マウス二次口蓋融合のライブイメージング

要約

ここでは、共焦点顕微鏡法を用いたマウス二次口蓋融合のライブイメージングのためのプロトコールを提示する。このプロトコールは、様々な蛍光レポーターマウス系統と、および機械的洞察のための経路阻害剤と組み合わせて使用​​することができる。このプロトコールは、他の発生系におけるライブイメージングに適合させることができる。

要約

2次口蓋棚を融合させて2次口蓋を形成することは、哺乳類の発達における重要なプロセスであり、その破壊は、ヒトにおける共通の先天性異常である口蓋裂につながる可能性がある。二次口蓋融合は、このプロセスを仲介するいくつかの提案された細胞機構に至るまで広範に研究されている。しかし、これらの研究は、発達中の漸進的時点または静的時点で分析された固定外植体培養において、固定胚組織で主に行われてきた。静的解析は、口蓋の融合などの動的な形態形成過程の分析に限られており、どのタイプの動的細胞行動が口蓋の融合を媒介するかについては不完全に理解されている。ここでは、マウス胚におけるex vivo二次口蓋融合のライブイメージングのプロトコールについて説明します。口蓋の融合の細胞挙動を調べるために、上皮特異的なケラチン 14-クレアを用いて、 ROSの口蓋上皮細胞を標識したA26-mTmG ^floxレポーター胚。糸状アクチンを視覚化するために、 Lifeact-mRFPrubyレポーターマウスを使用した。二次口蓋融合のライブイメージングは​​、胚の日（E）14.5ステージ胚の最近接着した二次口蓋棚を解剖し、ガラス皿にアガロース含有培地で培養して倒立共焦点顕微鏡で画像化することにより行った。この方法を用いて、二次口蓋融合時に様々な新規細胞行動を検出した。空間的および時間的に明確な細胞の挙動がどのように調整されるかを理解することは、この動的形態形成過程の理解に大きく寄与する。このプロトコールは、突然変異マウス系統、または薬理学的阻害剤で処理した培養物に適用して、二次性口蓋融合がどのように制御されるかの理解をさらに進めることができる。

概要

組織融合は、複数の臓器の発達において重要なステップです。口唇および口蓋の裂け目、脊髄二分脊椎および心臓の奇形などの主要なヒトの先天性欠損は、組織融合の欠陥^1に起因し得る。マウス二次口蓋融合は、広範囲の開発^2、3、4、組織融合を制御する細胞および分子機構を同定するために検討されています。マウスでは、二次性口蓋の発達は、E11.5付近で始まり、両側の上顎プロセスのそれぞれから二次口蓋棚の成育を開始する。口蓋棚の初期成長は、舌に沿って垂直方向に約E14.0まで起こり、その時点で口蓋は舌の上で水平に上昇する。内向きの成長は、2つの口蓋棚の上皮間の物理的接触をもたらし、正中線上皮を形成するE14.5でのal seam（MES）。間葉の合流を可能にするために、介入MESを二次口蓋棚の間から除去し、完全な融合した2次口蓋の発達をE15.5 ^3で行わなければならない。

共培養上皮MES細胞層が2つの別々の口蓋棚の間でどのように形成され、次に間葉の密集を達成するために除去されたかは、口蓋裂進展における中心的な問題であった。マウスの組織学的および電子顕微鏡（EM）研究、外植体培養研究、および機能的なマウス遺伝学的実験に基づいて、いくつかの基本的な細胞挙動がこの過程に関与している。各口蓋棚の内側縁上皮MEEから糸状仮足状突起は、共有単MES ^6,7にこれらの上皮細胞のインターカレーションに続く最初の接点^5,6を容易にします。結果として得られる共用MESの除去3つの非排他的メカニズムによって進展することが提案されている。組織学的観察およびバイタル染料でトレースエクスビボ系統を用いた初期の研究は、MESは、MES細胞の間葉移行（EMT）に上皮によって除去される可能性があります^8、9、しかしより最近、上皮細胞の遺伝系統のトレースがに関して不確実性を上げたことを示し口蓋棚間葉^10、11、12への上皮細胞の長期的な貢献。重要なアポトーシス細胞の数、および適切な口蓋融合を受けることができないいくつかの変異体ではその数の減少は、アポトーシスがMESの溶解^2、3の主要なドライバーになるかもしれないという考えにつながっています。最後に、進行性の時点での上皮標識および静的観察を含む研究に最初から基づいて、MES細胞^13、口鼻及び前後寸法¹¹に移行することを提案するが、このような動的な細胞の振る舞いが原因ライブ口蓋組織でそれらを観察することができないため、最初は未確認でした。最近、我々は、蛍光標識のマウス遺伝的方法と外植片の棚の共焦点ライブイメージングを組み合わせた新しいライブイメージング方法論を開発することによって、これらの挙動を直接観察することができた。

