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要約

我々 は A 型インフルエンザ ウイルスのウイルスのヘマグルチニンを対象とする人間やマウスのモノクローナル抗体の結合のために必要な重要な残基を識別する手法を提案します。プロトコルは、他のウイルスの表面糖蛋白質とそれらの対応する中和抗体に適応することができます。

要約

インフルエンザ ウイルスは、適応、ホストの免疫反応を回避するために驚くべき能力を展示します。1 つの方法は、ウイルスの表面糖タンパク質は、抗原の変化です。エスケープの亜種の発生は、ウイルスが免疫検出を脱出する方法の解明と抗体の結合のために必要な重要な残基を識別する強力な方法です。ここでは、ウイルスの赤血球凝集素 (HA) に対する人間やマウスのモノクローナル抗体 (Mab) を用いて A 型インフルエンザ ウイルスのエスケープの亜種を生成する方法のプロトコルについて述べる.私たちの技術を使って、私たち以前頭または、新規鳥 H7N9 HA の茎の抗体の結合のために必要な重要な残基の特徴。プロトコルは他のウイルス システムのために容易に適応することができます。エスケープの変形の解析は、抗原ドリフト、一塩基多型 (SNPs) 抵抗とウイルス フィットネスを授与の決定をモデル化するため、ワクチンや治療薬の設計は重要です。

概要

他の RNA ウイルスと同様に、インフルエンザ A ウイルス抗原の亜種のレプリケーション1,2,3の各ラウンドでの多数の生成は、エラーを起こしやすいポリメラーゼが所有しています。インフルエンザ ウイルスには、適応、抗体の結合の損失につながる表面の糖蛋白質の突然変異の蓄積によって達成される抗原ドリフトを介して人間の免疫反応を回避するために驚くべき能力があります。HA とノイラミニダーゼ (NA) のウイルスの表面糖の抗原ドリフト再定式化し、毎年ワクチンを管理する必要性を必要とします。

分離と抗原特異的抗体の作製の技術の進歩は、ワクチンによる抗体4,5,6,7,8の数が多いを得られています。ターンでは、広くインフルエンザ A ウイルスを中和する抗体のエピトープの解析が格段にいくつか万能インフルエンザ ワクチン候補9,10,11,の開発 12,13,14。モノクローナル抗体の抗原の足跡を解明中和の構造の決定要因を明らかにし、ワクチンの設計の方の情報に基づいたアプローチが可能します。しかし、それは現実的なも構造的にウイルス抗原15,エピトープをマップするために x 線結晶構造解析や電子顕微鏡を介して Mab の豊富なパネルを特徴づける研究所の費用対効果16,17,18。

X 線結晶構造解析や電子顕微鏡で高価な機器、特殊な技術と可能性のあるデータを生成する時間の豊富な量が必要です。代替、高速アプローチはエラーを起こしやすい RNA 依存性を介して多様なウイルスの人口の急速な生成を利用した Mab19,20、エピトープを決定するエスケープ変異体を生成する RNA ポリメラーゼ 21,22,23。エスケープのバリエーションの生成は、特別な機器や技術は必要ありませんあり、従来実験用試薬と機器を実行できます。

ここでは、mAb のバインディングに必要な重要な残留でインフルエンザ HA を認識のマッピングでは、手法について述べる。

プロトコル

注意: 人間の人口 (例えば H1、H3) のインフルエンザ ウイルスの数はバイオ セーフティ レベル 2 クラス病原体ケアと適切な個人用保護具を処理する必要があります。ウイルスの処理は、制度検討委員会によって承認されなければなりません。次のプロトコルは、シナイ山で制度上の審査委員会によって承認されました

。

注: ウイルスの複製を阻害する HA 特異抗体は上または球状の頭の上に受容体結合部位の隣接するバインド i) 物と受容体結合の遠位バインド ii) もの一般的に分類できますドメインは、球状の頭部側面と HA の茎地域が含まれています。受容体結合部位を対象とする抗体は、標的細胞の表面のシアル酸のモチーフの婚約を防ぎ、赤血球凝集抑制 (HI) 試験を使用して測定することができます。HI 陰性、抗体、茎特有の抗体などまだウイルスの複製を抑制することができますが、中和の試金を使用してのみ評価できます

