Ex Vivoひと肺腫瘍内常駐 cd8 陽性 T リンパ球の画像スライス共焦点顕微鏡を用いた

要約

このプロトコルでは、イメージの居住者腫瘍浸潤 CD8 T 細胞ひと肺腫瘍スライス内結合蛍光抗体で標識する方法について説明します。この手法は、共焦点顕微鏡を用いた CD8 T 細胞の移動の実時間解析を許可します。

要約

Cd8 陽性 T 細胞は、癌との闘いのキー ・ プレイヤーです。彼らは腫瘍に入力する必要があります CD8 T 細胞腫瘍細胞を殺すために腫瘍微小環境の内で移行し、腫瘍抗原に適切に対応します。2 光子励起顕微鏡など改善のイメージング技術の最近の開発と強力なマウス腫瘍モデルの使用は、いくつかの抗腫瘍 T 細胞の活動を調節するメカニズムに光を当てるが。一方、このようなシステムは、貴重な洞察力を提供している、いつもの人間応答が予測されるかではないです。人間、フィールドに私達の知識は人間の患者としての in vitro研究から固定腫瘍サンプルの説明から主に来る。ただし、体外モデルは複雑な三次元腫瘍環境の不足し、したがっては、生体内での不完全な近似 T 細胞の活動。Explanted ティッシュから作られた新鮮なスライスは、共培養の研究と動物モデルの間の重要なリンクとして機能することができます複雑な多細胞腫瘍環境を表します。もともとマウスのリンパ節¹で設定し、ゼウスの記事²で説明した、このアプローチは、メッキ³だけでなく、居住者の T 細胞⁴の両方のダイナミクスを調べる人間の腫瘍に今転置されています。

ここでは、人間の肺腫瘍スライスの準備、常駐 CD8 T および腫瘍細胞の免疫染色と共焦点顕微鏡を用いた腫瘍微小環境の cd8 陽性 T リンパ球の追跡のためのプロトコルを説明します。このシステムは、一意に腫瘍 T 細胞の移動を好む新免疫療法剤のためのスクリーンに置かれました。

概要

CD8 T 細胞はがんに対する戦いで重要な役割を再生します。ただし、多くの抑制メカニズムと、T リンパ球悪性細胞を殺すことを防止できます。最後の年間では、T 細胞にブレーキをリリースいくつかの有望な作戦が開発し、⁵のクリニックで使用されています。かなりの注目を保持する 2 つの方法、チェックポイントを対象とした免疫抗体、抗 PD 1 と養子の T 細胞治療など。それにもかかわらず、最近の成功にもかかわらず患者のサブセットのみの恩恵これら療法⁶。主要な課題より効率的な治療法を開発するためにがん免疫療法への抵抗のメカニズムを識別するためにです。別の挑戦は、療法の特徴し、その効力と安全性のためにテストする小説のモデル システムを開発することです。 これまでのところ、これらの試金のほとんどは悪い腫瘍組織の複雑さを模倣の in vitro細胞培養システムに基づいています。

組織スライス前のヴィヴォは有望な技術で元の組織微小環境⁷が保持されます。長年にわたって、さまざまな組織における T リンパ球のダイナミクスを追跡するは、このアプローチを設けてください。追加マウスのリンパ節スライスの上に蛍光に分類された T 細胞が組織に移行し、その適切なアイソレータケージ手がかり^1,2に応答が示唆されました。 同様に、人間の肺腫瘍スライスにオーバーレイ T リンパ球は腫瘍実質³に急速に募集しています。この手法を使用して、配布とひと腫瘍^3,4内 T 細胞の移動を制御する重要な要素として細胞外のマトリックスを同定しました。精製前のヴィヴォの動作、メッキの T 細胞が常駐腫瘍内 T リンパ球の動作を必ずしも反映しないため、このアプローチ⁴最近精製しています。

ここで新鮮なひと肺腫瘍から作られたスライス内の居住者の T リンパ球を追跡するプロトコルについて述べる。内因性の T 細胞腫瘍の新鮮なスライスとの監視の蛍光抗体での染色 (アガロース埋め込み、vibratome が埋め込まれた組織の区分を含む)、人間の肺腫瘍のスライスの準備成っている別の手順共焦点顕微鏡を用いた細胞。