まず、口蓋融合中口蓋上皮細胞における動的細胞挙動を視覚化するために、我々はKeratin14-CREマウス^14、15とROSA26-mTmG ^{FLOXマウス}を交配することによって、上皮特異的レポーターマウスを生成しました。得られた胚の口蓋外植片培養の共焦点ライブイメージングは​​、以前に提案されたいくつかの細胞挙動を確認し、融合プロセス⁶における新規事象を同定した^6、16を駆動する主要なメカニズムでした。このイメージング方法は、他のレポーターラインでも使用できます。我々は、融合プロセス中のアクチン細胞骨格の動態を調べるためにLifeact-mRFPrubyトランスジェニックマウス^17、18を利用^しました。他のレポーターもまた口蓋融合の他の特定の局面を観察するために使用することができ、この方法はイメージングの必要性および顕微鏡の利用可能性に応じてレーザー走査共焦点顕微鏡またはスピニングディスク共焦点顕微鏡に適合させることができる。ライブイメージングは​​、発達生物学において重要なアプローチとなりつつあります。 Parti白内障、頭蓋顔面の形態形成は複雑であり、顔に影響を与えるヒトの先天性欠損が一般的である。この共焦点ライブイメージング法は、ヒトの頭蓋顔面異常の起源だけでなく、基本的な発達メカニズムの基礎知識の改善を可能にする。

プロトコル

すべての動物実験は、カリフォルニア大学サンフランシスコ機関動物管理および使用委員会のプロトコルに従って実施した。

1.ライブイメージングメディアの作成

1. 液体培地の調製
   1. 20％ウシ胎仔血清（FBS）、2mM L-グルタミン、100U / mLペニシリン、100μg/ mLストレプトマイシン、200μg/ mL L-アスコルビン酸、15mM HEPESをダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）/ F12メディア。
      注：ライブイメージングメディアは、イメージングの直前に新しく作成されました。この培地にはフェノールレッドが含まれており、長時間のライブイメージングで光毒性を引き起こす可能性があります。フェノールレッドを使用しないメディアに置き換えると、長期間のイメージングが改善される場合があります。
2. 低融点アガロース溶液の調製
   1. 350mgの低融点アガロースを10mLのオートクレーブ蒸留水に溶解して、3.5％ストック溶液を作製する。
   2. アガロース溶液をよく混合し、水浴中で70℃でインキュベートして、アガロースを完全に溶解させる。
   3. アガロース溶液を37℃の水浴で冷却してから、ライブイメージングメディアに加えます。
   4. アガロース原液1 mLを液体ライブイメージングメディア5 mLに加えて最終濃度（0.6％）とする。
   5. アガロースで培地を37℃の水槽に保存して、早すぎる凝固を防ぐ。