。

1 抗体は HI と中和の活動に基づく分類

  1. こんにちはアッセイ
    1. 96 ウェル V 底プレートで列 2 に 12 で 1 × PBS の 25 μ l を追加します。
      2. 。
    2. では、mAb 7B2 (頭固有)、6F12 (茎固有) 23 および 100 μ g/ml x PBS と列 1 に希釈した抗体製剤の 50 μ L 分注 1 にアイソタイプ コントロールを薄くしなさい。1 × PBS ( 図 1 a) の 50 μ L を追加することによってコントロールなしの mAb があります
      3. 。
    3. 列 2、列 1 から 25 μ L を移すことによって抗体の 2 倍のシリアル希薄を実行など。( 図 1 a) 12 の列から最後 25 μ L を破棄します
      。 注: 抗体・ コントロールなしの行を含めることを確認します
      4. 。
    4. は、8 凝集ユニット/25 μ L 希釈ウイルス ストックするウイルス株 (内部セグメントの A/Puerto リコ/8/34 HA と NA の A/カリフォルニア/04/09 を表現するリアソータント ウイルス) を希釈します。(行 A g) 各ウェルに希釈ウイルス株 (8 凝集) の 25 μ L を追加します
      。 メモ: 抗体とウイルスの混合物が必要 50 μ G/ml の開始最終濃度を 50 μ L の最終巻
      5. 。
    5. 加温室温 (RT) 45 分でプレート
    6. 滴定行 (H) には、50 μ L の 1 × PBS を H2 の井戸で H12 に追加。H1 をうまく 8 凝集ユニット/25 μ L の 100 μ L を追加します。連続 H2、H1 から 50 μ L を移すことによって 2 倍を希釈しなど。よく H12 から最後の 50 μ L を破棄します。最後に、96 ウェル V 底板のすべてのウェルに 0.5% ニワトリ赤血球 (RBC) の 50 μ L を追加します
      。 注: アッセイの mAb サンプルでは 100 μ L の最終巻を持っている: mAb (25 μ L)、ウイルス (25 μ L)、赤血球 (50 μ L)。制御なしの mAb の最終巻は 25 μ L の PBS x 1、ウイルスを 25 μ l 添加し、赤血球の 50 μ L を含める必要があります
      7. 。
    7. 加温 1 のための 4 ° C でプレート
    8. は視覚的に、こんにちはアクティビティの板をお読みください。ある特定の抗体のための肯定的な読み出しと、2.1 エスケープのバリエーションを生成するためのステップに進んでください。抗体がこんにちは負の場合は、抗体は細胞培養の試金活動を中和できれば評価 1.2 をステップへ進みます下
      。 注: こんにちはアクティブ mAb の肯定的な読み出しは、96 ウェル V 底板は 45 ° の角度で開催されたときにティア ドロップを形成する ( 図 1 b 7B2) 井戸の中心部に暗い赤い赤血球ペレットによって示されます。負の値の読み出しがよく ( 図 1 b 6F12 とない mAb) 暗い赤い赤血球ペレットを形成しません。アイソタイプ コントロールがない暗い赤い赤血球ペレットを形成しても、茎特異抗体、6F12 またはない mAb と同一に見る制御サンプル ( 図 1 b) 23.
  2. と中和試験
    1. プレート マディン ダービー犬腎臓 (MDCK) 細胞組織培養の細胞/ウェル 2 × 10 4 の密度で 96 ウェル プレートを扱われ、17、19 h の CO 2 を 37 ° C、5% で孵化させなさい。
      注: 使用する前に 4 h 以上の井戸の底に付着するセルを許可もできます
      2. 。
    2. 7 を実行別の 96 ウェル プレートで 4 D の人間の mAb の 3 倍のシリアル希薄 05 の 5、開始濃度 200 μ g/mL の X の最小必須培地 (MEM) 1 トシル基を添加した CR9114 17 またはアイソタイプ IgG コントロールphenylalanyl クロロメチル ケトン (TPCK)-トリプシン (1 μ g/mL) を扱われます ( 図 2).
      注: 行 A (200 μ G/ml の濃度を開始)、希釈の 75 μ L を含める必要があります。連続 25 μ L を A 行から B 行に転送することによって、プレートを希釈する (3 倍) など。H 行 A 50 μ L の最終巻が必要です。希釈転送間にヒントを変更する必要はありません
      3. 。
    3. 50% 組織培養感染量 (TCID 50) の 100 のウイルス株 (リアソータント ウイルス HA および NA の/上海/1/13 A/Puerto リコ/8/34 の内部セグメントを表現する) の希釈 1 x 50 μ L MEM TPCK 治療を補完/トリプシン (1 μ g/mL) 24。抗体製剤 (ステップ 1.2.2) に希釈ウイルスの 50 μ L/ウェルを追加します。感染していない細胞制御の井戸に 1 X MEM の 50 μ L を追加します
      4. 。
    4. インキュベート (5% CO 2) と 1 のための 37 ° C インキュベーターでウイルス抗体の混合物
