神経フリーの生成と長期維持<em&gt;ヒドラ</em

要約

コルヒチンによる二重治療により、分裂細胞を死滅させる植物由来の毒素である神経を含まないハイドラ尋常性疣贅が生成され得る。これらのヒドラは自分自身で食べることはできません。この論文では、研究室で神経フリーのヒドラ・ブルガリスの長期的な維持のための改善された方法について述べる。

要約

Hydraの間質細胞系譜には、多分化能性幹細胞およびその誘導体（腺細胞、線虫細胞、生殖細胞および神経細胞）が含まれる。間質細胞は、分裂細胞を死滅させる植物由来の毒素であるコルヒチンを用いて2回連続して処理することにより排除することができ、間質幹細胞に由来する分化細胞の再生可能性を消去する。これは、神経細胞を欠いたヒドラの生成を可能にする。神経を含まないポリープは、浸透圧を供給し、排泄し、または調節するためにその口を開くことができない。しかし、そのような動物は、定期的に力を与えて餌をつけた場合、生存し、実験室で無期限に培養することができる。神経細胞の欠如は、動物の行動および再生を調節する際の神経系の役割の研究を可能にする。以前に公開された神経を含まないヒドラの維持のためのプロトコールは、手で引いたマイクロピペットを用いた口のピペット操作ヒドラを飼い 、清掃する。ここでは、神経を含まないヒドラの維持のための改善されたプロトコールが導入されている。細く絞った鉗子を使用して口を強制的に開け、新しく殺されたアルテミアを挿入する。強制給餌後、動物の体腔をシリンジおよび皮下注射針を用いて新鮮な培地でフラッシュして未消化物質を除去する（ここでは「バフィング」と呼ぶ）。鉗子とシリンジを使用して神経を含まないハイドラを強制送達するこの新しい方法は、手で引っ張ったマイクロピペットチップを用いた口のピペット操作の必要性を排除します。したがって、プロセスをより安全にし、大幅な時間効率化を実現します。下垂体内の神経細胞が確実に排除されるように、抗チロシン - チューブリンを用いた免疫組織化学を行う。

概要

Hydraの神経系は神経網で構成されており、両方の上皮組織層に関連したニューロンがある。神経ネットは、低体温では密度が高く、体節では密度が低い。神経細胞は、分泌細胞、線虫細胞、生殖細胞およびニューロンを生じる多能性幹細胞である間質幹細胞に由来する。分裂細胞を死滅させる植物由来の毒素であるコルヒチン^{3,4 で}処理することにより、 ヒドラ・ブルガリス（Hydra vulgaris）の間質細胞を排除することが可能である。コルヒチンは他の生物の微小管重合を阻害することが判明していますが、これまでの研究では、治療全体を通して微小管がヒドラに存在し、コルヒチンがHydra ^3でこのように作用しないことが示唆されています。もう一歩udyは、 Tetrahymena pyriformis、Zea mays、ChlamydomonasおよびSchizosaccharomyces pombeを含むいくつかの生物において、コルヒチンがチューブリンに効率的に結合しないことを示唆している。コルヒチン処置は、内胚葉上皮細胞による間質細胞の食作用を誘導し、したがって、神経細胞、腺細胞および線維細胞がない動物の作製を可能にする。間質細胞が特にコルヒチン処置の影響を受けやすい理由は不明である。 Campbellは、有糸分裂後の間質細胞と間質幹細胞系統が損傷し貪食されていることを考えると、コルヒチンは有糸分裂活性に直接影響しないと結論している³ 。注目すべきは、コルヒチン治療はハイドラ・ブルガリ（Hydra vulgaris）において良好に機能するが、 ヒドラ・オリゴアクシス（Hydra oligactis） ^6のような他の種においてもうまく機能しないことが示されている。 Hydra viridis ⁷を産生するために使用することができる。したがって、神経を含まないヒドラ （「上皮性ヒドラ 」とも呼ばれることもある）は、組織ホメオスタシスおよび再生における間質細胞系列からのこれらの特殊な細胞型の役割を研究するための有用なツールである。

