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要約

このプロトコルでは、恒久的な帽状電極ソケットと齧歯動物に注入された胸電極の手術のセットアップについて説明します。ソケットに 2 つ目の電極を付けてそのまま頭蓋骨を介して警告動物のモーター システムを経頭蓋脳の電気的刺激の種類を配信できます。

要約

経頭蓋脳の電気的刺激は、大脳皮質興奮性、人間および齧歯動物の可塑性に調節することが。人間の刺激の最も一般的な形式は、経頭蓋直流電流刺激 (tDCS) です。頻度の少ない経頭蓋交流電流刺激 (tACS) または頭蓋雑音刺激 (tRNS)、事前定義された周波数範囲内でランダムに適用される電流を用いて tACS の特定のフォームが使用されます。実験的および臨床的目的の両方の人間の脳の非侵襲的電気的刺激の研究の増加動物の基礎、メカニズム、安全性研究のための高められた必要性をもたらした。ターゲット警告齧歯動物でモーターのシステムそのまま頭蓋骨を介して経頭蓋電気刺激 (tES) のモデルを説明します。プロトコルは、胸に注入されたカウンター電極と組み合わせて永久帽状電極ソケットの手術のセットアップの手順を説明します。帽状のソケットに刺激電極を配置すること、によって人間の tRNS、tACS、Tdc に匹敵する異なる電気刺激などを配信できます。また、アラートの齧歯動物の tES の実用的な手順を紹介しています。応用電流密度、刺激時間、および刺激の種類を実験のニーズに応じて選択できます。注意点、利点、およびこの設定の欠点は、安全性と忍容性の面だけでなく、議論が。

概要

脳の機能を研究し、動作を変更する、(tES) の脳に電流の経頭蓋管理は何十年も使用されています。もっと最近、適用する直接電流、または頻度の低い交流電流 (tACS、tRNS) そのまま頭蓋骨を非侵襲的で 2 つ以上の電極の使用 (anode(s) と cathode(s)) は、科学的・臨床的関心を得ています。特に、tDCS 健常者と脳神経疾患を持つ患者でより 33,200 セッションで使用されている、安全かつ簡単に、治療可能性と長期的な費用対効果のベッドサイド アプリケーションが浮上して1の行動の影響。これは明らかに高められた必要性と安全性の側面を含む機構の研究の科学的関心をもたらした。この記事は、刺激、tDCS の最もよく使用されるフォームに焦点を当てください。

種を渡って tDCS は皮質興奮性とシナプス可塑性を変調します。興奮性の変化は、ラットおよび猫2,3,4、神経の自発発火率の極性依存性の変化として、または人間とマウス (運動誘発電位 (MEP) 振幅の変化として報告されています。両方は anodal と減少した後, tDCS 後増加: 人間5,6;マウス7)。Anodal DC モーター皮質のシナプス伝達効率の増加または海馬シナプス体外数時間刺激または長い長期増強 (LTP) 後に、共同可塑性の前に与えられたり、特定の弱いシナプス入力とを適用刺激8,9,10、11,12を誘導します。に従って、運動や認知トレーニングの成功に刺激の利点は、しばしば明らかにのみかどうか tDCS は共同訓練8,13,14,15を適用します。これらの前の調査結果は、主に神経細胞の機能に帰因する間、こと非神経細胞 (グリア細胞) tDCS の機能効果にまた貢献するかもしれない注意必要があります。たとえば、アラート マウス16anodal tDCS にアストロ サイトの細胞内カルシウム濃度が増加しました。同様に、神経変性のしきい値電流密度で anodal tDCS はミクログリア17の線量依存アクティベーションを誘発しました。ただし、tDCS によるニューロン ・ グリア相互作用の変調はさらに具体的な調査必要があります。

撮影一緒に、動物の研究は明らかに興奮性と可塑性に Tdc の変調効果への理解を高度な。ただし、遅いと対照をなして人間 tDCS 研究の出版物の急激な増加との in vitroおよびin vivo での tES の基になるメカニズムの調査でマイナーな増加は「逆トランスレーショナルリサーチ ギャップ」観測動物モデル。また、tES の齧歯動物モデルが高い可変性 (帽状刺激する経皮からまで)、研究所全体で実行され、報告された刺激プロシージャは完全に透明な比較可能性を妨げて、頻繁にしないと注目の結果の解釈と同様、基礎研究データ。

ここでは、我々 は詳細にターゲットの可変性を最小限に抑えながら人間 tDCS 条件に翻訳をでき、繰り返し刺激することがなく、一次運動野、経頭蓋脳刺激セットアップの外科の実装を記述します。行動を妨げます。警告ラットにおける後続の tES のステップバイ ステップのプロトコルを提供しています。アラートの齧歯動物の tES の安全なアプリケーションの方法論的・概念的な側面を説明します。

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プロトコル

動物を含む研究、実験を開始する前に関連する (国別) の承認を受けなければなりません。EU ディレクティブ 2010/63/EU は、更新されたドイツの動物保護法によるとここで報告されるすべての動物実験を行った (" Tierschutzgesetz ") 2013 年 7 月および 2013 年 8 月の更新されたドイツの動物実験規制。動物のプロトコルは、地方自治体によって承認されている " フライブルクの地域協議会の動物実験委員会 "、" 医療センター フライブルク大学の動物実験委員会 ".