      注: ウイルス抗体の混合物では 100 μ L の容量を持っている: 抗体希釈 (ステップ 1.1.2) の 50 μ L と 100 TCID 50 (ステップ 1.2.3) を含むウイルスの 50 μ L.
    5. 吸引井戸にメディアと対応する井戸にウイルス抗体の混合物の全体の 100 μ L を追加します
      。 注: 吸引を行う 8 ch 吸引アダプターを使用して真空に接続されています。また、手動で吸引する 8 または 12 もマルチ チャンネル マイクロ ピペットを使用可能性があります。変更する必要があるなし菌除去または洗浄液の中にすべての吸引が最低の値、抗体の最高濃度から行われます
      6. 。
    6. 1x PBS の 200 μ L で単分子膜を洗います。(1.2.5 のステップ) のように 1 × PBS の 200 μ L を吸い出しなさい。合計 2 回洗濯洗濯物をもう一度繰り返す
      7. 。
    7. 感染全体 100 μ L/ウェルの単分子膜と感染/, 1 のため (5% CO 2) と 37 ° C で (ステップ 1.2.4) からウイルス抗体の混合物を追加することによって MDCK 細胞の単層
    8. 別の 96 ウェル プレートで、感染時に抗体の希薄の別のセットを準備します。150 μ L を追加行でそれぞれ抗体の 100 μ g/mL と 1 つの x の 100 μ L の MEM TPCK 扱われるトリプシン (1 μ g/mL) H. 実行行 B で 3 倍希釈によって補完 A 行から B 行に 50 μ L を転送します。、行 h. 破棄行 H から最後 50 μ L まで、などと各容量も 100 でなければ μ おきます。
      。 注: 抗体は 1 x TPCK 扱われるトリプシン (1 μ g/mL) を添加した MEM で希釈されています
      9. 。
    9. 1.2.7 のステップで単分子膜からウイルス抗体菌を吸引し、全体 100 μ L/ウェル 1.2.8 準備した適切な抗体の希釈と補充します
      。 注: 場合も含まれています。感染症 (ステップ 1.2.7)、補給のメディアの中に 100 μ g/mL の最終的な抗体濃度が 100 μ g/mL (ステップ 1.2.8) の最終的な抗体濃度を含める必要があります
      10. 。
    10. (5% CO 2) と 37 ° C のインキュベーターで 24 h 間加温します
      11. 。
    11. 96 ウェルのプレートからメディアを吸引し、3 回 200 μ L/ウェルの 1x PBS で洗浄します
      12. 。
    12. -20、1 時間冷 80% アセトンの 100 μ L のセルを修復する ° C
      注: 80% アセトン溶液は二重蒸留 (dd) H 2 O (例えば 100% アセトン 80 mL プラス ddH 2 0 20 mL) で希釈しました。80% アセトン溶液は使用する前に氷の上冷蔵できます
      13. 。
    13. 1x PBS の 200 μ L/ウェルの細胞を 3 回洗浄します
      14. 。
    14. ブロックで 5% の牛乳の 200 μ L/ウェル プレート 1x PBS で希釈、1 h. のための RT でプレートを孵化させなさい
    15. ビオチン化抗インフルエンザ ウイルス核タンパク質 (NP) の一次抗体の追加 100 μ L 1 PBS/1% ウシ血清アルブミン (BSA) x 1:2,000 を希釈し、1 のための RT でプレートを孵化させなさい
      注: B 型インフルエンザ ウイルス、B 型インフルエンザ ウイルス特異抗 NP 抗体使わなければなりません
      16. 。
    16. 1x PBS でプレートを 3 回洗浄します
      17. 。
    17. ストレプトアビジン - わさびペルオキシダーゼ (HRP) 共役抗体の追加 100 μ L 1 PBS/1% BSA x 1:3,000 を希釈し、1 h. のための RT で版を孵化させなさい
    18. プレート 1 × PBS の 200 μ L で 3 回の洗浄です
      19. 。
    19. HRP 基質試薬を 100 μ L/ウェルで追加し、暗い室温で孵化させなさい
      注: 酸性停止バッファー (下記参照) の追加の前にインキュベーション時間を最適化する必要があります。一般的に言えば、15 〜 30 分は十分です
      20. 。
    20. 5 M HCl の 50 μ L/ウェルとの反応を抑制します
      。 注意: 5 M HCl は、目、皮膚、粘膜に損傷を引き起こすことができる腐食性の高い試薬です。この試薬の付加は適切な個人用保護具と出されたフードの下で行う必要があります
      21. 。
    21. 492 でプレートを読む nm と背景 (感染細胞) 井戸を減算します
      22. 。
    22. は次の式で割合抑制を計算:
      figure-protocol-5486
    23. 場合は抗体があり、中和活動 (こんにちはアクティビティがない)、2.2 の手順に進みます
      。 注: 不足中和活性 の in vitro 抗体が不足こんにちは活動
      24. 。

