慢性リンパ球性白血病患者におけるメチル-CpG結合ドメイン捕捉に基づく包括的DNAメチル化解析

要約

この研究では、最適化されたメチル-CpG結合ドメイン（MBD）配列決定プロトコルと、慢性リンパ球性白血病（CLL）患者において差別的にメチル化されたCpGリッチ領域を同定するための計算パイプラインについて記載する。

要約

癌における長い非コードRNA（lncRNA）の役割は、癌の発達および進行中のそれらの機構的機能の理解への関心の高まりから、最前線に来ている。それにもかかわらず、特に慢性リンパ球性白血病（CLL）において、lncRNAおよび癌における反復配列の全体的なエピジェネティックな制御は十分に研究されていない。この研究では、メチル結合ドメイン（MBD）タンパク質を用いた二本鎖メチル化DNA断片の免疫沈降に基づく捕捉、次世代シーケンシング（MBD-seq）に続くユニークなアプローチに焦点を当てています。 2つの予後サブグループ（5つのIGVH変異サンプル+ 5つのIGVH非変異サンプル）に属するCLL患者サンプルをこの研究で使用した。分析により、正常な健康対照と比較して5,800の過剰メチル化および12,570低メチル化CLL特異的差異的メチル化遺伝子（cllDMG）が明らかにされた。重要なことに、これらの結果は、いくつかのCLL特異的な、差異的にメチル化されたlncRNAを同定した鋭い要素、および予後の価値を潜在的に有するタンパク質コード遺伝子が含まれる。この研究は、CLL患者試料を用いた高度にCpGが豊富な領域における全体的メチル化プロファイルの包括的な解析のために開発されたMBD-seqおよびバイオインフォマティクスパイプラインの詳細なプロトコルを概説している。最後に、タンパク質コード遺伝子およびlncRNAを、パイロシーケンシングを用いて検証した。これは、CpGメチル化レベルを分析してMBD-seqプロトコールからの知見をさらに裏づける高度に定量的な方法である。

概要

近年、全世界のDNAメチル化プロファイルを解析するための次世代シーケンシング技術の使用が増えています。メチル化感受性制限酵素消化、およびメチルCpG特異的抗体を用いたメチル化DNAの免疫沈降に基づいて、ゲノムワイドメチル化アッセイ（マイクロアレイおよび非マイクロアレイベースの方法を含む）を開発した。

異常なDNAメチル化は、慢性リンパ球性白血病（CLL）を含む白血病およびリンパ腫の特徴の1つである。以前は、私たちを含むいくつかのグループが、ゲノムDNAの重亜硫酸塩変換、マイクロアレイベースの方法または全ゲノム配列決定1,2,3を用いて、異なるCLL予後サブグループおよび正常な健康なB細胞コントロールのDNAメチル化プロファイルを特徴付けた^{、 4。ゲノムDNAの重亜硫酸塩の変換は、修飾されていないシトシンのウラシルへの脱アミノ化をもたらし、修飾メチル化シトシンをゲノムに残す。一旦変換されると、DNAのメチル化状態は、マイクロアレイベースまたは全ゲノムバイサルファイトシークエンシング（WGBS）のような異なる定量的または定性的方法を用いたPCR増幅および配列決定によって決定することができる。重亜硫酸塩変換に基づく方法は多くの利点を有し、DNAメチル化レベルを分析するために異なる癌型で広く使用されているが、この技術に関連するいくつかの欠点がある。 WGBSシークエンシングにより、より少ないDNA量で1塩基対の分解能が得られ、多数のサンプルを分析するのに最適なオプションです。しかしながら、この方法は、ゲノム5,6中の 5mCレベルと5hmCレベルとの間の改変を区別することができない。さらに、マイクロアレイに基づく方法は完全なcを提供しないゲノムの超過。}

