低密度初代海馬ニューロンの文化

要約

この記事では、グリア単層の上に反転したカバーガラス上で成長する低密度初代海馬神経細胞を培養するためのプロトコルを記述しています。ニューロンとグリアの層は、パラフィンワックスビーズで分離されています。この方法によって成長させた神経細胞は、高分解能光学イメージングおよび機能アッセイに適しています。

要約

文化の中で、個々の神経細胞の構造と生理をプローブする能力は、神経生物学の研究に不可欠である、そして個々のセルまたは定義されたネットワークの遺伝的および化学的操作の柔軟性が可能になります。無傷の脳組織と比較した場合、操作のような容易さは減少培養系で簡単です。これらの一次ニューロンの単離および増殖のための多くの方法が存在するが、それぞれが独自の制限を有します。このプロトコルは、次に、グリア細胞の単層上に懸架されたガラスカバースリップ上に低密度および高純度齧歯類胚の海馬ニューロンを培養するための方法を記載しています。根底にあるグリア単層からの栄養支持を可能にしながらこの「サンドイッチ文化は」ニューロンの人口の排他的な長期的成長が可能になります。ニューロンは十分な年齢や成熟度レベルである場合、ニューロンカバースリップは、グリア皿のアウト反転及びイメージング又は機能的アッセイに使用することができます。ニューロングラムこの方法によるrownは、典型的には、数週間のために生き残るためには、大規模なアーバー、シナプス結合、およびネットワークプロパティを開発しています。

概要

脳は、神経細胞の複雑なネットワークに編成されます。ネットワークアクティビティと脳機能への個々のニューロンの寄与は、それらの分子組成およびそれらの生理学的特性の摂動を選択的に変更することによって研究することができます。個々の神経細胞の遺伝的および化学的操作は、後者の細胞の不均一性と複雑さによって邪魔されない、完全な脳組織よりも培養ニューロンで間違いなく簡単です。培養中のニューロンは、明確に定義された軸索及び樹状アーバを開発し、互いに広範囲シナプス結合を形成します。

成体動物から、または神経系の他の領域からニューロン培養は可能であるが、胚海馬培養物は、しばしば、それらの定義された錐体細胞集団と比較的低いグリア密度^1,2に好ましいです。培養物中の低密度で成長させた海馬神経細胞は、特にAMEあります細胞内局在、タンパク質輸送、神経細胞の極性とシナプスの開発の研究にNABLE。培養中のニューロンはまた、広範囲シナプス可塑^{3、4、5、6}分子プロセスを研究に使用されてきました。出生後生存しないグローバルな遺伝的欠失を有するマウスからの神経細胞培養物は、特定の遺伝子⁷の細胞とシナプスの役割を研究する際に特に有用でした。

脳のように、培養海馬神経細胞はグリア細胞からの栄養支持に依存しています。これは、彼らの文化を複雑にし、このサポートが供給されることにより、いくつかの異なる方法の開発につながっています。 1つの一般的に使用される方法は、グリア細胞⁸の単層上に直接ニューロンをメッキ、又は取得したヒップから汚染グリア細胞を許すことを含みますocampal組織が増殖し、ニューロン⁹の下の単層を形成します。この方法はある程度の成功を発見したが、得られた神経細胞培養物の不純物は、画像化実験のために不利です。ニューロン培養物の別の一般的に使用される方法は、完全グリアフィーダー層を、除外し、代わりに定義された成長媒体¹⁰の形態の栄養サポートを提供することです。

ここでは、「サンドイッチ」またはニューロン文化^2、11の「バンカー」の方法について説明します。この方法は、次いで、パラフィンワックスビーズにより分離グリア細胞の単層上に懸架されたガラスカバースリップ上の海馬ニューロンをめっきすることを含みます。これは、基礎となるグリア単層からの栄養支持を可能にしながらグリアを汚染することなく、ニューロンの均一な集団の長期培養を容易にします。ニューロンは十分な年齢や成熟度レベルである場合には、ニューロンカバースリップは、グリア皿のアウト反転及びイメージング又は機能的アッセイに使用することができます。