2。エスケープ変異亜種の世代

注: 中和抗体またはこんにちは活動がないさらに以下で説明する特定のプロトコルを分析します

。
  1. プロトコル 1: こんにちは/肯定中和抗体 ( 図 3A )
    1. 10 のウイルス ストックの準備 6 プラークの 1x PBS でユニット/ミリリットル (PFU/mL) を形成400 μ L のボリューム
      2. 。
    2. 準備 4 希釈濃度を高めることに関心の抗体の (例えば 0、0.5、0.05、0.005 mg/mL) 希釈あたり 100 μ L のボリュームの 1x PBS で
      。 注: この野生型ウイルスは並列で、抗体がない場合に常に継代します。これらの継代ウイルスのシーケンスは細胞の培養条件と変異を脱出への適応間の区別に役立ちます
      3. 。
    3. ミックス 100 μ L の 10 6 Pfu/ml 各抗体希釈の 100 μ L または 1 × pbs 100 μ L にウイルス
      4. 。
    4. (5% CO 2) と 37 ° C の定温器で 1 時間加温。渦は簡潔に。各混合物の 200 μ L を注入特定病原体無料 (SPF) 鶏鶏卵
      5. 。
    5. 37 ° C (CO 2) なし 40 44 h. で卵を孵化
    6. 6 h 以上の 4 ° C で培養によるウイルス感染包蔵卵を犠牲に
    7. 上記 24 , 25 卵から尿液を収穫します
      8. 。
    8. は、 24 , 26 を上記のように赤血球凝集アッセイを実行します。赤血球凝集価がない尿液体調製物のすべては、0.00005 ミリグラム/ml 0.005 mg/mL に至る抗体希釈で手順 2 から繰り返します
      。 注: こんにちは陽性抗体の飽和濃度が存在するすべてのウイルス粒子を中和します。したがって、抗体、継の現在の量を削減する必要があります
      9. 。
    9. HI を実行することによってエスケープ亜種アッセイ 24 (ステップ 1.1) を確認します
      。 注: アクティブ HI 抗体は、標的細胞上のシアル酸モチーフの HA 婚約をブロックします。したがって、その同種抗体の存在下でウイルスは赤血球 (RBC ペレットの存在) を凝集能力を失います。理論的には、HI 活性抗体のエスケープ バリエーション、その同種抗体の存在下でもシアル酸モチーフをバインドすることもおよびこうして赤血球 (RBC ペレットなし) を凝集することができます。興味の抗体の HI が依然として検出の場合抗体の開始濃度の増加とともにステップ 2.1.2 からプロトコルを繰り返します
      10. 。
  2. プロトコル 2: こんにちは/ネガポジ中和抗体 ( 図 3B )
    注: 中和不足 HI 抗体に対してエスケープのバリエーションを生成するために活動、ウイルスは、増加する抗体の量の存在下で継代する必要があります。
    1. 密度 1 × 10 6 6 ウェル プレートにプレート MDCK 細胞細胞/ウェルと (5% CO 2) と 37 ° C の定温器で 4 時間以上インキュベートします
      2. 。
    2. 希釈 10 ウイルス ストック 6 PFU/mL または 1 の前の通路からウイルス x TPCK 扱われるトリプシン (1 μ g/mL) 500 μ L のボリュームで MEM
      3. 。
    3. 抗体 (0.02 mg/mL のオリジナルの通路またはすべての次の通路の高い) 1 の単一希釈を準備 x 250 μ L のボリュームで TPCK 扱われるトリプシン MEM
      4. 。
    4. ミックス 250 μ L 希釈抗体 (+ 抗体) の 250 μ L で希釈ウイルスまたは 1 の 250 μ L の MEM (抗体コントロールなし) x.
    5. ウイルス抗体の混合物 (5% CO 2) と 37 ° C の定温器で 30 分間インキュベートします
      6. 。
    6. 吸引ガラス パスツールを使用してメディアのピペット、1 ml の 1x PBS のセルの単一層を洗うです
      7. 。
    7. 井戸に混合物を 500 μ l 添加し、(5% CO 2) と 1 のための 37 ° C インキュベーターで孵化させなさい
    8. 1 h 後補足 1 の 2 mL で井戸 MEM TPCK 扱われるトリプシン (1 μ g/mL) x.
    9. 標識の顕微鏡で細胞変性効果 (CPE) の感染を後 48 時間で細胞を確認するか、ウイルス増殖 26 を検出する赤血球凝集アッセイを実行します
      10. 。
    10. 抗体を添加した培養における総 CPE がある場合は、通路番号-80 で店と複数のクライオ チューブ、ラベルの上澄みを収穫 ° C
      11. 2 ml の 1 x の MDCKs の新鮮な単分子膜に感染する上清の
    11. 保存 100 μ L MEM TPCK トリプシンと抗体を補った。すべての通路のない抗体コントロールを含めるようにしてください
      。 注: は次の文章 (2 日間) で、抗体の濃度を 2 倍 (または研究者の裁量で) で増加します。
    12. のウイルス増殖が 0.6 mg/mL の抗体の最終濃度がも実行可能になるまで各連続通過の抗体の濃度を増やします。それぞれの上清の複数のバイアル通路し、-80 で保存凍結 ° C
      注: コントロールなしの抗体は別に 1 つの通路からウイルスの増殖を確認する重要です。ないの抗体の管理で総 CPE もない CPE の場合、+ 抗体グループ、これは抗体の濃度が高すぎるとエスケープの亜種は生成されませんでしたを示します。ある場合ないの抗体コントロールに CPE を総が、唯一の CPE の適量、+ 抗体グループ、潜在的なエスケープの亜種の存在を示します。次の通路で音量上清 200 μ L を通路とエスケープの亜種を生成する可能性を高めるための抗体の濃度を維持します
      13. 。