私たちの研究室^7の最近の研究では、重亜硫酸塩変換ではなく、免疫沈降に基づく方法を用いて、CLL患者および正常な健常対照における全体的な規模で高度にCpGが豊富な差別的にメチル化された領域を同定した。 Inmethyl-CpG結合ドメイン（MBD）の次世代配列決定（MBD-seq）では、二本鎖断片化DNAの濃縮はCpGメチル化の程度に依存する。この方法は、重亜硫酸塩変換法の欠点を克服することができ、バイアスのないPCRおよびPCR非依存的な方法でCpGメチル化のゲノムワイドカバレッジを提供することもできる。さらに、重亜硫酸塩変換に基づくマイクロアレイ法とは異なり、MBD-seqを使用して、長い散在性核要素（LINE）、短い散在核要素（SINE）、長い末端反復配列（LTRS）などの反復要素のメチル化状態を分析することができる。 等 。しかしながら、亜硫酸水素塩の変換方法と比較して、MBD-seqプロトコルは比較的大量の入力DNAを必要とする。また、配列決定の質およびデータは、使用される抗体の特異性、親和性および品質に依存する。

現在の研究では、次世代シーケンシングのためにメチル化DNAを濃縮するための詳細なMBD-seqプロトコルについて説明しています。これは市販のメチル化DNA結合濃縮キット（ 材料表に記載されている）と、メチル化シーケンシングデータを視覚化して解釈してCLL特異的なハイパーサイトおよびハイポメチル化領域を同定する計算パイプラインを使用しています。基本的に、この方法は、メチル化CpGで富化されたDNAを抽出するためのメチル化CpGとのヒトMBD2タンパク質相互作用のMBDの能力を利用し、メチル化DNAのハイスループットシーケンシングが続く。

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プロトコル

CLLサンプルを収集するための倫理的承認は、2007年5月21日から、次の登録番号：EPN Gbg dnr 239/07である。すべてのCLL患者は最近改訂された基準⁸に従って診断され、サンプルは診断時に収集された。研究の患者は、書面による同意が得られた後、スウェーデン西部の様々な血液学部門から含まれていた。この研究では、白血病細胞の腫瘍パーセンテージが70％以上であるCLL末梢血単核細胞（PBMC）試料のみを選択した。

1.準備

1. 製造者の指示に従って、市販の単離キット（ 材料表参照）を用いて、CLLおよび正常な健康な末梢血サンプルからのDNA抽出のためのPBMCを単離する。
2. オートクレーブ1.5mLチューブ。メチル化DNA結合キットのすべての試薬を解凍します（ 材料表を参照）。
3. ビーズを洗浄し、キットで提供されるMBDタンパク質を希釈するために、DNaseフリーの水を使用して、キットが提供する5xストック洗浄バッファーから1xビーズ洗浄バッファーを調製します。
4. 以下の項目を事前に入手または準備する：3M酢酸ナトリウム、無水エタノール、およびDNA沈殿のための70％エタノール（ 材料表 ）。

ゲノムDNA抽出および超音波処理

1. 市販のDNA抽出キット（ 材料表 ）を使用して、製造業者のプロトコールに従って、患者および正常なPBMCサンプルからゲノムDNAを単離する。 260nmの分光光度計を用いてゲノムDNAを定量する。
   注：DNA抽出カラムの容量は5~600万個の細胞です。したがって、5百万個以上のセルを持つサンプルに複数のカラムを使用することが重要です。 100μLの10mM Tris EDTA（TE）緩衝液を合計して等量でDNAを2回溶出する。メチルで使用されるMBD-ビオチンタンパク質MBDシークエンシングのためのminerキットは一本鎖DNAに結合しません。したがって、溶出したDNAを凍結または4℃で保存して二本鎖の性質を保持することは非常に重要です。
2. TEバッファー（pH 8）を用いて各サンプルのゲノムDNA 5μgを合計200μLに希釈し、25 ng /μLの最終濃度を与えます。
3. 合計30サイクル（1サイクルにつき30秒間および30秒間オフ; 5サイクルごとに、サンプルを底部に集めるためにチューブを短時間回転させる）のために、超音波処理器（ 材料表 ）を用いて特別に設計されたチューブで超音波処理を行う。
   注：これは150 bp〜300 bpの範囲の断片化したDNAを生成しますが、これはこのプロトコールに最適です。
4. DNA電気泳動イメージング装置を使用して、市販のプレキャスト2％アガロースゲル上で1μLの断片化DNAサンプルおよびDNAサイズラダーを実行することによって、MBD配列決定の次のステップに進む前に、すべてのサンプルの超音波処理範囲をチェックする。視覚化する彼は標準的なUVトランスイルミネーターを使用しています。