1 計測の準備と手術材料

  1. 図 1 に掲げる利用可能で手術のためすでに配置されているを確認してください。
    2. 。
  2. シンの長方形プラチナ プレートの準備 (例えば 10 × 6 × 0.15 mm)、胸の皮下配置カウンター電極として、パンチ プレートの 2 つの正反対のコーナーで 2 つの小さな穴が
    3. 。
  3. プラチナ プレート (穴なしのコーナーの 1 つに鉛フリー錫のはんだを使用した 〜 10 cm の長さの絶縁ケーブルをはんだ付けします
    4. 。
  4. 分離のはんだ付け継手に関する病理組織アクリル接着剤の小滴を適用します
    5. 。

2。げっ歯類の手術に備えて

  1. 齧歯類の研究数を代入し、準備手術でこれを注意してくださいカード
  2. 、齧歯動物の重量を量る術カードの重量に注意します。(例えば、 ケタミン 100 mg/kg 体重とラットのキシラジン 70 mg/kg 体重) の注射麻酔薬の投与量を計算します
    3. 。 麻酔薬の計算額の腹腔注入による
  3. 誘発麻酔
    。 注: 代わりに吸入麻酔を使用する場合 (例えば イソフルラン) ~ 4 %1 2 L/分の酸素の連続的な流れに誘導の商工会議所に齧歯類
    4. 。
  4. チェック開始 5 分つま先ピンチ反射によって麻酔深度ポスト噴射。つま先ピンチ反射がまだ存在する場合に達すると初期投与量の 30% の注射による麻酔の深化と延長。
    1. 麻酔の初期投与量の 30% を注入する必要があります実験で任意の時点でつま先ピンチ反射が返された場合です
      2. 。 吸入麻酔を使用する場合
    2. 誘導室で齧歯動物の姿勢反射の損失をしつま先ピンチ反射の欠如によって麻酔の深さを確認します。反射がまだ存在する場合は、麻酔室に期間を延長します。~1-1.5% イソフルランの維持濃度に到達するまで適応イソフルラン麻酔の深さの割合を全体の実験中です
      3. 。
    3. 減少を呼吸とあえぎの周波数が発生すると、齧歯類つま先ピンチ反射を回復または自発的な動きを示しています; 割合を下げる、吸入麻酔薬の割合を増やします
      4. 。
  5. 反射がないとすぐに研究室のベンチに齧歯類を配置または手でそれを保持します
    。 注: 吸入麻酔を使用している場合は、噴霧器に接続されているノズルを使用して (今 2-3%) の間継続的な削減イソフルラン フローを提供。
    6. 。
  6. はラットに髪を削除 ' s 頭エリアを耳から耳まで削って、および、クリッパーでは、耳のすぐ後ろに吻側の目のレベルの間。鎖骨まで剣から前肢の間の領域を削って、胸の毛を削除します
    。 注: 張力の下で肌を保つ、シェービングが容易になります
    7. 。
  7. 角膜を保護するために眼軟膏のドロップでラットの目をカバーします
    8. 。
  8. マーク ラット ' 割り当てられた研究数に応じて s 耳
    。 注: 研究の長さにもよります尾マークは十分な可能性があります、それ以外の場合、標準化された使途が望ましい
    9. 。

3。手術: 胸部電極注入

注: 外部からベストと剃毛胸に対向電極を配置する場合、この手順をスキップできます

。
  1. 場所 (胸元) 齧歯動物なりやすい操作テーブルの上です
    。 注: 場合吸入麻酔ラットを維持 ' s 鼻がさらに 1.5-2% のイソフルラン麻酔濃度を減らす麻酔ノズルに配置します
    2. 。
  2. 消毒消毒スプレーまたは、空気乾燥が防腐剤 (例えば、 エタノール 70%) に浸した綿棒で坊主の頭皮です。2 回繰り返します
    3. 。
  3. 中間の耳レベルに吻側の目線から 1行でメスで皮膚をカットします
    。 注: これは頭のてっぺんに向かって注入胸部電極から接続ケーブルのトンネルし、も DC 電極ソケット配置の希望カット
    4. 。
  4. 胸を露出するように仰臥位にラットを有効にします
    5. 。
  5. 3.2 で説明されているように胸の皮膚を消毒します
    6. 。
  6. は、ティッシュ鉗子で右胸の横の皮膚を昇格および右腋窩から内側約 0.5 cm の小さなハサミでボタンホールをカットします。はさみで頭蓋の姿勢でまっすぐ矢状切口を行います
    7. 。
  7. は、atraumatically 左大胸筋から皮膚の切断によって皮下の袋を形成します。そう繰り返し小さなはさみを開くことによって (または生理食塩水浸した綿棒).
  8. トンネルの恒常性の鉗子を用いた浅筋膜を貫通して胸のポーチに終了する首に沿って開かれた頭皮の後頭部左からケーブルのパスを右側を下に動物を有効にします
    9. 。
  9. は、慎重に浮遊する鋭い線をさせず白金電極に接続されている電極ケーブルの端をつかむため恒常性の鉗子を開きます。電極にポーチ、齧歯動物の左後肢に向けてはんだ付けのポイントに入るまでは、トンネルを通ってケーブルを引き出します。腹臥位に戻って、齧歯動物を有効にします
    10. 。
  10. 角穴 (4-5 ノットは安定性のため推奨) に反対 2 で胸筋筋膜に無菌合成編組非吸収性縫合糸でプラチナ プレートを修正します
    11. 。
  11. 同様に筋膜組織のトンネルの入り口の手前のわずかなループを形成、緩い結び目によってケーブルに接続します
    12. 。
  12. (同じ縫合材料は電極とケーブルも使用可能)、カットのサイズによっては 3-4 皮膚縫合で皮膚を閉じます
    13. 。