3。プラーク精製のバリエーションを介してエスケープの分離

  1. 密度 1 × 10 6 6 ウェル プレートにプレート MDCK 細胞細胞/ウェルと (5% CO 2) と 37 ° C の定温器で 4 時間以上インキュベートします
    2. 。
  2. 希釈 1 抗体 300 μ g/mL 対応するエスケープ変異ウイルスの 250 μ L で 250 μ L とミックスのボリュームで始まる TPCK 扱われるトリプシン MEM x。抗体のない状態で継代ウイルスにはプラーク精製する必要があります
    3. 。
  3. 細胞からメディアを吸引、3 回 1x PBS で洗浄、ウイルス抗体の混合物 (ステップ 3.2) の全体の 500 μ L を追加します
    4. 。
  4. プレート ロック前後、単分子膜の乾燥を防ぐために 10 分ごとに確かめる (5% CO 2) と 37 ° C の定温器で 1 時間インキュベートします
    5. 。
  5. ウイルス抗体の混合物を吸引し、オーバーレイ寒天メディア対応する抗体 (300 μ G/ml; ステップ 3.2) 量を含むと井戸を補充します
    6. 。
  6. (5% CO 2) と 37 ° C の定温器で 40-44 時間プレートをインキュベートします
    7. 。
  7. サークル表示プラーク プラーク ピッキングを容易にする青または黒色マーカーと
    8. 。
  8. ピック 4 斑ごと脱出 MDCK 細胞や抗体の不在で卵で継代した野生型ウイルスと同様に、変異ウイルス抗体の組み合わせ
    9. 。
  9. 100 μ L の 1x PBS でプラークを再懸濁します
    10. 。
  10. 10 日間の古い SPF 鶏鶏卵プラーク精製エスケープ変異ウイルスの全体の 100 μ L 注入します
    11. 。
  11. (なし 5% CO 2) 37 ° C の定温器で 40-44 時間卵を孵化します
    12. 。
  12. 赤血球凝集アッセイ (ステップ 1.1) のウイルスの存在を確認するを実行します
    13. 。

4。ウイルス RNA と HA の解析シーケンス変化の抽出

  1. 200 からウイルスの RNA の抽出 μ L エスケープ変異ウイルス尿液フェノールとグアニジン イソチオシアネートのモノラル一過性ソリューションです
    。 注意: フェノールは咳、息切れが発生し、適度の接触によって皮膚を刺激する揮発性の液体試薬
    2. 。
  2. は、ウイルスの逆転写酵素を使って RNA から HA セグメントを増幅してインフルエンザの HA 遺伝子特定のプライマー セグメント 27
    。 注: B 型インフルエンザ ウイルスについて、表 2 のための普遍的なプライマー増幅両方 HA (~ 1,800 bp) na (〜 1,500 bp) 28.
  3. 1% アガロースゲルの RT-PCR の製品を解決し、正しいサイズのバンドをカット (~ 1,800 bp).
  4. シリカ膜による浄化プロシージャを使用して PCR の製品のゲルの抽出とシーケンスの cDNA を出す
    5. 。
  5. 突然変異を区別する抗体結合推定エスケープの亜種で発見し、継代細胞文化適応または免疫学的選択による野生型ウイルスに必要なアミノ酸残基を識別します
    6. 。
  6. 野生型を含む PCR の製品をクローンまたは pCAGGs 発現ベクター (ノッティと NheI) にバリアント HA をエスケープします
    7. 。
  7. エスケープ バリアント HA 抗体の結合は 2 つのオプションのいずれか (または両方) 以下と評価できます
    8. 。