MBD-ビオチンタンパク質との結合前のビーズ調製

1. キットによって提供されるストックチューブから磁気ストレプトアビジンビーズを再懸濁し、均一に懸濁液を得るために上下に穏やかにピペッティングする。ビーズをボルテックスしたり、乾燥させたりしないでください。
2. 50μLのビーズ（断片化したDNAサンプル5μgごとに）を別個の清潔で標識された1.5mLチューブに入れる。 50μLの1×ビーズ洗浄バッファーを加えて最終容量100μLにします。
   注：ビーズを洗浄するために0.5 mLのポリメラーゼ連鎖反応（PCR）ストライプを使用する場合は、キットプロトコールで述べたように、チューブあたり約150〜200μLの洗浄バッファーを使用します。しかし、1.5mLチューブの場合は、ビーズ洗浄のために、チューブあたり少なくとも250μL〜300μLの洗浄バッファーを添加してください。
3. チューブを磁気スタンド上に1分間置いて、すべての磁気ビーズをチューブの内壁に集中させる磁石に面している。 200μLピペットを使用して、ビーズに触れることなく、液体を取り出します。
4. チューブを磁気スタンドから取り出し、1×ビーズ洗浄緩衝液250μLを加え、ビーズをピペットで静かに混合する。
5. すべてのサンプルについてステップ3.3と3.4を少なくとも4〜5回繰り返し、最後に1xビーズ洗浄バッファー250μLに再懸濁する。氷上に置いておいてください。

MBDビオチンタンパク質を洗浄したビーズに結合させる

1. チューブを分離するために35μLのMBDタンパク質（DNAサンプル1μgにつき7μL）を添加し、1倍ビーズ洗浄バッファーを使用して全量を250μLにします。
2. 洗浄したビーズ250μLに250μLの希釈したMBDタンパク質を添加し、室温で1時間、エンドツーエンド回転させる。
3. ビーズおよびタンパク質を1時間混合した後、磁気ストレプトアビジンビーズで結合したMBDタンパク質ビオチンを洗浄する。
   1. チューブを磁気スタンド上に1分間置き、t彼はピペットを使ってビーズに触れることなく液体です。 250μLの1×ビーズ洗浄バッファーを添加し、チューブを室温で5分間回転ミキサー上に置く。
4. 再度4.3.1ステップを2回繰り返し、洗浄したMBDビオチンビーズを1xビーズ洗浄バッファー200μLに再懸濁し、ビーズをメチル化DNA捕捉のために準備する。
   注：このようにして2-3回洗浄すると、バックグラウンドの非結合MBDタンパク質ビーズがすべて除去され、MBDタンパク質結合ビーズと断片化ゲノムDNAとの効率的な結合が改善される。

5.断片化されたゲノムDNAを有するMBD-ビオチンビーズの結合

1. 清潔な1.5 mLのDNase-freeチューブに、100μlの5×ビーズ洗浄バッファーと180μlの断片化ゲノムDNAを加えます（ステップ2.3）。 DNaseを含まない水を用いて最終容量を500μLにする。
2. 断片化したゲノムDNAの残りの20μLに380μLのDNaseフリー水を加え、凍結する。これらのサンプルを入力DNとして使用するAは、最終的に溶出されたメチル化DNAサンプルとともに後にそれらを制御し、沈殿させる（ステップ7.1参照）。
3. 洗浄したMBDビオチンビーズを含むチューブ（ステップ4.4）を磁気スタンド上に1分間置き、ビーズを乱さずに液体を除去する。ビーズ洗浄バッファーで希釈した500μLの断片化ゲノムDNAを添加する。
4. すべてのチューブをパラフィンフィルムでしっかりと密封し、4〜8℃で終夜の回転スタンド（8〜10rpm）に一晩放置する。
   注：DNAとビオチン - ビーズの結合反応は室温で1時間行うことができますが、4℃で一晩放置すると最終的なメチル化DNAの回収率を向上させることができます。