プロトコル

ひと腫瘍は、フランスの法律の記事 L.1121-1 アプリケーションで支援パブリックメソッド-Hôpitaux ・ ド ・ パリ (AP HP)、フランスの倫理委員会の合意が得られました。書面によるインフォームド コンセントは研究の包含の前に患者から得られました。

1. 人間の肺腫瘍の取得

1. ⁴肺腫瘍の完全な外科的切除を受けたステージ - III 非小細胞肺癌患者から新鮮な肺腫瘍のサンプルを取得します。
2. 冷たいロズウェル パーク記念研究所 (RPMI 1640) 媒体を含んでいる 15 mL の円錐管に非固定新鮮な腫瘍を輸送します。手順 2.7 まで氷上で 30 分間おきます。
   注: 腫瘍は午後に受け取ったら、4 ° C 夜間、プロセス次の日にそれらを配置します。この場合、5% ウシ胎児血清 (FBS) に RPMI 1640 メディアを補足します。

2 アガロースを埋め込むとひと肺腫瘍の vibratome スライス

注: は、無菌条件下で 2.10 まですべての手順を実行します。

1. 20 mL 滅菌リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) カルシウムとマグネシウムなしの 1 g の低融点のポイント アガロースを溶解して埋め込むため 5% アガロース溶液を準備します。このソリューションを電子レンジ、アガロースを完全に溶解するまで。37 ° C で 5 分間 37 ° C でインキュベーターでソリューションを配置することによって冷却する agarose を許可します。
2. ティッシュ文化フードで完全な RPMI 1640 含む培地 (フェノールレッド) なし 10% 牛胎児血清 (FBS)、4 mM L グルタミン x ペニシリンとストレプトマイシン 1 を準備します。
3. 6 も細胞培養プレートによくあたり 1.1 mL 完全 RPMI 1640 培地を追加し、各ウェルに 30 mm 細胞培養インサートを配置します。2.12 のステップまでプレートを 37 ° C で 30 分間、インキュベーターに置いておきます。
4. 場所は、35 mm のプラスチックの皿 RPMI 完全培地でいっぱいでステンレス平ワッシャー (内径 5 mm、直径 10 mm、厚さ 1 mm) を滅菌.洗濯機は、さらに vibratome カット スライスに抗体を集中する使用されます。
5. 腫瘍生検を 10 cm プラスチック皿に置き、約 5 × 5 mm の小さなキューブ形断片に鋭い刃を持つ腫瘍を切った。
6. インキュベーターからアガロースを取るし、35 mm のプラスチックの皿に溶液を注ぐ。
7. 慎重に媒体の過剰を削除するのに組織ワイプに腫瘍フラグメントを転送するためには、鉗子のペアを使用します。Agarose にフラグメントを挿入し、プラスチックの皿の下部にそれらを配置します。Agarose のゲルのまま固めるため 5 分間氷の上。
8. Agarose を確固たるもの、一度プラスチックの皿を反転し、ヘラを使用して全体のゲルを解放します。
9. 周囲の周囲の組織のゲルの 3 ~ 5 mm を残して腫瘍フラグメント過剰アガロースをトリミングするのにには、鋭い刃を使用します。
10. 非毒性ブチル シアノアクリ レート系組織接着剤のドロップで、vibratome の試料ディスク上各アガロース ブロックをマウントします。滅菌の氷冷 PBS の vibratome バッファー トレイを入力し、試料ディスクをトレイにインストールします。
11. Agarose のカットには、350 μ m の厚さのスライスに組織が埋め込まれています。低速の範囲の速度で vibratome 設定を調整 (0.2-0.3 mm/s) と中距離 (1.5 mm) の振動数。
12. カットされているフラット 6 ウェル プレート (ステップ 2.3) のセルの文化挿入に配置腫瘍スライスを収集微細鉗子を使用して、慎重に。各挿入の 1 スライスを転送します。彼らは簡単に破損することができますスライスを処理するときは、細心の注意を使用します。
13. 微細鉗子を使用すると、各スライスごとにステンレス製のワッシャーを配置します。洗濯機がよく agarose の周囲の腫瘍組織に配置されていることを確認します。
14. 37 ° c 10 分進む免疫染色のための 5% CO₂加湿インキュベーターで培養プレートを維持します。