5。抗体結合解析の脱出の亜種

2 x 10 の 4 の密度で
  1. 蛍光
    1. プレート 293 t 細胞細胞/ウェルの 96 ウェル プレートで、24 時間 (5% CO 2) と 37 ° C のインキュベーターで孵化させなさい。
    2. Transfect pCAGGS プラスミド エスケープ変異 HA の 0.10 μ g/ウェルの細胞、ウイルス HA とトランスフェクション試薬の野生型 HA (unpassaged) を使ってを継代します
      3. 。
    3. (5% CO 2) と 37 ° C の定温器で 48 h の 96 ウェル プレートをインキュベートします
      4. 。 室温 15 分 0.5% パラホルムアルデヒドの
    4. 修正 100 μ L
      注意: パラホルムアルデヒドは咳、息切れが発生し、適度の接触によって皮膚を刺激する揮発性の液状試薬です。それは、潜在的な人間の発癌物質として指定されています。出されたフードの化学試薬の添加を行う必要があります
      5. 。
    5. 3 x 1 PBS で洗浄時間。1 × PBS 室温 1 時間に 5% ミルクでブロック
    6. は、3 回を 1 × PBS で洗浄します。5 μ g/ml 室温 1 時間興味の抗体の孵化
    7. の二次抗体 (抗ひとまたは抗マウス アレクサ 488) 暗闇の中で常温 1 時間 PBS/1% BSA × 1 で 1:2,000 の希釈で 100 μ L で加温します
      8. 。
    8. は、3 回を 1 × PBS で洗浄します。正または負の汚損のための蛍光顕微鏡で細胞を観察します
      9. 。
  2. 蛍光活性化セルの並べ替え (FACS)
    1. 2 x 10 の 5 の密度でプレート 293 t 細胞細胞/ウェル 6 ウェル プレートで、37 ° C (5% CO 2) で 24 時間インキュベート
    2. PCAGGS プラスミド エスケープ変異 HA と 0.50 μ g/ウェルの細胞を transfect、ウイルスのみ HA とトランスフェクション試薬を使って野生型 HA を継代します
      3. 。
    3. (5% CO 2) と 37 ° C で 48 時間 6 ウェル プレートをインキュベートします
      4. 。
    4. 48 時間後吸引成長媒体および 1x PBS で 2 回やさしく洗う (単層が邪魔ではないことを確かめる).
    5. は、FACS バッファー (PBS/2% 牛胎児血清 x 1) 500 μ L を transfected 293 t 細胞を収穫します
      。 注: FACS バッファーはあらかじめ使用前に 4 ° C で冷蔵する必要があります
      6. 。
    6. 4時 5 分 300 x g で収穫された 293 t 細胞を遠心分離機 ° C
    7. は、FACS バッファーを吸引し、関心 (1 に 5 μ g/mL の最終的な集中) の Mab を含む FACS バッファーの 200 μ L で再懸濁します。RT で 20 分間インキュベート
    8. は、FACS バッファーの 2 回 500 μ L で 4 ° c. の洗浄で 5 分間 300 x g で細胞を遠心分離機します。ガラス不可、ペレットに関してパスツール ピペットで注意深く吸引します
      9. 。
    9. は、アレクサ 488 (1:1, 000 の最終的な希釈) に共役二次抗体を含む FACS バッファーの 200 μ L で再懸濁します。20 分のための 4 ° C で暗闇の中で孵化させなさい
    10. FACS バッファーの 2 回 500 μ L で 4 ° c. の洗浄で 5 分の 300 g で細胞を遠心し、慎重に洗浄バッファーを吸い出しなさい
      11. 。
    11. は、FACS バッファーの 500 μ L で再懸濁します、モノクローナル抗体やポリクローナル バインディングを評価FACS による HA 細胞を血清をトランスフェクトした
      。 : 注意実験でない mAb/ポリクローナル血清コントロールとして融合のサンプルが含まれています
      12. 。

結果

我々 は以前エスケープの亜種季節性インフルエンザ ウイルス ワクチン、H7N9 予防接種またはシーケンシャル DNA/組換え HA タンパク質ワクチン接種4,5 による人間とマウスのモノクローナル抗体を生成するのにこのメソッドのバリエーションを使用しています。、6,7。前述のように、抗体が最初 HI と中和の試金を使用して次の4,5を続行する特定プロトコルをお知らせするために特徴付けられます。抗体 07 5 D 03、07 5F01、07 5 G 01、07 4B03、07-4E02 07-4 D 05 鳥インフルエンザ H7N9 ウイルス (A/上海/1/2013) (表 1) に対する HI と中和の活動を持つことがわかったし、こうしてプロトコル 1 (ステップ 2.1) が利用されました。41 5E04、045 051310 2B06, 042 100809 2F04 S6 B01 (表 1) などの HI 活動に欠けている、中和抗体のプロトコル 2 (手順 2.2) はエスケープの亜種を生成に使用されました。エスケープ変異のマッピングでは、抗体の多くはウイルス HA4,5 (図 4) で異なる場所に重要な残基を認識を明らかにしました。こんにちは陽性抗体の大半が、H7 HA の以前に報告された抗原部位近く突然変異体残基を脱出しながら負で HI 抗体エスケープ ポイント突然変異の突然変異体では生成、茎地域4,5.