ヒドラは、神経系なしで暮らすことができる動物の唯一の既知の例であるかもしれない。神経を含まないヒドラは、 ヒドラの再生、恒常性、および行動を調節する際に神経網の役割を解剖するのに特に有用なモデルとして役立つ。例えば、移植を介して間質細胞を神経を含まないHydraに導入することにより、神経細胞の分化を特徴付けることができた。さらに、神経を含まないヒドラは再生することができるため、代わりの、神経系に依存しない再生経路の調査を可能にする。そのような例の1つは、野生型ヒドラの神経系におけるcnox-2機能に依存することが示されているが、神経を含まないヒドラには存在しないようであり、代替的な頭部再生プロセスが存在し得ることを示唆する先端神経形成および頭形成である¹⁰ 。

神経を含まないヒドラはまた、神経新生^11の喪失後に、上皮細胞の発現および神経原性および神経伝達遺伝子の調節を研究するために使用されている¹¹ 。神経を含まないヒドラは自発収縮バースト¹²を示さず、これらのバーストは神経系によって調節されることを示している。しかし、神経を含まないHydraは体の柱を鉗子で挟むことに応答して収縮し、機械的刺激に応答する収縮はカップリングスルーによって媒介されることを示唆しているghギャップジャンクションを介して結合するが、自然収縮挙動は神経細胞のギャップジャンクションを介して結合することによって媒介される¹³ 。

神経を含まないヒドラは、食物や還元型グルタチオン^3を与えられても口を開けません。これは、食物の存在を検出して口を開けるように感覚ニューロンが必要であることを示唆しています³ 。加えて、神経網は、開口部から内部の静水圧を自律的に調節することができず、特徴的な風船状の外観を呈する（ 図1B ）ため、浸透圧を感知する役割を果たすと思われる。頻繁な手動収縮による神経を含まないヒドラにおける静水圧の調節は、低体温および身体の柱におけるいくつかの異常な形態の喪失につながった。しかし、慢性的なデフレは成長への干渉をもたらした養子縁組、発芽、および組織組織⁸ 。

神経を持たないヒドラは自分で食べることはできませんが、手動で動物を強制的に餌を与えて飼育することで、実験室で無期限に維持することは可能です。以前の刊行物は、無給餌のHydraを強制的に給餌する方法を記載しているが、これらのプロトコールは、マイクロピペットチップを使用することを必要としており、これを適切なサイズに注意深く引っ張る必要があり、チュービング¹⁴によってピペットに接続されたマウスピースを使用する。ここでは、より単純で、より安全で、より時間効率的な、給餌および飼育の方法が記載されている。

さらに、以前の研究では、固定された動物を個々の細胞に解離させて神経細胞が存在しないかどうかを検査し、細胞の形態学を調べた3,4,15）。 Hアルファ - チューブリンのチロシン化カルボキシル末端に対するモノクローナル抗体による免疫組織化学を、hypostome 13,16におけるニューロンの枯渇を確認するための浸軟の補完的方法として用いた。これまでの研究では、この抗体¹³を用いて、花柄のニューロンも視覚化することができることが示されているが、これらのニューロンは、身体の欄のものと同様に、免疫組織化学は、hypostomeにおける神経細胞の不在を確認するのに十分であり、細胞型形態に関する専門知識を必要としないが、間質幹細胞およびこれらの細胞の他の誘導体の欠如をチェックするために使用することはできない。解離および細胞形態学の研究はより厳密であり、治療の各段階の後に残っている各細胞型の数を定量的に説明することができる。