3. 常駐 CD8 T 細胞と腫瘍細胞の免疫染色

1. (最終濃度 10 μ G/ml) 抗体と RPMI 1640 メディアのフェノールレッドなし核染料 (最終濃度 1 μ g/mL) を希釈します。
   注: 使用蛍光結合抗 CD8 (マウス IgG、SK1 のクローン) と反 EpCAM (上皮細胞接着分子) (マウスの IgG ょん-125) それぞれ cd8 陽性 T リンパ球と腫瘍上皮細胞をラベルする抗体。ラベル線維芽細胞と血管内皮細胞の活性を蛍光結合抗-CD90/Thy1 (マウス IgG、クローン 5E10) 抗体を使用します。4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) を使用して組織の実行可能性を評価するために危険にさらされた細胞膜と細胞の核にラベルを付ける。
2. インキュベーターから培養皿を外し、ステンレス製のワッシャーの内側任意の液体を吸引ピペットを使用します。細胞培養インサート (ステップ 2.3) 下に置かれる 1.1 mL RPMI 1640 メディアを取り外さないでください。
3. スライスに触れて、ピペット チップを使用せず、腫瘍の各スライス上に抗体溶液 40 μ L を追加します。
4. 抗体の汚損を許可する 15 分の 37 ° C でプレートを孵化させなさい。
5. 微細鉗子でワッシャーを削除、スライスおよび RPMI 1640 メディアのフェノールレッドなしディップそれら 10 s を取り出します。戻って細胞培養インサートの上にスライスを配置し、フェノールレッド フリー RPMI 1640 のドロップを追加各スライスごとに中。イメージングを 37 ° C 10 分続行でプレートを維持します。

4. イメージングおよびひと肺腫瘍スライス内常駐 CD8 T 細胞の遊走を分析

注: このプロトコルで使用されている共焦点顕微鏡は、水浸対物レンズ × 25 装備ディスクを回転直立 (25 x/0.95 エヌ ・ エイ)。

1. 顕微鏡のセットアップの準備
   1. 顕微鏡による蓄熱体の温度 37 ° C でイメージング セッションを開始する前に、いくつかの時間を設定します。
   2. 常に腫瘍のスライスを灌流するシステム設定酸素 (5% CO₂95% O₂) フェノールレッド フリー RPMI 培地 (図 1)。蠕動ポンプを使用してイメージングの商工会議所に灌流メディアを流れ、廃棄物収集フラスコにソリューションを吸引します。
   3. 灌流管を通過する酸素のソリューションを許可する蠕動性ポンプを実行します。
2. 微細鉗子で 6 ウェル プレートと 35 mm のプラスチックの皿にはフェノールレッド RPMI 培満ちて転送からスライスを取り出してください。2 mm 間隔のスレッドで 19.7 mm 直径スライス アンカーでスライスを固定します。ペトリ皿を顕微鏡のイメージングのステージに配置します。灌流システムの入口と出口の先端に接続します。灌流システムをオンにし、メディア流量を 0.8 mL/分に設定します。
3. スライスに水浸対物レンズを下げます。明視野光とスライスの上に焦点を当てます。

適切な蛍光灯で、CD8 T 細胞、腫瘍島 (EpCAM 陽性) と (CD90 の肯定的な) の間質領域を含む領域を選択します。DAPI 染色切断面より深い組織に評価を行い、スライス内の細胞の生存率を確認してください。
注: 健康的なスライスには、切断面から数ミクロンの DAPI 陽性細胞の少数だけが含まれています。

次のアクションで撮像セッションを設定します。

1. 3 蛍光物質の蛍光信号の強さに応じて 50 に 800 ms とレーザー強度 20 ~ 40% 間の露光時間を設定します。
2. 腫瘍スライス内のイメージを残しスタックを選択します。
   注: ここでは、z 軸で 60-70 μ m の深さの合計にまたがる 10-12 光面を捕獲しました。
3. 最初のラベルの付いた CD8 T 細胞の下約 10 μ m で開始位置を選択します。
4. 10-30 の間各 z スタック画像間の時間間隔を定義する s と 10 〜 30 分間合計録画時間。