抗体こんにちは活動NEUT 活動
07 5 D 03++
07 5F01++
07 5 G 01++
07 4B03++
07 4E02++
07 4 D 05++
41 5E04-+
045 051310 2B06-+
042 100809 2F04-+
S6 B01-+

表 1:抗体 HI と中和活性のテーブル。10 H7 固有 Mab 個人実験の H7N9 ワクチン接種から分離された別の in vitro抗ウイルス活動5 を展示します。

前方のプライマー (5' 3')逆プライマー (5' 3')Thermocylcer の条件
IAVTATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGGGATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTGTTTT60 分の 42 ° C、20 94 ° C 2 分/5 サイクル 94 ° C s、50 ° C で 30 秒と 3 分 30 秒 68 ° C に続いて 40 サイクル 94 ° C の 20 s、58 ° C 30 s、と 3 分 30 秒 68 ° C で 10 分間の最終延長時間、68 ° C
IBVGGGGGGAGCAGAAGCAGAGCCCGGGTTATTAGTAGTAACAAGAGC60 分、30 分の 55 ° C、20 94 ° C 2 分/5 サイクル 94 ° C 45 ° C s、30 ° C で 40 秒と 3 分 30 秒 68 ° C に続いて 20 94 ° C の 40 のサイクル s、58 ° C 30 秒と 3 分 30 秒 68 ° C で 10 分間の最終延長時間、68 ° C

表 2: 普遍的なインフルエンザ ウイルス プライマー 。インフルエンザ A27 B28ウイルスと自分たちのそれぞれの条件の HA セグメントの増幅用プライマー。

figure-results-3376
図 1: こんにちはアッセイ。A (A) 図のための 2 つのマウス H1 固有 Mab 7B2 (頭固有) と 6F12 (茎固有) 96 ウェル V 底プレートと HI 法23の結果の例 (B) を使用してアクティビティをテストするのにはこんにちは試金の設定。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

figure-results-3851
図 2: 中和アッセイ。図 2 つの人間 Mab 4 055 CR911417の活動をテストすると中和試験をセットアップのための。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

figure-results-4223
図 3: エスケープ変異の生成します。提案手法は HI と抗体による展示と中和活性に依存になります。(A) に対してエスケープ変異の生成中和こんにちは肯定的な抗体は、(B) 中和負で HI 抗体は抗体量の増加とともに複数の通路を伴うことがあります。 一方、卵、単一通路を必要があります。細胞培養。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

figure-results-4690
図 4: 新規鳥 H7N9 ha エスケープ変異亜種で生成されたエピトープ マップの例です。ワクチンによる抗体は H7N9 インフルエンザ ワクチンはエスケープ変異亜種を生成に使用された候補者を接種個人から分離されました。赤い表す指定した各残基、モノクローナル抗体の効率的なバインドに必要な重要なアミノ酸の位置。データはデュナン ヘンリーら2015年4から合わせられました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

ディスカッション

エスケープ変異を介して特定の残基の大部分を正確にされているが、このアプローチの主な注意事項の 1 つはエスケープの亜種の点突然変異がありますは、必ずしもによって決定される抗体の分子のフット プリント内対応構造解析。これは立体配座変化の変異の残渣、アロステリック効果に類似している場所の遠位につながる特定の残基に突然変異の能力のためです。別の制限は、この方法論はの中和抗体; のみ実装できます。生体外で選択的な圧力がない抗体は変異体の脱出につながることはありません。しかし、既報の中和抗体によって生成されたエスケープ亜種のパネルを使ってこの制限を克服できます。Tan et al.は、H7N9 ウイルスに対する中和モノクローナル抗体のエスケープ バリアントを使用7非中和抗体のエピトープをマップします。

それにもかかわらず、エスケープのバリエーションの生成によって抗体のエピトープの解明装置の大規模な投資が必要どちらの結晶構造解析とクライオ電子顕微鏡への現実的な選択肢を提供します。他の選択肢は、アラニンのスキャンまたはペプチド スキャン/トランケーション変異体を用いた Mab の最小限の結合領域を決定します。突然変異誘発をスキャン アラニンは、大量のペプチド スキャンは線形エピトープ3029日のスクリーニング中にバリエーションの数が多いを生成する作業を必要があります。このプロトコルで説明されているメソッドには、特別な機器や技術が不要と実際では、既存の in vitro中和試金興味の抗体のエスケープの亜種を生成するように変更します。