プロトコル

全ての実験と実験動物を使用したプロトコルは、マニトバ大学の動物倫理委員会によって承認され、動物ケアのカナダの協議会のガイドラインに準拠してありました。

楽器、バッファーおよび溶液の調製

1. すべての解剖器具、ガラスパスツールピペット、ピペットチップ、フィルタ装置、及び脱イオン水をオートクレーブで滅菌します。
2. 脱イオン水及びフィルター滅菌でストックグルコース溶液; 20％（1.1 M W / V）を調製します。 4°Cで保存。
3. 脱イオン水中の100mMのピルビン酸ナトリウム溶液を調製し、フィルタ - 滅菌。 4°Cで保存。
4. 脱イオン水中で10％HBSS（10X）、10mMのHEPES、100 U / mLペニシリン - ストレプトマイシンの溶液を作ることによって、カルシウム及びマグネシウムを含まないハンクス平衡塩溶液（CMF-HBSS）を準備。せいぜい1〜2ヶ月間4℃で保存してください。
5. 、CMF-HBSS中10mg / mLのデオキシリボヌクレアーゼI（DNアーゼ）を調製そして、その後のフィルター滅菌し、-20℃で保存。
6. （無菌溶液から）30 mMグルコースの溶液を作ることによってグリア培地を調製、95 U / mLのペニシリン - ストレプトマイシン、および最小必須培地（MEM）で10〜15％ウシ増殖血清（BGS）。
   注：プロトコルに示されているように必要に応じて、5％BGSの溶液は、細胞増殖を遅くするために使用することができます。ウマ血清ではなく、BGSの使用が、各バッチが原因バッチ間変動に使用する前にテストしなければならないことに注意することができます。せいぜい1〜2ヶ月間4℃で調製した溶液を保管してください。多くの研究室は、FBSを使用していますが、我々は一貫してBGSにおけるグリア成長がFBSほど堅牢であることを観察しました。 BGSは、化学的に定義されたコンポーネントで補足されたウシ胎児血清由来です。また、BGSは、FBSよりも実質的に経済的です。
7. 1×B27サプリメントの溶液を作ることによって、ニューロンの成長および維持培地（神経基礎-B27、NBG）を準備した500mLたNeurobasalメディで0.5mMのL-グルタミンええと。せいぜい1〜2ヶ月間4℃で保存してください。 L-グルタミンは、成長培地中でより安定であることが示唆されているのGlutaMAXで置換することができます。
8. MEMに（滅菌溶液から）30 mMグルコース（滅菌溶液から）、1mMピルビン酸ナトリウム、および10％BGSの溶液を作ることによって媒体メッキニューロンを準備します。せいぜい1〜2ヶ月間4℃で保存してください。
9. 1mMのシタラビン（ARA-C）の溶液を調製し、フィルタ - 滅菌。 -20℃で1mlの部分にアリコートとストア。
10. 100 MNフィルター滅菌NaOH中の100mM APVの溶液を調製します。 -20℃で保管してください。
11. ホウ酸緩衝液、pH 8.5（50 mMのホウ酸及び12ミリモルのホウ砂）とフィルター滅菌中1mg / mLのポリ-L-リジンを溶解します。 -20℃で小分けして保存。代わりに、ポリ-L-リジン、一方が細胞に対して低毒性であってもよいポリ-L-オルニチンを使用することができます。