参考資料⁴の説明に従って住民 CD8 T 細胞の移動を分析します。

1. データをトラッキング ソフトウェアにインポートすると、フィールドに各 CD8 T 細胞のためのスポットを作成します。細胞の直径やイメージの蛍光細胞によると検出のしきい値を調整します。
2. トラックを検査し、それらを削除することによって任意の無関係なトラックを削除します。接続し、別のトラックと同じトラックの別の時点の取り外しによって正しいトラック。(トラックの速度、トラック変位の長さ) のデータを表計算ソフトにエクスポートします。

結果

ひと肺腫瘍は通常高い実質^3,4に優先的にある CD8 T 細胞の浸潤しています。このプロトコルに従うことによって、1 つはひと肺腫瘍スライスに CD8 T immunostained の数が多いを可視化するはずです。アンチ EpCAM とアンチ CD90 抗体と共同の分類膵島腫瘍と間質領域を記述する許可する必要があります。フィブリル型コラーゲン、豊富な腫瘍間質では、2 光子励起顕微鏡^3,4第 2 高調波発生を用いた外因性染色することがなく視覚化できます。いくつかの人間の肺の腫瘍は膵島腫瘍と間質の間の明確な区別がないことに注意してください。このような腫瘍は、抗体の非特異的結合および DAPI 染色によって識別される細胞の壊死の大部分を提示試料だけでなく、破棄しなければなりません。公開された結果と一致してひと肺癌、卵巣癌、CD8 T 細胞よりに集中してくださいいる間質腫瘍膵⁴と比較してくださいいます。CD8 T 細胞腫瘍細胞と CD90 分布特性の代表例を図 2に示します。

スライス アッセイは、異なる腫瘍領域の居住者の T 細胞運動解析のためことができます。さまざまな地域における CD8 T 細胞の運動性を比較するための有用な基準には、(パスの長さをサンプリング時間で割った値) の平均の速度と変位の長さ (最初と最後のトラックの間ベクトル) が含まれます。膵島腫瘍で不足しているが CD8 T 細胞は間質 (図 3) と比較してこの区画にもっと積極的に移行します。平均では、個々 の CD8 T 細胞の平均速度は高の内と間腫瘍変動⁴腫瘍間質では 4 μ m/分に近いはずです。腫瘍間質に居住者の T 細胞の運動性は密度と細胞外マトリックス繊維^3,4の方向に強く影響されます。成功した実験は、以下の T 細胞に比べて緩いマトリックス領域、出版された結果^3,4と一貫性のある密なマトリックス領域に存在になります。

いくつかのひと肺腫瘍が居住者の T 細胞のイメージングを排除の自家蛍光の非常に高いレベルを示すことに注意してください。このような機能は急速に撮像セッションの初めに観察されます。される腫瘍を破棄する必要があります。蛍光腫瘍における居住者の CD8 T 細胞の代表的な例は図 4に示します。

図 1: 灌流システムの写真。A) フェノールレッド フリー RPMI ソリューションは 5% C0₂, 95% O₂で濃縮されています。B) ソリューションは、蠕動ポンプによって灌流します。C) RPMI ソリューション入口経由して培養皿に入る。コンセント, ソリューションは廃棄物コンテナーに商工会議所からポンプによって吸引です。吸引チップがソリューションの高さを決定するのにレベルで設定されているに注意してください。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 2: ひと肺腫瘍における細胞の常駐 CD8 T 分布。ひと肺腫瘍スライスの代表的な画像を染色 CD8 (緑)、(青) EpCAM と CD90 (赤)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 3: 運動住民 CD8 T 細胞ひと肺腫瘍。個々 の居住者 CD8 T 細胞間質 (赤) とひと肺癌スライスの腫瘍細胞 (青) 地域での軌跡。スライスは、示された抗体で染色され、20 分共焦点顕微鏡で視覚化されます。線維性コラーゲンは、2 光子顕微鏡による第二高調波発生 (SHG) によって終わりに検出されました。トラックは CD8 T 細胞変位長さに応じて色分けされ。この画像は、 ⁴から変更されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 4: される人間の肺腫瘍の代表的なイメージです。腫瘍スライスは (青) (緑) CD8 と EpCAM 染まりました。SHG 信号は赤です。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