(例えば、茎特異的抗体) 複数の通路が必要な生成のエスケープ バリエーションのプロトコルは開始 0 の通路で抗体濃度に大きく依存。注意の側面で誤ると抗体の半最大阻害濃度より低い半分のログにログを開始し、堅牢なウイルス増殖を可能にすることをお勧めします。研究者は、低免疫学的圧力の存在下で高価のウイルス培養がウイルスの人口に大規模な遺伝的変異があることを推測できます。次の通路に抗体濃度を徐々 に増やすことでの脱出のバリエーションを選択できます。ウイルス増殖が減少すると、イベントで前の通路で抗体濃度の同じ量を維持しながら次の文章のウイルス上清の量を増やすことができます。

万能インフルエンザ ワクチンの大半の目的は、HA の茎地域に向けて強力な抗体応答を引き出すことです。エスケープの亜種茎特異抗体の解析、インフルエンザ ウイルス適応と免疫学的圧力との関係を定義するときに重要です。興味深いことに、茎特異抗体に起因エスケープ変異ウイルスでマウス LD50研究4ですべて弱毒生体内であった。これらの研究は、予防接種の茎ベース プラットフォームの強力なケースを提供します。さらに、小分子阻害剤などの他の抗ウイルス化合物にエスケープ変異を識別するためにこのプロトコルを使用することができます。最後に、この方法論はインフルエンザ ウイルスの表面糖タンパク質に限定されていませんが、他のウイルスの糖蛋白の抗原を確認するもより広く適用できます。

開示事項

著者は利益相反を宣言しません。

謝辞

このプロジェクトは、一部国立研究所のアレルギーと感染症から連邦政府の資金で賄われている、健康の国民の協会の保健社会福祉省、CEIRS の下で契約 HHSN272201400008C (f. k.);NIH の U19AI109946-01 (F. K.);P01AI097092-04S1 (P.E.L.)。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Falcon 96-well clear flat bottom TC-treated culture microplate with LidCorning, Inc.353072Assay plate use for the microneutralization assay
Falcon 96-well clear V-bottom plateCorning, Inc.353263Assay plate use for the hemagglutination inhibition assay
1X Minimal Essential Medium (MEM)Gibco11095080Infection medium
Tosyl phenylalanyl chloromethyl (TPCK)-treated trypsinSigma-AldrichT8802Cleaves immature HA0 to HA1 and HA2
Biotinylated anti-NP primary antibody (IAV)EMD MilliporeMAB8258BAn antibody that recognizes the NP protein of influenza A viruses
Biotinylated anti-NP primary antibody (IBV)EMD MilliporeMAB8260B-5An antibody that recognizes the NP protein of influenza B viruses
Streptavidin-HRP antibodyEMD Millipore18-152This is used as a secondary antibody for the biotinylated anti-NP antibody
HRP substrate (SIGMAFAST-OPD)Sigma-AldrichP9187-5SETo-phenylenediamine dihydrochloride water soluble substrate for HRP
96-well V-bottom plateNunc249662Assay plate used for the hemagglutination assay
Chicken red blood cellsLampire Biological Laboratories7201403Used to assess the ability of influenza virus to agglutinate
TRIzolAmbion15596026Extraction of RNA
Superscript IIIInvitrogen12574018Reverse transcriptase
Gel Extraction KitQiagen28704Isolation of amplified PCR product
Lipofectamine 2000Invitrogen11668027Transfection reagent
Anti-human IgG (H+L) Alexa Fluor 488InvitrogenA-11013Fluorescent secondary antibody for human antibodies
Anti-mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 488InvitrogenA-11001Fluorescent secondary antibody for murine antibodies
6-well polystyrene microplateCorning, Inc.353934
UltraPure AgaroseInvitrogen16500500
Nalgene long term storage Cryo-tubesThermoFisher Scientific5012-0020Freezing of viral culture supernatant
reassortant A/California/04/09 (H1)Palese Laboratoryreassortant virus expressing the HA and NA of A/California/04/09 (H1N1) with the internal segments of A/Puerto Rico/8/34 (H1N1)
reassortant A/Shanghai/1/13 (H7)Palese Laboratoryreassortant virus expressing the HA and NA of A/Shanghai/1/13 (H7N9) with the internal segments of A/Puerto Rico/8/34 (H1N1)
Bovine serum albumin solution (35%)Sigma-AldrichA7979
Qiagen gel extration kitQiagen28704Silica-membrane-based purification of DNA fragments

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