2.グリア文化の準備

1. 皮質アストログリア細胞培養物を準備します
   1. 誕生の24時間以内に仔ラットを取得します。それらをanaesthetizeするために氷の上に子犬を置きます。
   2. 70％エタノールで子犬をスプレーし、それらを刎ねます。
   3. 15 mLのCMF-HBSSを含有する氷上で100mmの皿に頭部を置き。
   4. 、頭皮を切断する頭蓋骨を開いて、脳幹を切断し、次いで3mLのCMF-HBSSを含有する氷上で60 ム・ペトリ皿に脳を転送することにより、各脳を解剖。
   5. 海馬から大脳半球を分離し、それらを囲む髄膜を剥ぎ取ります。髄膜線維芽細胞からの最小限の汚染を確実にするために、適切な予防措置を行使する。文化の中で髄膜線維芽細胞は、成長のためのグリアと競合し、ニューロンの健康のために有害となる可能性があります。 5mLのCMF-HBSSを含有する氷上で60 ム・ペトリ皿内のすべての大脳半球を収集します。
   6. CMF-HBSSを除去した後、マイクロ切開バネはさみを用いて細かくできるだけ収集皮質組織をミンチ。
   7. チョップに十分なCMF-HBSSを追加PED組織。ガラスパスツールピペットを使用して、15mLのチューブに組織片を移します。 CMF-HBSSを添加することによって12mLの総容積をもたらします。
   8. 1.5ミリリットルを2.5％トリプシンおよび10mg / mLのDNase溶液の各々を加えます。 12分間水浴中で37℃で得られた混合物をインキュベートします。
   9. ガラスパスツールピペットを用いて組織を10〜15回トリチュレートし、そしてさらに3分間37℃の水浴中でインキュベートします。
   10. BGSの5 mLを含む50 mLチューブにレンズ紙またはフィルターメッシュを通して上澄みを濾過します。これは、解離していない組織の塊を取り除くために行われます。また、市販の細胞ストレーナーを使用しています。
   11. 残りの組織片を含むチューブにCMF-HBSS、2.5％トリプシンの1.5 mLの13.5 mLを加え、さらに追加の10分間、水浴中で37°Cでそれをインキュベートします。
   12. もう一度、残りの組織をトリチュレートし、次いで初期ろ液を含む50 mLチューブに再び懸濁液をフィルタリングします。次に、すすぎルBGSの3mlでNS紙。最終容積は、約38ミリリットルであるべきです。
   13. 遠心分離機130×gで6分間解離グリア細胞を含む懸濁液。慎重にガラスパスツールピペットを用いて上清を捨てます。底にペレット化した細胞が乱されていないことを確認してください。ペレットの下部には、血液成分を含むやや赤みがかっを表示されます。
   14. ペレットの赤みがかった部分を乱さないように注意しながら、新しいチューブにグリア培地1mL中のグリア細胞を移します。
   15. グリア細胞を解離合成再懸濁する子犬あたりグリア培地2 mlまで加えます。例えば、もし10匹の仔を使用した後、総再懸濁体積を20mLあろう。
   16. 子犬あたり1 75cm ²の細胞培養フラスコを準備します。各フラスコに18mLの予め温めグリア培地を加えます。