ディスカッション

保存された腫瘍では共焦点顕微鏡を用いたひと肺腫瘍スライスと CD8 T 細胞の動的挙動の評価を生成するための簡単、迅速、かつ堅牢な手法を説明します。このプロトコルはマウスのリンパ節スライス²にメッキの T 細胞の監視について説明します前のゼウス記事の絞り込みです。

蛍光色素の漂白は、かにやフィコエ リスリンのような第一世代染料と特に考慮されなければなりません。2 光子顕微鏡を用いた直接つながれる抗体の顕著な変質が発生したことがわかった。逆に、最小限の退色は、共焦点顕微鏡、特に最近開発された明るい蛍光染料を使用して気づいた。

抗体は比較的大きな分子であり、したがって組織への浸透が困難することができます。この手順は、インキュベーション時間を増やすことによって改善できます。さらより小さい使用良い代替試薬など直接結合抗体を表すの Fab 断片の汚損。

このプロトコルで記述されているすべての抗体は以前検証、明るい染色⁴を生成する知られています。したがって、アイソタイプ コントロールは必要ではありません。ただし、他の抗体を使用してこのメソッドへの変更が必要な場合アイソタイプ コントロール抗体の使用が推奨高い。

本実験系は、いくつかの制限を示します。切断手順は特に切断面近くの CD8 T 細胞の挙動に影響を与える組織に損傷を与えます。また、可溶性因子 (例えばケモカイン) T 細胞の移動を制御する楽器の数は失われます。これらの問題を回避する 1 つの方法は、数十ミクロンおそらく健康的な地域組織の表面からにある T 細胞を監視することです。公開実験では、T 細胞、組織の奥深くにローカライズが⁴カットの表面付近の T 細胞よりももっと積極的に移行することを明らかにします。私たちの研究、共焦点顕微鏡を使用してきたが 2 光子顕微鏡が空間分解能の深さを増加する可能性があります。

このアプローチは、中性分子ではない蛍光つながれる抗体の使用に依存します。フルサイズの抗体は、さまざまな方法で T 細胞の正常な機能に影響を受けやすい。まず、抗 CD8 抗体はリンパ球の細胞骨格に影響を与えることができる細胞内シグナル伝達カスケードを誘発することによって T 細胞の移動を変更できます。第二に、抗 CD8 抗体は CD8 と MHC の間の相互作用を調節することがクラス I 分子抗原認識プロセスの重要なステップです。第三に、そのまま抗体は非固有の信号を高めるため腫瘍の分散、したがって影響を受け多くの骨髄細胞によって表現される Fc 受容体にバインドできます。我々 兆候があるような問題に我々 のデータが影響を受けることおそらく居住者の骨髄系細胞の Fc の受容器、培養細胞とは異なりと飽和している免疫グロブリン腫瘍環境の中に存在するため。確かに、ラベリング手順、無料の Fc 受容体をブロックする知られているプロセスの間に血清の添加では免疫染色は変更しませんでした。それにもかかわらず、その Fc 領域で変異を欠いている Fc 領域として、抗体の抗体の Fab 断片とラクダ科動物由来抗体断片⁸蛍光トレーサーと居住者の細胞を追跡する他の代替戦略を表します。

最後の十年にわたっていくつかのモデル システムを開発し、T リンパ球のリアルタイム イメージング用があります。T 細胞以前精製および培養と抗原提示細胞の生体外の準備が含まれます。このような準備は、抗原認識と応答性のメカニズムを定義することで著しい進歩を許可しています。しかし、彼らは、組織環境の複雑さを欠いています。その他の準備は、ネイティブの組織の構造を忠実に再現詳細を確立されています。例については、精製する T 細胞の三次元コラーゲン ゲルのマトリックス埋め込まれた、フラグメントは、蛍光イメージング技術^{9 T リンパ球の挙動を監視する使用されている細胞組織の文化だけでなく、}.これらのシステムは、ネイティブの組織に近いアーキテクチャの利点を提示、彼らは他の重要な細胞および溶ける要因を欠いています。マウスでそのままオルガン¹⁰の本当に生理学的環境における T 細胞を追跡する 2 光子生体顕微鏡を採用されています。しかし、このようなアプローチはセットアップが技術的に難しいです。さらに、マウス モデルは人間の生理に顕著な違いを示します。