プロトコル

1.ダブルコルヒチン治療

1. Hydra培地で0.4％のコルヒチン（重量/容量）溶液を3、4、17にする。
   注意：コルヒチンは急性毒性であり、飲み込むと致死的であり、遺伝的欠陥を引き起こし、眼に損傷を引き起こす可能性がある。ヒュームフードで粉体を取り扱い、完全な個人用保護具（PPE）を着用してください。
2. ペトリ皿中のコルヒチン溶液1mLあたり5Hydraの割合で0.4％コルヒチン中で24時間飢えさせたヒドラ鼓律器 （AEP株）を暗所で室温で8時間インキュベートする。
   注： Hydra / mLコルヒチンは、 Hydraで皿を過密にするのを避けるためにどれだけの溶液を使用するかを決定するためのガイドラインです。その後の洗浄と溶液の変更には、同じ容量の溶液を使用します。
3. コルヒチン溶液を取り出して交換するコルヒチンを含まない清潔なハイドラ培地で培養した。 Hydra培地で50μg/ mLのリファンピシンに移す前に、清浄なHydra培地にガラスパスツールピペットでシリアルトランスファーで5回洗浄します。 18℃のインキュベーターにHydraを保管してください。
   注：ジメチルスルホキシド（DMSO）中、1〜2週間の治療に十分な1,000xリファンピシン（50mg / mL）を4℃で保存することができます。正確な量は、毎日使用される溶液の総容量によって決定することができる。例えば、1日2回交換する必要がある溶液10mLを含む2つの皿がある場合、1日に合計40mLの溶液が使用され、これは1日当たり1,000Xストック40μLまたは1日560μL 2週間の期間にわたって。次いで、ストックを使用時にHydra培地で1：1000に希釈する。
   注意： DMSOは可燃性液体であり、容易に皮膚に浸透し、他の溶存化学物質を体内に吸収させます。ハンドヒュームフード内の溶剤を完全にPPEを着用してください。注目すべきことに、DMSOは4℃で凍結する
4. ヒドラが細胞を培地に押し出すのを止めるまで、リファンピシン含有Hydra培地を1日2回交換する。これは、一般に1週間の治療後である。この時点で、培地は1日1回交換することができます。治療後の日には、 ヒドラは触手を完全に失います。 Hydraを互いに接触させないようにしてください。それらが一緒に融合して、奇妙な形のHydraを生じる可能性があります （ 図 2A ）。
   1. 接触を防ぐために、円運動でディッシュを旋回させないでください。代わりに、 ハイドラがばらばらに広がるまで、垂直方向および水平方向に皿を静かに攪拌する。 18℃インキュベーターにHydraを置いたときにディッシュを点検し、必要に応じて調整する。
      注意：メディアが2回交換された日は、メディアを交換してください朝は1回、午後/夕方はもう一度。
5. 触手が形成され始めると、1週間に3〜4回、 ハイドラを強制給餌して、バフィングを開始します（セクション2と3を参照）。コルヒチン治療の約8〜9日後、 ハイドラは触手を元に戻します。
   注意：触手の再成長は個人によって異なります。触手の成長の徴候を示す前に8〜9日以上かかることがあります。触角を再成長させない動物や奇妙な形をした動物（ 図 2B ）は、摂食するには小さすぎる動物や動物を取り除くべきです。これらのヒドラは、おそらく2回目の治療で生き残ることはできません。 ハイドラはまた芽を出すかもしれません。しかし、芽のいくつかは依然として間質細胞を有し、自分で食べることができる。
   1. 援助なしで食べることができ、親動物から切り離すことができる芽を取り除く。これらの動物を特定するには、生きたアルテミアを動物が自分でアルテミアを捕まえて食べるかどうか観察すること。 1または2のHydraは、自分で食べることもできます。これらも捨てるべきです。
      注意：神経を含まないハイドラは、特徴的な風船状の形態を持ち、正常よりも短くて薄い触手（ネマトサイトの喪失による）を有し、正常な見た目の動物と容易に区別することができます（ 図 1A、1B ）。
6. 最初のコルヒチン処置の3週間後に、コルヒチン処置を繰り返す（ステップ1.1〜1.5）。第2のコルヒチン処置は、残りの間質細胞および神経細胞を除去するために必要である³ 。

