるプロセス全体のためにテーブルの上に全体の大腿骨（ 図2B）を設定します。手袋などの個人用保護具（PPE）を着用そして、眼の保護。
3. 過剰骨膜を掻き取るスクレーパとメス（ 図2C、2H）を使用して余分な組織を切り取ります。
4. 固定具のアクリル板に対する大腿骨頭と図2Dに示すように、カスタムメイドの切断治具で骨を置きます。
5. 合わせ、切断治具（ 図2D）上の2つのピンに対して骨幹を開催しています。
6. 骨幹に溝付きプレートを下に締め付けることにより固定具に骨を固定します。骨は、固定具で平らにしていない場合、先端オフテーブルトップをハングアップし、試料の場所で（ 図2D）を保持するために、必要に応じても、必要に応じてジップは、大腿骨頚部を結びます。
7. ガイドとしてスロット板を介してキャストカッター（ 図2E）を使用して、大腿骨の遠位シャフトをカット。よりよいグリップのための乾燥ウエス/タオルで骨を保持します。
8. フィクスチャから骨を削除します。カット後の正常な骨の長さは255ミリメートル（ 図です2F）。
9. 約25ミリメートルの深キューレットを使用して、骨髄の骨髄腔を清掃してください。次に、内部表面を乾燥するために役立つガーゼスポンジを挿入します。金型内の大腿骨の遠位端部を配置する直前にガーゼを削除します。グリップ乾いたタオル/布で骨とは、遠位端を通って試料の近位カット端から約25ミリメートルを10ミリメートル穴を開けます。注：これは、PMMAは、運河に浸透し、しっかりと骨を確保できるようにすることです。

3.骨をポッティング

1. 設計と製造ポッティングコンテナ。ポッティング容器は厚さ5mmのアクリルシートで作られており、以下の外形寸法有する：50ミリメートルの正方形断面と100ミリメートル背の高い（ 図3A）によって50ミリメートルを。
2. 適切な骨の識別とラベルポッティングコンテナ（ 図3Aおよび3B -アクリルボックスのラベルを参照してください）。
3. 適切な方向への埋め込み器具を調整（左脚または右脚; 例えば、15°または30°の内部回転）。
4. ポッティングコンテナ（ 図3B）に固定具、場所の骨を埋め込むベースにポッティングコンテナを置き、所望の値に骨の内部の回転角度を調整するために、固定具（ 図3C）にポインタで首を揃えます。
5. PMMA粉末60グラムを測定し、粉末が溶解するまでヒュームフードの下で液状樹脂の30グラムと混合します。混合物を注ぐことがでなければなりません。このプロセスのための使い捨ての紙コップを使用してください。
6. PMMAが明確とハードになるまで15分-ヒュームフード（ 図3D）の下で骨とポッティング容器に混合物を注ぎ、約10のために硬化させます。これは〜PMMAとポッティング容器の1/2を埋める必要があります。慎重にPMMA重合（ 図3E）の間に発熱による組織の乾燥を防ぐために、生理食塩水飽和タオルで骨を包みます。
7. 定期的にに整列したまま確実にするために大腿骨をチェック硬化中の容器。
8. ポッティング固定具から大腿骨を削除し、生理食塩水に浸したペーパータオル（ 図3E）で包みます。
9. ステップ3.5で説明したようにヒュームフードの下でのPMMAの90グラムを準備し、完全にポッティング容器を満たします。それはハードになるまで15分 - 約10のためにPMMAを治します。
10. 樹脂が硬化した後、しっかりと生理食塩水に浸したペーパータオルで骨をrewrap /ラップ、冷凍庫で-20℃でビニール袋や店舗標本でカバー。

4. X線で骨のイメージング

（ 注意！マシンを使用した場合のX線放射のための適切な注意を払って操作します）

1. X線用フィルムを使用している場合は、（開発者の部屋で）ノブを時計回りに回して、走査前に少なくとも20分（メーカーごとの命令）にX線の開発者を回します。
2. 未露光フィルムは、X線撮影前にカセットであることを確認します。カセットは暗い部屋で開かれるべきです。
3. にマシンの電源を入れマシンヘッドのロックを解除し、拡張します。
4. ビームのパスの下にカートを配置し、ビーム（ 図4A）の下でカートにカセットを配置します。
5. プレイス、カセット（ 図4B）に大腿骨を配置。 2つの向きがキャプチャされます：内側 - 外側ビューと前後ビュー。それに応じて標本画像にラベルを付けます。
6. 最初の露光後、鉛と骨の位置を入れ替えます。
7. 鉛で既にさらさ半分をカバーし、未露光側の第2の向きで骨を露出させます。これにより、ユーザは2つの方向（ 図4C-D）で単一の骨のための1つのX線フィルムを使用することができます。
8. カセットを変更し、第二の配向に各大腿骨を回転させます。
9. 単一の大腿骨の場合には、X線に対するフィルム全体の初期の暴露を避けるために、鉛カバー付きカセットの半分をカバーしています。
10. 個人的な保護のための鉛並ぶポータブル壁の後ろに移動し、公開するためにトリガーを使用骨。
11. 完了すると、ロックし、店舗の位置、X線マシンでOFFにキーを回すと、露出したX線フィルムを除去するために、X線ヘッドを返します。
12. 定期的なフィルムの現像液を用いてX線画像（ 図4E）を取得するためにフィルムを開発。客室内に白色光をオンにして、フィルムの開発者を探します。赤色光をオンにして、カセットを開く前に、白色光をオフにして、フィルム現像処理を進めます。カセットを開き、開発者を介してフィルムを置きます。白色光をオンにして、フィルムが開発された後に赤色光をオフにします。