   17. 各フラスコに移し、細胞懸濁液の2mLのを、37℃、5％CO ₂インキュベーター中でインキュベートします。
   18. 1日後、20 mLのグリアmに置き換えますedium。この段階で、培養は、グリアおよび他の望ましくない細胞型の混合物です。
   19. 四日間細胞を播種した後、精力的に非アストロサイト細胞を取り除くために、フラスコを振ります。これを行うために、CMF-HBSSで一回フラスコをすすぎ、そして次に各フラスコに10mLの新鮮CMF-HBSSを加えます。精力的に5-10回フラスコを振って、その後、CMF-HBSSを吸引します。 CMF-HBSSで二回すすぎ、その後、20 mLのにグリアメディアを追加します。
       注：この手順は、非標的細胞型の除去を確実にするために重要であり、そして所望のアストロサイトの損失をもたらすべきではありません。
   20. 細胞がコンフルエント（ 図1）になるまで週に2回、新鮮なグリア培地で置き換えます。
2. 凍結グリア
   1. 培養物を合流された後、培地をオフに吸引し、10mLのCMF-HBSSで細胞単層を洗浄します。
   2. 各フラスコに0.25％トリプシン/ EDTAの10 mLを加え、3分間37℃でインキュベートします。
   3. 細胞を取り除くために、優しくフラスコをタップします。 1 mLのBGSトンを追加各フラスコOおよび15mLのチューブに細胞懸濁液を転送します。
   4. 6分間、130×gでチューブを遠心します。得られた上清を捨てます。
   5. 2mLのグリア培地中で細胞ペレットを再懸濁します。
   6. グリア凍結培地（1部のジメチルスルホキシド、4-部品BGS）を準備。フラスコ当たり4つの極低温バイアルの各々にこの溶液0.5mlを加えます。
   7. 各バイアルに細胞懸濁液0.5mLのを転送し、その後、一晩-80℃の冷凍庫に断熱容器内にバイアルを配置することによって、ゆっくりと細胞を凍結します。 1日後、長期保存のために液体窒素冷凍庫にバイアルを移します。
3. めっきは、グリアを復活させました
   1. プレートグリアニューロン文化の日の前に1〜2週間。
   2. mLのグリア培地を温め10と50 mLのチューブを準備します。
   3. 2-3分間37℃の水浴中でグリアの1つの凍結バイアルを解凍します。
   4. 10mLのグリア細胞培地を含む50 mLチューブにバイアルの内容物を移します。
   5. 遠心機上清オフ130 XG及び吸引で5分間の電子管。
   6. 20mLのグリア培地中でペレットを再懸濁。
   7. 培養皿（60ミリメートル）のそれぞれに3 mLの新鮮グリア培地を追加し、各ディッシュに細胞懸濁液1mlを転送します。 37°C、5％CO ₂インキュベーター内で培養物をインキュベートします。
   8. 週2回の細胞を養います。細胞密度がニューロン培養日前にウェル50％コンフルエンスに達した場合、グリア成長速度を遅くするBGS 5％グリア培地に切り替えます。 70％ - ニューロン培養グリア単層の所望の合流は50％です。
   9. 1~2日ニューロン培養前NBG培地でグリア培地（6ミリリットル/皿）を置き換えます。