2.強制給餌

1. Artemiaの嚢胞を、底部が先細になる細長いガラス容器に加えます。 Artemia水（6.72M NaCl）で容器を満たしてください。エグゼクティブを避けるより高い孵化収率のために水1Lあたり1gの嚢胞を矯正する。
   1. パラフィルムで容器の上部を覆い、Parafilmを通して10 mLの血清学的ピペットを容器に挿入する。水槽の空気ポンプにチューブを取り付け、チューブをピペットの周りに取り付けることによって、エアレーションを提供します。ピペットの先端が容器の底に達することを確認し、底に嚢胞が沈着していないことを確認する。 アルテミアは48時間後に孵化するでしょう。
      注意： アルテミアを孵化させるにはさまざまな方法がありますが、それはまったく同様に機能します。
2. アルテミアの水からアルテミアの水をArtemiaネット（水族館の供給会社から入手可能）にひずませ、DI水で約20秒間洗ってから、 Hydra培地を入れた皿に入れてください。 アルテミアの水の塩分はヒドラにとって高すぎるので、 アルテミアは洗う必要があります。
3. 解剖顕微鏡の下で、細い鉗子のペアでそれらを軽く絞ることによってアルテミアを安楽死させる。これは鉗子に固執し、摂食を困難にするので、腸を追放するのに十分なほど強く絞らないでください。 ヒドラに供給する前にアルテミアを軽く絞ると消化プロセスが助長されます¹⁴ 。迅速な摂食を促進するために、新鮮に殺されたアルテミアを皿の中のヒドラの近くに置きます。
   注：その後のすべてのステップは、解剖顕微鏡下で行う。
4. ペダンツでヒドラを保持するには、1対の鉗子を使用します。 ヒドラを与える過程の間、花柄を持ち続けます。第二の鉗子のペアを使用して、 ヒドラを収縮させるためにボディコラムを挟みます。
5. 鉗子の第2のペアの先端を一緒に保持しながら、hypostome（動物の口の端にドーム型構造）の中心でタップします。これにより、口が開くことがあります。私口はタップで開かず、鉗子をhypostomeの中心に挿入して口を穿刺し、ついで鉗子の先端の圧力をわずかに解放する。これは、穿刺によって作られた口の開口部を引き伸ばす必要があります。
   注： ヒドラは口が開いたときに収縮して虚脱することがあります（ 図 2C ）。これが起こると、 ArtemiaはまだHydraに挿入されている可能性があります。そうすることが難しい場合は、次のヒドラに移動し、しばらくして元のヒドラに戻り、もう一度やり直してください。 ヒドラはその後の口の開口部の間にそれほど収縮しない傾向がある。
6. 素早く鉗子でアルテミアを拾い、 ハイドラの胃腔に挿入します。できるだけ多くのアルテミアを胃腔がいっぱいになるまで挿入し、 アルテミアはヒドラを傷つけずに挿入することはできません。事故内部のアルテミアを引き出すか、口が閉まるのを防ぐ。平均して、これは5〜6人のアルテミアですが 、12頭までが大きな動物に与えられています。
   1. 口が閉まり始めると、上記のように鉗子で再び開きます。しかし、動物の中に既にあるアルテミアは口が開かれたときに出てくるかもしれないので注意が必要です。
   2. ヒドラがアルテミア全体にとって小さすぎる場合は、メスを使用してアルテミアを切り、 ヒドラの小さな小片を食べる。 アルテミアがヒドラの内部にとどまっていない場合は、 アルテミアをヒドラの中に入れて口が閉まるまで、 アルテミアを押すことが必要な場合があります。
7. Hydra培地中の新鮮な50μg/ mLのリファンピシンを含むディッシュに、偶発的な絡みを避けるために、ガラスのパスツールピペットで摂食したヒドラを注意深く移す。 アルテミアが追放された場合移している間にヒドラをロムし、新しい料理の中に入れてください。
   注： ヒドラはプラスチックに比べてガラスに付着しにくいことが判明しているので、ガラスピペットを使用してヒドラを移す。ピペットの長さは関係ありませんが、5インチのピペットを使用する方がやや簡単です。