ライブイメージングのための口蓋外植片培養の準備

1. 最近付随したE14.5二次口蓋棚の解剖
   注：私たちの経験では、イメージングの融合は口蓋棚のわずかに接着されたペアから開始する必要があります。この接着は、画像化中に融合が起こらないようにする外植片の動きを防止する。
   1. 1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）にE14.5段階の胚を解剖し、緑色蛍光タンパク質（GFP）発現（K14-cre; ROSA26-mTmG ^flox ）または（赤色蛍光タンパク質）RFP発現（ Lifeact-mRFPruby由来 ）陽性胚を蛍光灯を備えた解剖顕微鏡を用いて検出した。組織をアガロースを含まない予熱したライブイメージング培地に移す。
   2. 2つの細かい5番鉗子（ 図 1A-C ）を使用して、胚頭を切断し、上部脳領域を除去する。他の5番の鉗子は口蓋棚の外側の余分な組織を切断するように胚を保持するために1つのNo.5鉗子を使用してください。
      注：5番の鉗子の代わりに1番の胚の頭を切断するために、はさみを使用することができます。しかし、2番の5番の細かい鉗子は、正確な切断を行うためのより良い制御を与えるでしょう。
   3. 図 1Dおよび1Eに示すように、口蓋を損傷することなく下顎を注意深く取り外す。口蓋を損傷する可能性を減らすために、下顎の切開を通して舌を維持し、f舌を慎重に取り除いた後、
   4. 下顎骨と舌を除去した後、二次口蓋の口腔側を蛍光顕微鏡で実体顕微鏡で検査し、MES中の強いレポーターシグナルを確認する（ 図 1M ）。
   5. 下顎と舌を除去した後、後脳および脳幹を含む後部を解剖する（ 図 1F ）。
   6. 接着した口蓋棚付きの両上顎を外す（ 図 1G ）。
   7. 前顎の組織を切って、一次口蓋と二次口蓋の両方を無傷に保ちます （ 図 1HおよびI ）。
   8. MESを露出させる外植片の鼻側の鼻中隔を除去する。
      注：これらの解剖の後のステップは、2つの二次口蓋棚の間の接触を乱さないように注意する必要があります。鼻中隔の除去は、他の領域からのバックグラウンドシグナルを低減し、垂直組織の動きを低減し、安定したイメージングを可能にします （ 図1 J-L ）。
   9. 口蓋棚を切開した後、正中線レポーターシグナルを再度検査して、組織間の上皮層に損傷がないことを確認する。
2. ライブイメージング培地を用いた培養皿の口蓋外植片の設定
   1. ライブイメージングメディアを35mmのガラスボトムディッシュに入れます。
   2. 倒立共焦点顕微鏡（ 図1の N ）で画像化するために、解剖した口蓋蓋の口側をガラス底面にできるだけ近づけて置く。
   3. ドライアイスペレットを培養皿の近くの導電性表面に置き、速やかに温度を下げてアガロース固化を促進するか、培養皿を4℃に置く。パラフィン包埋に使用されるもののような冷プレートもまたこれに使用することができるtage。
      注：ドライアイスを使用する場合、凍結媒体を防ぐためにアガロース培地交換を注意深く監視する必要があります。

3.口蓋外植片の共焦点経時的イメージング

1. イメージングとデータ収集
   1. アガロースを半凝固させた後、培養皿を37℃インキュベーションチャンバーを備えた倒立共焦点顕微鏡に取り付ける。白色光共焦点顕微鏡と細胞観察者スピニングディスク共焦点顕微鏡を使用する。
      注：我々は、CO ²ガスを含まない15mM HEPESを含む改変培地を使用した。
   2. 培地の蒸発を防ぐために、シリンジを使用して培養皿とカバーの間に石油ゼリーを入れます（ 図1 N ）。
      注：一晩（O / N）培養後に培養皿の上に結露が生じるが、培地の量は変化せず、石油ゼリーが培地の蒸発を防ぐことを示唆している。
   3. 低倍率の対物レンズ（10倍）で関心領域を探し、3倍デジタルズームで20倍対物レンズ、またはImmersion Wで倍率40倍対物レンズを使用して、タイムラプスライブイメージングを行います。
      注：解剖された二次口蓋棚は平らではありません。二次口蓋は湾曲した構造であり、これにより、同一平面内のMES全体を画像化することが困難になる。低倍率（10倍）のイメージングは​​口蓋全体のイメージングを可能にしますが、40倍の対物レンズは、より深いZ位置で詳細な細胞の動きを調べるために、より良いイメージ解像度を提供します。中口蓋領域では曲率が高い。前部および後部の口蓋は、中口蓋に比べて比較的平坦である。我々はしばしば、二次口蓋の中間前部に向かって画像を描き、最大曲率の領域を避ける。
   4. 適切なレーザー励起（GFPの場合は488 nm、RFPの場合は532/561 nm）を使用して16-24 hの各ステップで5μmの複数のZスタックをスキャンします（ 図2 ）。
      注：潜在的な光毒性を減らすために、最小レーザー出力と暴露時間を使用してください。これは、特に多色撮像の場合に重要である。 membraneTomato（mT）には552 nmレーザーパワーの22％、membraneGFP（mG）には495 nmレーザーパワーの30％、membraneRFPには561 nmレーザーパワーの25％を使用します。平均曝露時間は550msであった。
   5. 画像解析ソフトウェアを使用して、細胞の追跡および定量分析を行います。