6.非結合DNAの除去およびビーズからのメチル化DNAの溶出

1. DNAおよびMBDビーズ結合反応の後、チューブを磁気ラック上に1分間置き、すべてのビーズをチューブの内壁に集中させる。
2. 触らずにピペットで上清を除去する。この結合していないDNAサンプル画分を氷上に保存する。
3. ビーズに200μLの1×ビーズ洗浄バッファーを加え、室温で3分間回転スタンドにチューブを置きます。磁気スタンドにチューブを置き、液体を除去する。残りの未結合DNAを除去するためにもう2回洗浄を繰り返す。
4. 最終洗浄後、DNAを溶出させるためにキットに含まれている200μLの高塩溶出バッファー（2,000mM NaCl）を加えます。
5. チューブを回転スタンド上に室温で15分間置く。磁気スタンド上に1分間置き、ピペットを使用して上清を注意深く新しい清潔な1.5 mLチューブに移す。
6. 200μLの高塩溶出バッファーを添加し、チューブを室温で15分間回転させて溶出を繰り返します。最初の溶出液200μLを含む同じチューブに2回目の溶出液を加えます。
   注：最終溶出されたDNAの最終的な400μLは、エタノール沈殿の準備ができており、精製された次世代シーケンシングに適したDNA

7.エタノール沈殿とメチル化DNAの濃縮

1. 1μLのグリコーゲン（20μg/μL;キットに含まれています）を加えます。 3M酢酸ナトリウム（pH5.2）40μL;氷冷した無水エタノール800μLを溶出したDNA400μLとステップ5.2で調製した400μLの入力DNAサンプルに加えた。
2. ボルテックスしてチューブをよく混合し、-80℃で一晩インキュベートする。
3. チューブを12,000 xg（最高速度）と4℃で遠心分離する。ペレットを乱すことなく上清を慎重に捨て、70％エタノール500μLを添加し、チューブをボルテックスする。
4. 4℃で15分間最高速度で再度遠心分離し、ピペットを使用して上清を注意深く除去する。室温で1分間最高速度でチューブを遠心分離し、ピペットチップを使用して残留エタノールを完全に除去する。
5. 室温で5分間ペレットを空気乾燥させる。成人。 DNAペレットに10μLのDNaseフリー水を加えます。メチル化DNA定量（ステップ7.6）、MBDシーケンシング（ステップ7.7）、および分析（セクション8および9）に進む。
6. 製造元の指示に従って、市販の蛍光定量キット（ 材料表参照）を使用して、回収したメチル化DNAサンプルを定量します。
7. 注：このプロトコールを使用して、30〜50ngの最終DNAを各サンプルから回収した。 DNAサンプルは、下流のライブラリー構築とハイスループットMBDシーケンシングのためにドライアイスで送る準備ができています
8. 参考文献⁹に記載されているように、市販のプラットフォーム（ 材料表 ）を用いてDNAライブラリーの構築および高スループットMBD配列決定を行う。
   注：最終的なメチル化DNAの初期品質管理のために、すべてのサンプルについて50-bpペアエンド配列を使用してライブラリー調製を行います。シーケンシング後の品質管理のために生データを処理する。ステップ8.1で詳述し、以下に説明するように（ステップ8.2〜9.6）、バイオインフォマティクスアプローチおよび統計的方法を用いてそれをさらに処理する。