バフィング

1. 摂食後8時間から20時間の間、消化された物質を除去するためにヒドラを爆発させる。
2. 先端が平らになるまで、P320または類似のグリットサンドペーパーを用いて30Gの皮下注射針の先端を砂で落とす。
   注： 27Gの皮下注射針も使えますが、より高いゲージのより小さな先端が好ましいです。
3. ニードルを使い捨ての1 mLプラスチックシリンジに取り付け、シリンジにHydra培地で新鮮な50μg/ mLリファンピシンを充填する。
   注： 1つのヒドラをバフィングするには、約0.05 mL〜0.1 mLの溶液が必要です。 1mLのsyriより大量のシリンジでは、溶液の力や体積を制御することがより困難であるため、好ましい。
4. 解剖顕微鏡の下で、 ハイドラの花柄を細かいポイントの鉗子で掴んで、針でhypostomeの中心をタップします。口が開いていない場合は、鉗子をhypostomeに挿入し、上記のように口を開けて摂食させます。
   注：その後のすべてのステップは、解剖顕微鏡下で行う。
5. すべての残骸が追放されるまで、50μg/ mLのリファンピシン溶液で胃腔全体を吹き飛ばすのを避けるために、シリンジを使用して、非常に静かに洗い流します。 ハイドラのサイズが許されない場合、ニードルは必ずしもハイドラに挿入する必要はありません。針は、口の開口部の近くに保持され、口の方に直接向けられてもよい。
6. ガラスのパスツールピペットを使用して、新鮮な50の皿にハイドラを移し変えた81; g / mLのリファンピシンを含有する。

4.免疫組織化学による品質管理

注記：以下のプロトコルは、Shenk、M。A、 et al。 ¹⁸ 、Böttger、A ¹⁹ 。すべての工程は、特に明記しない限り、室温（RT）で行う。インキュベーション工程にナテーターを使用することができ、染色品質を改善することができる。しかし、 ハイドラがお互いに絡み合ってしまった場合、すべてのステップは無しで実行することもできます。

1. ブロッキング溶液：10％ウシ胎仔血清（FBS）と1％DMSOを1×リン酸緩衝食塩水（PBS）で調製する。この溶液を使用するまで4℃で保存する（4.6および4.11ステップ）。溶液は1〜2日間保存することができます。
   注：このプロトコルで使用されるすべてのソリューションは、適切な危険廃棄物として収集する必要があります。
2. Hydra mの2％ウレタン200μLでHydraをリラックス1.7mLのマイクロ遠心チューブ中で1分間エッヂュームする。無神経、未処理、一次抗体なしで未処理、および二次抗体なしで未処理の4つの条件のそれぞれについて、チューブあたり5Hydraを使用する。
   注： 1分を超えないでください。ウレタンで過ごす時間が長すぎると、動物の体調が悪くなるため、ここのタイミングは重要です。
3. ウレタンを除去し、 HydraをHydra培地中の4％パラホルムアルデヒド（PFA）200μL中で15分間固定する。
4. それぞれ10分間、1×PBSで3回サンプルを洗浄する。
   注： PBSおよびPBSTxでのすべての洗浄は、500μLの溶液で行います。
5. 500μLの0.5％Triton X-100をPBSで15分間浸透させる。
6. 0.5％Triton X-100を除去し、500μLのブロッキング溶液を加える。サンプルを少なくとも1時間ブロックする。
7. ブロッキング溶液中で抗チロシン - チューブリン抗体1：200を希釈する。
   注：この濃度はde実験的に終了した。コントロールの信号が弱すぎると分かった場合は、濃度を上げる必要があります。非特異的結合がある場合、濃度を低下させる必要があるかもしれない。抗体のプレインキュベーションはまた、非特異的結合を減少させるのに役立ち得る。
8. サンプルからブロッキング溶液を除去し、200μLの一次抗体を神経を含まないHydra 、未処理のコントロール、および未処理のコントロールを二次抗体なしで添加する。一次抗体を含まない未処理対照については、抗体なしで200μLのブロッキング溶液のみを添加する。
9. サンプルを4℃で一晩（> 12時間）インキュベートする。
   注：あるいは、室温で5〜6時間インキュベートする。
10. 一次抗体を除去し、1×PBS（PBSTx）中の0.3％Triton X-100で広範にサンプルを洗浄する。
    注：少なくとも2〜3回再使用できるので、一次抗体を保存して4℃で保管してください 。
11. ヤギ抗マウスhP二次抗体1：500のブロッキング溶液。 200μLを神経を含まないHydra 、未処理対照、未処理対照に添加してください。二次抗体を含まない未処理コントロールの場合は、抗体なしでブロッキング溶液を200μL添加するだけです。
    注：あるいは、蛍光二次抗体を使用することができ、そのためには、ステップ4.13〜4.17は不要である。蛍光セカンダリを使用すると時間が節約され、通常は十分ですが、hPセカンダリでは感度が向上します。二次の濃度は実験的に決定した。コントロールの信号が弱すぎるとわかった場合は、濃度を上げる必要があります。非特異的結合がある場合、濃度を低下させる必要があるかもしれない。
12. サンプルを4℃で一晩インキュベートする。
13. 二次抗体を除去し、PBSTxで広範囲にサンプルを洗浄する。
14. 1×PBT：0.2％ウシ血清アルブミン（重量/容量）、および0.05％Tween20を1×PBSに調製する。 sを培養する1倍のPBT中で30分間麻薬を投与する。
15. 1x PBTを除去し、1：1,000 NHS-フルオレセインおよび1：PBT中1：10,000 H ₂ O ₂中のサンプルを暗所で15分間インキュベートする。このステップから、蛍光シグナルが光にさらされるにつれて減少するので、サンプルを可能な限り暗所に保管してください。
    注： NHS-フルオレセインは、King、RSおよびNewmark、PA ²⁰による詳細なFISHプロトコルに従って調製した
16. 素早くPBSTxで3回、次に30分間で2回洗浄する。
17. PBSTxに4℃で一晩放置して洗浄を続ける。
18. 1倍のPBSTxで数回洗浄してください。細胞核を可視化するために、4 '、6-ジアミノジ-2-フェニルインドール、二塩酸塩（DAPI）を用いたDNAカウンターシングのための以下の任意のステップを実施する。さもなければ、サンプルは今イメージされるかもしれません。
19. 5mg / mLのDAPIストックをPBSTx中で1：500の作用濃度に希釈し、各チューブに200μLを加える。インコ試料を30分間沸騰させる。
    注意： DAPIは発癌物質として知られています。完全なPPEを着用してください。
20. 蛍光顕微鏡で画像化する前に、DAPIを除去し、PBSTxで2〜3回サンプルを洗浄する。