このプロトコルで説明する手法は、共同文化研究と動物モデルの間の重要なリンクとして機能する一意に配置されている複雑な多細胞腫瘍環境を表します。

Cd8 陽性 T リンパ球抗体が生成されているより他の細胞の運動性を追跡するため、ここに記述されているプロトコルを使用もできます。さらに、技術は他の人間およびマウスの腫瘍や組織に適応することができます。例えば、我々 は新鮮な扁桃腺の抗 CD19 抗体を用いた B 細胞ダイナミクス ラベル リアルタイムで画像ができた。

このプロトコルで説明する手法は、組織における T 細胞の運動を制御する治療上の分子の画面にできます。文化システムのアクセシビリティいくつかの薬理学的試薬を適用し、T 細胞の移動の結果をテストすることができます。それは腫瘍の成長、CD8 T 細胞が低移行を示すことが今受け入れられる、腫瘍細胞¹¹との接触を低減します。重要なは、腫瘍のセル領域における T 細胞の希少の存在が悪い結果と関連付けられていると T 細胞を用いた癌免疫療法に抵抗性の機構の 1 つと見なされます。T 細胞から腫瘍に移行を制限する複数の障害物は、密な細胞外マトリックスを含む識別されています。この点では、T 細胞の運動性と悪性細胞との相互作用を復元することができる分子の同定は、癌免疫療法の重要なステップを表します。以前の研究では、コラゲナーゼ、鋭く、人間の肺のスライスに適用とコラーゲンの部分的な分解が腫瘍細胞と T 細胞との接触を向上することがわかった。

最後に、いくつかの日^7,12,13までの文化の人間の腫瘍のスライスを維持する可能性は、T 細胞と免疫療法の長期的に有望なアプリケーションの数を提供しています。ただし、長期培養中のモデル システムの安定性は徹底的に評価する必要がある重要なパラメーターです。

新鮮で健康な組織を得ることは cd8 陽性細胞、腫瘍細胞、間質要素の良い免疫染色質スライスを生成する重要な要因です。処理の前に 4 ° C、腫瘍生検を保つことが重要です。

微細鉗子でスライスの処理は、このプロトコルでもう一つの重要なステップを表します。これは、agarose が簡単に破損することができます細心の注意を実行する必要があります。Agarose のカットは、ソリューションを含む抗体の漏洩の結果ステンレス洗濯機によって作られたシールが侵害されます。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Upright confocal microscope	Leica		The use of a spinning disk confocal is recommended
Imaris software	Bitplane		This sofware is used for visualization of images and tracking of T cell migration
Vibratome	Leica	VT1200S
Fine Forceps	World Precision Instruments	14142
30 mm Culture inserts	Millipore	PICM0RG50
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium, GlutaMAX Supplement	ThermoFisher	61870010	Complete RPMI-medium is made by adding 10 % heat-inactivated fetal calf serum and Penicillin/streptomycin
Phosphate-buffered saline (PBS)	ThermoFisher	20012019
Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS)	Invitrogen	14170088
Low gelling temperature Agarose, type VII-A	Sigma-Aldrich	A0701
Non-toxic butyl Cyanoacrylate Glue, Vetbond	3M	1469
Slice anchors, 19.7 diameter, 2 mm spacing threads	Warner Instruments	64-1415
Stainless steel washers, 5 mm of inner diameter	Amazon	B004K1FDGQ
BV605-conjugated anti-CD8 (clone SK1)	BD Biosciences	565289
FITC-conjugated anti-EpCAM (clone HEA-125)	Miltenyi Biotec	130-098-113
BV510-conjugated anti-CD90 (clone 5E10)	Biolegend	328125
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	ThermoFisher	D1306