3.カバースリップの調製

1. クリーニングとパラフィンビーズの調製
   1. 濃硝酸（70％重量/重量;注意：非常に腐食性）でカバースリップを水没し、室温で30分間、それらを超音波処理します。他の研究室がfを持っていますoundそれは有益代わりに室温で12〜24時間セラミックラックに70％硝酸中にカバースリップをインキュベートします。
   2. 注意深く機関のガイドラインに従った指定化学換気フード中の硝酸を破棄する。脱イオン水でカバーグラスに3-5回すすいでください。
   3. （別の方法を以下の場合はスキップ）を脱イオン水でカバースリップを沈め、30分間再度超音波処理。
   4. 脱イオン水を除去し、カバーグラスに別の3回すすいでください。
   5. 50 mLの脱イオン水でカバースリップを水没し、オートクレーブでそれらを滅菌します。あるいは、6時間オーブン中で225°Cでカバースリップを滅菌します。この代替アプローチを使用している場合は、3.1.9に進みます。
   6. オートクレーブ後、次のステップのための滅菌層流フードにカバースリップを転送します。
   7. 脱イオン水を除去し、100％エタノール20~30 mLでリンス。
   8. 100％エタノールの20〜30ミリリットルを追加し、カバースリップを転送し、100ミリメートルペトリ皿にエタノール。
   9. 次いで、60 ム・ペトリ皿、皿当たり4-5カバーガラス、及びそれらを空気乾燥皿の縁に対して、カバースリップを傾倒することによってできるようにカバースリップを転送するために鈍いピンセットを使用します。エタノールが蒸発した後、表面上に平らにカバーグラスを置きます。
   10. 適切な耐熱ガラスボトルに10gのパラフィンを転送します。パラフィンを溶融し、少なくとも1時間、ホットプレート上で約150〜200℃でそれを維持します。パラフィンを加熱すべき理想的な温度は、いくつかの調整がかかる場合があります。非理想的な温度は、パラフィンビーズの正しいサイズを生産する難しさにつながることができます。溶融後の待機期間は、液体全体に一貫した温度を確保するのに役立ちます。
   11. パラフィンにパスツールピペットを浸し、次いで急速に各カバースリップの縁の近くに3つのスポット（各スポットは離れて約120°である）にそれをタッチ。滴は約0.3〜0.5ミリメートル、高ビーズとDIAMで1.0〜2.0ミリメートルに凝固しますETERは、カバースリップ上のニューロンおよびグリア以下単層（ 図2）との間に空間を提供するように機能すると。
   12. 30分間UV光下でディッシュを滅菌し、次いで室温でアルミ箔とストアとそれらをカバー。準備されたカバーガラスを保存し、1ヶ月までのために使用することができます。パラフィンビーズは使用前に少なくとも1週間カバーグラスに付着させるべきです。これは、プロトコルの残りのステップの間に離脱からパラフィンを防ぐことができます。
2. ポリ-L-リジンでコーティングしたカバー
   1. パラフィンビーズと先に調製したカバースリップを含むペトリ皿を取得します。
   2. 各カバーグラスの表面にホウ酸緩衝液中のポリ-L-リジンの200μLを加え、溶液を室温で、カバーされ、一晩カバースリップ上に座ってみましょう。コートパラフィンビーズが配置されているものと同じ表面。適切に洗浄あれば、ポリ-L-リジンが容易に拡散する必要があることに注意してくださいカバーグラスの表面を覆います。
   3. 1日後、2時間毎時間の滅菌脱イオン水に浸漬することによって二回カバースリップを洗浄します。最終洗浄後、皿当たり神経メッキ培地4mLで水を置き換えます。ポリ-L-リジンで被覆された後、カバーガラスの表面を乾燥させないことが重要であることに留意されたいです。
   4. 37°C、5％CO ₂インキュベーター中でカバースリップを含有する皿を置き。コーティングされたカバースリップは、ニューロン培養前に少なくとも24時間インキュベートされるべきです。これは、神経細胞培養のためのプライム中に行われます。