8.バイオインフォマティクス分析法1：CLL関連の分化メチル化領域（cllDMRs）の同定

1. Trimmomatic ¹⁰やCutadaptなどの利用可能な品質管理ツールを使用して、取得した49-bpの読み取り値（FASTQ形式）を清掃します。 FastQCツールキットを使用して、切り取られた読み取りの品質をクロスチェックします。
   java -jar trimmomatic.jar SE SAMPLE_uncleaned.fastq SAMPLE.fastq ILLUMINACLIP：adapters.fasta：2：30：10
2. きれいにされたFASTQファイルを、短い読み込みゲノムアライナBowtieと参照ゲノム¹¹に対して整列させる。以下のようにパラメータを指定します。
   1. 最大2つの不一致を許容します（Bowtieパラメータ： -v 2）。
   2. 報告書を読み込みごとに6つの最適なアラインメント（Bowtieパラメータ： -m 6）に制限して制御するマルチマッピング読み取りの場合
      bowtie -v 2 -a -m 6 HG19_INDEX -S SAMPLE.fastq> SAMPLE.sam
      注：SAMtoolsを使用して、整列後の個々のサンプルに対して生成されたSAMファイルをBAMに変換します。
      samtoolsビュー-bS -o SAMPLE.bam SAMPLE.sam
3. CLLサブグループ¹²からの濃縮/メチル化領域を予測するために、整列したサンプル（BAM）上のChIP-Seq（MACS）ピーク呼出しのモデルベースの分析を用いる。
   注：比較I：対照群としてInputサンプルを使用し、処置群として正常およびCLL患者サンプルの両方を使用する。このステップは、すべての負のピーク（入力/バックグラウンドが豊富なピーク）を収集することです。比較例II：対照群として正常試料群を用い、治療群としてCLL患者試料群を使用する。得られた陽性ピークはCLL過メチル化領域であり、陰性ピークは正常または示差メチル化領域（DMR）よりもCLL低メチル化領域である。
   macs14 -t SAMPLE_TREATMENT.bam -c SAMPLE_CONTROL.bam --format BAM -g hs
4. 比較の削除BEDtoolsを使用して、差別的にメチル化された領域（DMR）のピークをバックグラウンドで除去します。
   bedtools subtract -a -b
5. DMRに富む反復要素（SINE-Alu、LINE など ）の割合を予測します。
   1. fastacmdを使用して、参照ゲノムHG19からの染色体座標によるDMRのFASTA配列を抽出する。
      fastacmd -d HG19_genome.fa -s染色体-L開始、終了-l50000> DMRs.fasta
   2. RepeatMaskerコマンドラインツールを使用して、DMRのFASTAシーケンスに存在する繰り返し要素の割合を予測します。
      RepeatMasker -gc -gccalc -s -species人間-html DMRs.fasta
6. Homer "annotatePeaks.pl"を使用して予測されたDMRに利用可能なEnsembl [PMC4919035] oをアノテートするr Gencode [PMID 22955987]転写注釈（タンパク質コードと非コード転写物）。
   annotatePeaks.pl DMRs.bed -gtf
   注：これは、異なる遺伝子領域（ すなわち、プロモーター、エキソン、イントロン、3'UTRおよび5'UTR）および遺伝子間領域にわたるピークの分布に関する情報を提供する。 DMRに関連する転写物または遺伝子は、示差的にメチル化された遺伝子（DMG）と呼ばれる。
7. CLL DMG（タンパク質コード遺伝子のみ）によって強化された機能を検索するには、更新された機能データベースまたは最新の機能データベースを使用した濃縮ツールを使用してください。
   注記：Functional Annotation（GeneSCF）に基づくGene Set Clustering ¹⁴は、更新されたKEGGおよびGene Ontologyを参照データベースとして使用する、機能的濃縮分析のためのリアルタイムベースのツールです。