結果

最初の8時間のコルヒチン処置の直後に、すべてのヒドラは生き残る。これらのHydraの一部は触手のスタブだけを残し（ 図3A ）、他の人は触手を完全になくします（ 図 3B ）。次の1〜2日間、触手はすべてのHydraが触手を紛失するまで収縮を続けます。治療から約1週間後、 Hydraは、触手...

ディスカッション

ハイドラ間質細胞は、二重コルヒチン処理により除去することができる^3,4 。最初の治療の後の日には、個々のヒドラ間の接触を防ぎ、 ヒドラの断片が変形したヒドラに融合するのを避けることが不可欠です。また、第2のコルヒチン処置は、そのような動物から残りの間質細胞を排除するのに十分ではない可能性があるため、最初の処置の後に無...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Colchicine	Acros Organics	227120010
1 mL Syringe	BD	301025
Brine Shrimp Eggs	Brine Shrimp Direct	N/A	Can be purchased locally
Brine Shrimp Hatchery Dish	Brine Shrimp Direct	N/A
60 mm x 15 mm Petri Dish	Celltreat	229663
30 G x 3/4" Hypodermic Needle	Covidien	1188830340	A 27G needle may also be used
2 x Fine-tip Tweezers	Dumont	0109-5-PO
Rifampicin	EMD Millipore	557303
Goat anti-mouse lgG, Pab (HRP Conjugate)	Enzo	ADI-SAB-100-J
Bovine Serum Albumin (BSA)	Fisher	BP9703-100
Scalpel	Fisher	08-920A
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	10437028
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)	Invitrogen	D1306
PBS Tablets	MP Bio	2810305
Monoclonal Anti-Tubulin, Tyrosine	Sigma	T9028
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Sigma	D2650
Hydrogen Peroxide	Sigma	216763
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma	P6148
Triton X - 100	Sigma	T9284
Tween 20	Sigma	P1379
Urethane	Sigma	U2500
Air Pump	Tetra	77846-00
Glass Pasteur Pipette	VWR	53283-916	Length of the pipet does not matter
15 mL Tube	VWR	89039-670
P320 Sandpaper	3M	IBGABBV00397	Can be purchased at local home improvement store