海馬やメッキニューロンの4解剖

1. （膣プラグ発見の日から測定して胚日18-19、）妊娠中のラットを入手し、イソフルラン麻酔断頭またはその他の承認された方法で安楽死させます。
2. 70％エタノールでラットの下面をスプレーし、次いで、陰部THROから切開部を作ります腹腔の最後にぐふ。汚染を避けるために、唯一のこの段階で皮膚を切断するように注意してください。
3. 70％エタノールで再び切開器具をすすぎ、次いで子宮を露出するために腹壁を通って切断します。 2つの子宮角を取り出し、滅菌100ミリメートルペトリ皿に置きます。
4. 層流フードの残りのステップを実行します。胎児の周囲の子宮膜を削除します。それらを斬ると20mLのCMF-HBSSを含む100mMペトリ皿に頭部を置きます。
5. 脳を解剖し、直ちに氷上に2 mLのCMF-HBSSを含む60ミリメートルペトリ皿に置きます。次のステップのための十分なスペースを確保するために皿当たりのみ2-3の脳を収集します。
6. 解剖顕微鏡下で大脳半球の正中線から髄膜を取り去り、その後、海馬を解剖し、4.5 mLのCMF-HBSSを含む60ミリメートルペトリ皿に置きます。海馬は、三日月形STRUCとして区別することができることに注意してください皮質半球の内側表面にTURE、そしてそれは、心室によって横方向縁取られているように除去が容易です。
7. 15 mLチューブに回収した海馬組織およびCMF-HBSSを転送します。 2.5％トリプシンの0.5 mLを加え、次いで37℃で10分間インキュベートします。それは緩やかで、歩留まりを向上させる可能性があるため、パパインの代わりに、トリプシンを用いてもよいです。
8. 穏やかにチューブの底に平静海馬組織を残し、パスツールピペットによりトリプシン溶液を除去します。
9. 5分間37°Cでそれをインキュベートしながら穏やかに5 mLのCMF-HBSSで二回組織を洗浄します。第二の洗浄後、組織にCMF-HBSSの十分な量を添加することにより、少なくとも5 mLに総体積をもたらします。 10匹の以上の仔から海馬がある場合、最大8 mLのCMF-HBSSを添加することができます。
10. 組織解離のためにファイアーポリッシュピペットの二つの変種を準備します。一の変形の先端がピペットの通常の直径が、火仕上げ平滑エッジにあります。他のバリアリは半分に減少し、先端径を有するものです。簡潔には火炎源に斜めガラスパスツールピペットの先端を露出させ、その後、ピペットの先端を調べます。
    1. 先端エッジが平滑化された、または直径が減少されるまで、この手順を繰り返します。組織がこれらの細胞に損傷を与えることなく、単一の細胞を得るために解離されていることを確認するのに理想的な直径を見つけるために実践することが重要です。
11. 滑らかなエッジの通常のガラスパスツールピペットを介して約10回通過することにより、第1の海馬組織をトリチュレートし、その後減少した直径を有するピペットを介して10のパスにさらに5。目標はないか非常に少数の組織塊と細胞の均一な溶液を得ることです。
12. 血球計数器または自動セルカウンターを用いて細胞密度を決定します。 2つの半球から海馬を組み合わせた場合、典型的には、子犬あたり080万1.0個の細胞が得られます。
13. 皿に細胞懸濁液の十分な量を転送します60mmディッシュ30万個の細胞のプレーティング密度を得るために、培地をメッキ4 mLのポリ-L-リジンでコーティングしたカバースリップを含みます。細胞の密度は、意図される実験に応じて、100,000〜500,000で変化し得ます。
14. 3~4時間後、NBG培地中のグリア細胞を含む皿に付着ニューロンとカバースリップを転送します。これは、ニューロンを播種した側は、グリア細胞の層に向かって下向きにされるように行われるべきです。グリア皿当たり4-5カバースリップの合計を追加します。
15. 二、三日、メッキ後、グリア増殖を阻止するために皿当たり5μMの最終濃度にアラCのソリューションを追加します。
16. 各給で新鮮な培地の2.5mLの古い培地2mlを置き換えることによって、週に一度細胞を養います。加え余分な媒体は、経時的蒸発を補償することで、媒体の一部のみが、グリア細胞によって培地の一貫したコンディショニングを確保するために変更されます。これらの培養物は、典型的には、少なくとも1ヶ月間、健康です（図3）。ニューロンの生存は、100μMの最終濃度まで培地にAPVを添加することによって改善することができます。 APVは、NMDA受容体拮抗薬であり、グルタミン酸興奮毒性を減少させることによって生存を促進します。

結果

初代神経細胞培養物のこの「サンドイッチ」法では、海馬ニューロン（ 図3）は、パラフィンビーズ（ 図2）により分離グリア細胞（ 図1）のベッドの上で成長します。これは、ニューロンが選択的に最小限のグリア細胞の汚染をカバーガラス上で増殖するが、組織培養皿上で成長しているグリア細胞から十分な栄養サポートを受?...

ディスカッション

神経細胞を培養する「サンドイッチ」法は他の場所^2、11、よく説明してきたが、それを採用したい研究者のための欲求不満につながることができ、テキストだけで説明するのは非常に困難なプロトコルを通して、いくつかのステップがあります。