9.バイオインフォマティクス分析方法2：CLL関連の識別が著しく異なる有機的にメチル化された領域（clI sigDMR's）

1. メソッドI（セクション8）からステップ8.1-8.5を実行し、ステップ9.2〜9.6で説明した利用可能なツールを利用してリードカウントベースの微分濃縮分析を使用して、分析パイプラインにもう1つのレベルの統計情報を追加します。
2. 「Subread」パッケージ^15の 「featureCounts」を使用して、NormalおよびCLL患者サンプルの個々のピークまたはDMRにマップされた読み取りの数を数えます。
   subread / bin / featureCounts -Q 30 -F SAF -a DMRs.SAF -o DMRs_counts.table SAMPLE_TREATMENT.bam SAMPLE_CONTROL.bam
   注記：マッピング品質フィルタを導入して、品質の悪い読み取り値を定量化しないようにすることができます（ -Q 30など）。この手順では、取得したDMRのSAFファイルを準備します。 SAFファイル形式の詳細については、このリンクhttp://bioinf.wehi.edu.au/featureCounts/を使用してください。
3. Normalの個々のピークの読み取り回数を含むRAW読み取りカウントテーブルを使用します。d入力¹⁶としてedgeR内の患者サンプルグループをCLLする。
   注：正常対CLL患者のサンプルグループを比較してsigDMRを検索する。微分濃縮分析を行うには、詳細な手順についてはedgeRのガイドに従ってください（https://bioconductor.org/packages/release/bioc/vignettes/edgeR/inst/doc/edgeRUsersGuide.pdf）。
4. edgeRで予測される誤検出率（FDR）とログフォールド変化を使用してsigDMRをフィルタリングする¹⁶ 。
5. Homer "annotatePeaks.pl"を使用して予測されるsigDMRに、利用可能なEnsemblまたはGencode転写アノテーション（タンパク質コーディングおよび非コード転写物）を注釈する。
   annotatePeaks.pl sigDMRs.bed HG19_genome.fa -gtf -CpG
   注：これは、異なる遺伝子領域（ すなわち、プロモーター、エキソン、イントロン、3'UTRおよび5'UTR）および遺伝子間領域にわたるピークの分布に関する情報を提供する。 siに関連する転写産物または遺伝子gDMRはsigDMGと呼ばれる。
6. CLL sigDMG（タンパク質コード遺伝子のみ）により強化された機能を見つけるために、更新された機能データベースまたは最新の機能データベースを持つ濃縮ツールを使用してください。
   注：機能的濃縮分析のリアルタイムツールの1つであるGeneSCFは、KEGGおよびGene Ontologyを参照データベースとして使用します。

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結果

MBD-seqは最近、CLL患者および一致した正常な健常対照に対して行われ、CLL特異的差次的に過剰および低メチル化された遺伝子を同定した⁷ 。 CLLおよび正常な健康サンプルから生成されたデータを分析するために使用される実験的および生物情報パイプラインを図1Aおよび1Bに示す 。これらの分析は、IGHV変異およびIGH...

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ディスカッション

MBD-seqは、費用対効果の高い免疫沈降に基づく技術であり、完全なゲノムワイドカバレッジでメチル化パターンを研究するために使用できます。 MeDIP seq（メチル化DNA免疫沈降の後にシーケンシング）およびMBD-seqの両方が、CpGが豊富なメチル化DNAの濃縮をもたらす。しかしながら、MBD-seqは、MeDIP seq19と比較した場合、高度にCpGに富む領域への結合に対するより高い親和性を示す。メチル結合濃...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dneasy Blood and tissue kit	Qaigen	69504
Lymphoprep solution	A X I S-S H I E L D	1114544
Nano drop 2000	Thermo Fischersceintific
TE buffer pH 8	Sigma aldrich	93283
Bioruptor standard sonication device	Diagenode	UCD-200
TPX bioruptor tubes 1.5 mL	Diagenode	C30010010-300
3 M Sodium acetate	Diagenode	C03030002
E-gel iBase safe imager combo kit	Thermo Fischersceintific	G6465EU
E-gel 2% Agarose gels	Thermo Fischersceintific	G441002
Methylminer Methylated DNA enrichment kit	Thermo Fischersceintific	ME10025
Labquake Tube Shaker/Rotators	Thermo Fischersceintific	415110
Dynal MPC-S	Thermo Fischersceintific	A13346
Vortex mixer	VWR	12620-848
Absolute Ethanol	Any company
70% Ethanool	Any company
DNAse free water	Milli Q
DNA precipitant (3M sodium acetate)	Diagenode	C03030002
Safe seal 1.5 mL eppendorf tubes	Eppendorf	4036-3204
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Thermo Fischersceintific	Q32851
Qubit 0.5 mL tubes	Thermo Fischersceintific	Q32856
Qubit	Thermo Fischersceintific	Q32866
Illumina Hiseq2000 Platform	Illumina
Water  Bath	Grant
Heat block	grant
Tube rotater	Labquake