骨の5 CTスキャン

1. 冷凍庫から約24時間前スキャンに骨を削除します。骨は完全にスキャン前に解凍する必要があります。
2. 骨が最後にクリーンアップを最小限にするためにスキャンするためにビニール袋に包まれていることを確認します。
3. プレイスと大腿骨とCTスキャンの治具（ 図5A-B）におけるキャリブレーションファントムを固定します。 Fixtureは、校正ファントム（ 図5C）を保持し、また、その後の機械的試験のために所望の向きと同じ向き（ 図5D-E）で大腿骨を保持しています。このクロス登録は、（別のプロトコルに記載されている）QCT / FEAモデリングプロセスにおいてCTスキャン（ 図5F）からのデータを使用する必要があります。
   注：フィクスチャは、それが近位大腿骨（大腿骨頭部、頚部、大転子、および近位シャフト）を妨げることなくCTスキャンのための大腿骨を露出させるように設計されています。
4. CTスキャナで大腿骨と一緒に、固定具が適切にガイド（ 図5D-E）として、システムのレーザーを使用して整列していることを確認します。 （オン/オフボタンレーザーを押すことによって）CT長軸レーザーによる固定具のアライメントを再確認してください。ファントムは、それが固定具に固定されるように、レーザに位置合わせする必要はありません。ゼロbuttoを押して、マシンのコントロールパネルからテーブル位置をゼロコントロールパネル上のn（0←→）。
5. CT標準的な操作手順の後、超高解像度モード（ズフル）を使用して120のkVp、216のmAs、1秒回転時間、および1のピッチでCT機を操作してください。これは、0.4mmのスライス厚、および0.30の画素サイズを与える - 0.45ミリメートル、視野（FOV）の大きさに応じ。
6. 機械的試験の前にCTスキャンをチェックしたデータは、目的の画像をキャプチャして保存されていることを確認します。実験日まで-20℃で骨を再凍結。

結果

死体大腿骨は冷凍出荷され、準備が始まるまで-20℃で維持しました。 BMDスキャンは股関節頸部BMD並びに各試料についてのTスコア（ 図1）を測定するDXAスキャナを用いて行きました。 Tスコアは、若い健康な被験者の平均値と比較して測定されたBMDの標準偏差の数です。これは、骨減少症、骨や-1より正常な骨のためのより高いため-1と-2.5の間、骨粗しょう...

ディスカッション

私たちは、ヒップ構成の横秋に大腿骨強度の機械的試験及びQCT / FEAモデリングを確保するための強固な骨調製プロトコルを提示しました。この方法は、弊社の標準の社内プロトコルとなりました。 6年の歳月をかけて、様々な人材で、約200大腿骨は正常にこのプロトコルに従って調製しました。プロトコルの結果は、転移性疾患、以前の骨折、またはX線を使用してインプラントを除外、DXAを?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
CT potting container and scanning fixture	Internally manufactured	N/A	Custom designed and manufactured
CT scanner	Siemens	Somatom Definition scanner (Siemens, Malvern, PA)	CT scanning equipment
Quantitative CT Phantom	Midways Inc, San Francisco, CA	Model 3 CT calibration Phantom	Used for obtaining BMD values from Hounsfield units in the CT image
Dual Energy X-ray Absorptiometry scanner	General Electric	N/A	GE Lunar iDXA scanner for bone health or any similar BMD scanners
Hygenic Orhodontic Resin (PMMA)	Patterson Dental Supply	H02252	Controlled substance and can be purchased with proper approval
Freezer	Kenmore	N/A	This is a -20 °C storage for bones
X-ray scanner	General Electric	46-270615P1	X-ray imaging equipment.
X-ray films	Kodak	N/A	Used to display x-ray images
X-ray developer	Kodak X-Omatic	M35A X-OMAT	Used for developing X-ray images
X-ray Cassette	Kodak X-Omatic	N/A	Used for holding x-ray films
5-pound Rice Bags	Great Value	N/A	Used for mimicking soft tissue during the DXA scanning process
Physiologic Saline (0.9% Sodium Chloride)	Baxter	NDC 0338-0048-04	Used for keeping samples hydrated
Scalpels and scrapers	Bard-Parker	N/A	Used to clean the bone from soft tissue
Cast cutter	Stryker	810-BD001	Used to cut femoral shaft
Drilling machine	Bosch	N/A	Used to drill the femoral shaft
Fume Hood	Hamilton	70532	Used for ventilation when using making PMMA