4.データ画像解析

注：ここでは、Imarisが使用されました。同様のデータ分析は、ImageJまたはVolocityソフトウェアパッケージでも実行できます。

1. 画像シーケンスから3次元（3D）サーフェスをレンダリングする。
   注：このセクションでは、膜のGFPシグナルで生成されたムービーからサーフェスを生成することができます。
   1. [ 編集]をクリックします。表示調整を表示し 、ヒストグラムスライダを使用して、膜の信号が透明になるように信号強度を調整しますムービーの長さうち（ 図3A）。
   2. イメージを使用して漂白されたシグナルを修正する 処理|減衰補正 。ムービーの長さ全体にわたって膜信号が透明になるように、[強度フロント]と[強度バック]の値を調整します。これらの値の設定には試行錯誤が必要な場合があります。
      注：レーザーの透過が限られているため、強度バック（深いZ位置）値は強度フロント（表面Z位置）値より小さくなります。したがって、これらの値を変更してZシリーズの信号強度を正規化することもできます。両方の値を調整して漂白補正を達成することができる。減衰補正も排出減衰補正¹⁹と呼ばれています。
   3. メンブレン信号からサーフェスを生成するには、 Surpass |サーフェスで、ソースチャンネルとしきい値タイプ（絶対強度）を選択し、アルゴリズム設定〜する 関心領域のみをセグメント化する 最後に画像全体の処理を行い 、続いて順方向矢印をクリックします。生成されたサーフェスが蛍光シグナルを反映しているかどうかを確認しながら、前方矢印を押し続けます（デフォルト設定を使用するか、表面領域の詳細レベルと閾値方法を試行錯誤で指定します）。関心領域を指定するには、X、Y、Z位置を切り取ってレンダリングする領域と時間を選択します。
      注：選択してください 最終的に画像全体を処理することで、ムービー全体に調整としきい値が適用されます。
   4. もう一度矢印をクリックしてサーフェスを生成します。次に、 フィルターのヒストグラムを膜信号に対応させて変更して、しきい値を調整します。
   5. サーフェスが生成された後、サーフェス/設定でサーフェスを選択してサーフェス信号を視覚化し、サーフェス生成プロセスを終了するには、double forw（ 図 3B ）。
   6. 表面に行く| マスクプロパティを編集し、 マスクのプロパティでマスクすべてをクリックすると、マスクされたチャンネルイメージが生成されます。
   7. OKをクリックすると、Mask Channelウィンドウが自動的に開きます。 GFPチャネルを選択し、サーフェス外のボクセルを最大信号強度値（ Edit | Display調整 ）に設定し、サーフェス内のボクセルを最小GFP強度値に設定します 編集|ディスプレイの調整 ）をMask Settingsで選択して、膜信号のマスクを生成します。
   8. メンブレン信号のマスクがボリュームビューで表示されるので、 画像処理|コントラストの変更|反転 （ 図 3C ）。
2. 反転した表面画像からスポットを検出する。
   注：このセクションでは、各セルの中心をユニークなスポットでマークされ、時空間を追跡します。
   1. スルーシーンを選択|スポット|作成します 。アルゴリズム設定では、関心領域のみのセグメントを選択し、 最終的には画像全体の処理を行い、時間の経過とともにトラックスポットを選択します。
   2. 前方矢印をクリックして、関心領域を指定します。スポットを追跡する領域と時間を選択します。順方向矢印を押し続け、マスクされたチャネルをソースチャネルとして選択し、推定されたスポットのXY直径を決定する。
   3. 前方矢印ボタンをクリックすると、自動的にフィルタウィンドウが開きます。ヒストグラムの値を変更して各細胞の中央に単一スポットを生成することによってスポット検出閾値を調整する（ 図 3D ）。
   4. 前方矢印ボタンを再度クリックすると、 アルゴリズムウィンドウが開き、 Autoregressiveモーショントラッキングモデル ²⁰を選択し、最大トラッキングdiを指定します短い間隔で不連続となるトラックを接続するためのスタンスと最大ギャップサイズを提供します。
   5. 前方矢印ボタンを再度クリックすると、Filtersウィンドウが開き、すべてのセルがトラッキングされるようにヒストグラムを調整してトラックの継続時間のしきい値を設定します。二重矢印ボタンをクリックすると、スポット検出が完了します。
   6. 組織のドリフトを修正するには、[ スポット|トラックエディタを開き 、[ ドリフトの補正]を選択します。 アルゴリズムウィンドウが自動的に開きます。 「 翻訳ドリフト」、「結果全体を含める」 、および「 オブジェクトの位置を修正する」を選択します。
3. 定量分析のためのプロットを生成する。
   注：このプログラムの散布図は、複数のオブジェクトを持つ多次元（X、Y、Z、カラー、スケール）グラフを生成するツールです。これらのプロットは、時間の経過とともに多くの細胞運動の傾向を見るのに役立ちます。
   1. セルトラッキングデータの2Dまたは3Dプロットを、Vantage-New Vantageプロットメニューを追加します（ 図3 Eおよび3F ）。
   2. ボリュームまたはスポットを選択し、 作成/カテゴリとプロットタイプを選択
   3. プロット値を調整して、異なるVantageグラフを生成します。
   4. スナップショット機能を使用してグラフをエクスポートします。
      注：統計データをスプレッドシートとしてエクスポートして、さらに数値分析を行うこともできます。保存します 。