グリア培養、カバースリップ調製ニューロン培養および維持：この方法は、3つ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissection Instruments
Micro Dissecting Scissors	Roboz	RS-5910
Micro Dissecting Spring Scissors	Roboz	RS-5650
Micro Dissecting Spring Scissors	Roboz	RS-5605
Dumont Forceps (#5)	Roboz	RS-5045
Dumont Forceps (#PP)	Roboz	RS-4950
Name	Company	Catalog Number	Comments
Tissue Preparation
Trypsin (2.5%)	Gibco	15-090-046
Trypsin-EDTA (0.25%)	Gibco	25-200-072
Swinnex Filter Holder, 25 mm	EMD Millipore	SX0002500	Used as cell strainer. Assemble first with filter and autoclave
Isoflorane	Pharmaceutical Partners of Canada Inc.	CP0406V2
Hemocytometer	Hausser Scientific	1492
Grade 105 Lens Cleaning Tissue	GE Healthcare	2105-841	Used as cell strainer. Assemble first in filter holder and autoclave
Glass Pasteur pipettes with cotton filter	VWR	14672-412
HEPES (1 M)	Gibco	15-630-080
Hank's Balanced Salt Solution without Calcium, Magnesium, Phenol Red (HBSS, 10x)	Gibco	14-185-052
Glass Pasteur pipettes	VWR	14672-380
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas (Dnase)	Sigma-Aldrich	DN25-100mg
Butane bunsen burner	Wall-Lenk Mfg. Co.	Model 65
Centrifuge	Eppendorf	5810R
Name	Company	Catalog Number	Comments
Tissue Culture
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15-140-122
Petri Dish (100 mm)	Fisher	FB0875712
Petri Dish (60 mm)	Fisher	FB0875713A
Horse Serum	Gibco	16050-122	Can be used in place of BGS, but each lot must be tested due to inter-lot variation. Heat-inactivation of serum is recommended.
Sodium Hydroxide	Fisher Scientific	S318-1
Sodium Pyruvate	Sigma-Aldrich	P2256
Minimum Essential Medium (MEM)	Gibco	11-095-080
Neurobasal Medium	Gibco	21-103-049
L-Glutamine (200 mM)	Gibco	25-030-081
GlutaMAX Supplement	Gibco	35050061	Can be used in place of L-Glutamine in the NBG medium
Culture Dish (60 mm)	Corning, Inc	353002
Culture Flasks (75 cm^2)	Greiner Bio-One	658170
Cytarabine (Ara-C)	Sigma-Aldrich	C3350000
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
Bovine Growth Serum (BGS)	HyClone	SH3054103	Heat-inactivation is recommended before use.
B27 Supplement (50x)	Gibco	17-504-044
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418-100ml
Cryogenic Vials	VWR	89094-806
DL-2-Amino-5-phosphonopentanoic acid (APV)	Sigma-Aldrich	A5282
Name	Company	Catalog Number	Comments
Coverslip Preparation
Sodium tetraborate decahydrate (borax)	Sigma-Aldrich	B9876-1KG
Poly-L-Lysine Hydrobromide	Sigma-Aldrich	P2636
Histoplast Paraffin Wax	Fisher	22-900-700
Gravity Convection Oven	VWR	89511-404	Used for alternative coverslip cleaning method discussed in protocol
Ultrasonic Bath (Sonicator)	Fisher Scientific	15337400
Nitric Acid	Anachemia	62786-460
Ceramic Staining Racks	Thomas Scientific	8542E40	Used for alternative coverslip cleaning method discussed in protocol
Coverslips	Glaswarenfabrik Karl Hecht GmbH	1001/18	Manufacturer is very important, as neurons do not adhere well to lower quality glass
Boric Acid	Sigma-Aldrich	B0252
Name	Company	Catalog Number	Comments
Miscellaneous
Sterile Syringe Filters	VWR	28145-477	Used with BD syringe for filter-sterilization
Syringe	BD	302832	Used with VWR sterile syringe filters for fliter-sterilization
Water Bath	Fisher Scientific	15-460-16Q
Inverted Microscope	Olympus	CKX41
15 mL Conical Sterile Centrifuge Tubes	ThermoScientific	339650
50 mL Conical Sterile Centrifuge Tubes	ThermoScientific	339652