結果

口蓋外植片培養のライブイメージングは​​、口蓋核融合を媒介する複数の細胞プロセスを明らかにした⁶ 。 2つの上皮細胞間の初期接触は、膜突起によって行われる（ 図 2B-2E ）。 2つの上皮層が会合すると、それらは上皮収束を介して統合された単一細胞層MESを作製するためにインターカレーションされた後、多...

ディスカッション

3D臓器外植片培養による組織形態形成のライブイメージングは​​、固定組織切片の従来の染色分析では示されない細胞プロセスに関する詳細な情報を提供することができる。マウス胚性二次口蓋のin vitro外植体培養を用いて、上皮収束および細胞押し出しを含む新規な口蓋融合機構を提案するいくつかの興味深い細胞挙動を観察した。

このタイプの研究における...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
DMEM/F12	Life technology	11330-032
Fetal Bovine Serum	Life technology	16000-044
L-glutamine	Life technology	25030-081
L-Ascorbic acid	Sigma	A4544-100G
Pennicillin/Streptomycin	Life technology	15140-122
Low melting agarose	BioExpress	E-3111-125
35 mm glass bottom dish	MatTek	P35G-1.5-10-C
Petrolieum Jelly (Vaseline)	Sigma	16415-1Kg
Mice
Keratin14-cre		MGI: J:65294	Allele = Tg(KRT14-cre)1Amc
ROSA26mTmG		MGI: J:124702	Allele = Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo
Lifeact-mRFPruby		MGI: J:164274	Allele = Tg(CAG-mRuby)#Rows
Microscope
White Light SP5 confocal microscope	Leica Microsystems
Cell Observer spinning disk confocal microscope	Zeiss Microscopy