4。手術: 帽状 tES ソケットの配置

  1. 定位脳手術フレームで動物の場所
    。 メモ: ~1.5-1% のメンテナンス イソフルラン流れに麻酔薬の濃度を下げると吸入麻酔を使用して場合は、つま先ピンチ反射、呼吸パターンを調整します
    2. 。
  2. 3.2 で説明されているように坊主の頭皮を消毒します
    3. 。
  3. 中間の耳レベルに吻側の目線から 1行でメスで皮膚をカットします
    。 注: 場合胸部電極 placem耳鼻咽喉科を行った、4.2 および 4.3 の手順が既に実行されています
    4. 。 メスと徹底的に両側に骨膜 (頭蓋骨の結合組織) をこすり
  4. コットンで拭き取るを入れ替えます。ブルドッグのクランプでカットの 4 つのコーナーで膠原病をこだわるし、手術フィールドを開いたままに横に垂らすことができます
    5. 。
  5. 適用 0.9% 食塩水骨表面と綿棒で組織をきれいにします。3% H 2 O 2 骨表面をきれい。組織との接触を避けてください。これによって骨はより徹底的に掃除し、骨から少量の出血を停止します。また、骨膜の残差が表示されます。綿棒を適度な圧力を適用することでこれらの残差を削除します
    。 注: 骨膜残差の除去により接着や骨に接着 tES ソケットの耐久性が高くなります。
    1. 止め出血の場合骨ドリルを使用し、骨にわずかな圧力で 1-3 s のそれに触れます。この機械的手順がほとんどの場合に重要な加熱をせずに出血を停止しています。決して骨; 電気焼灼器を使用します。でも簡単なアプリケーションは、脳組織の損傷になります (電気焼灼器のみ使用してください傷組織の出血のため).
  6. 固定ネジは、セットアップの順守を改善する、継手のねじサイズ ドリル ビットを選択します。事前手ドリルで掘削し、骨ドリルで若干垂直圧力アプリケーションにより、2 つの異なる骨プレートに 2 つのぎざぎざの穴を配置します。TES ソケットの目的の位置に近接をようにそれが電極にねじを妨げる可能性があります (例えば、 左一次運動皮質 tES の右正面と後部の頭頂部のネジの位置を選択) します
    7. 。
  7. 埋込カウンター電極の場合はり将来トンネルのケーブル固定用右後方の頭頂骨に位置する第 3 の穴
    8. 。
  8. バリの穴にプラスチックのネジを置くし、ネジまで最初の摩擦を感じた。3 つの追加の 180 ° スクリュー ターンを実行します。スクリューの安定性のための鉗子でチェックし、ないタイトな十分な場合は 1 つのより多くのターンを追加します
    。 注: ラットのこれにより、ネジの配置を硬膜外硬膜や脳 (ねじの設計回転数が異なる場合があります) によって損なうことがなく。神経変性のしきい値を超える DC 電流密度でも病変の場所やネジの下程度ねじ配置しなかった混乱ないのでステンレスのネジを使用は現実的であります
    9. 。 はんだごてと約 5 分間予熱
  9. ターンは右頭頂葉のねじ周り occipitally 組織トンネルを抜けたケーブルを風し、巻線の背後にある約 1 cm のケーブルを残して、それをカットします。メスのケーブルの端を慎重にワイヤーストリッパします
    10. 。
  10. シアノ アクリル接着剤でネジや骨に息切れのケーブルを固定します
    11. 。
  11. コネクタとカウンター電極ケーブルの裸線鉛フリーはんだの少量を適用し、錫はんだが溶けるまでコテの先を触れながら一緒に両方の前はんだ付け部分を押して両方を接続 (約 2-3 秒)。その後組織の損傷、ケーブルの過度の金属加熱を避けるためにすぐにはんだ付けのヒントを削除します
    12. 。
  12. は曲がって、鋸歯状の先端の鉗子でカスタムした tES 電極ソケット ( 図 1 b 赤で) をピックアップし、ソケットの下縁にシアノ アクリル接着剤の薄い層を適用します。運動皮質と 4 mm 径のソケットを使用して上に設置、2 mm 前方で前から 2 mm 外側ソケット中点を配置します。この位置に矢状縫合で直接ソケットの内側縁の内側を終了し、尾の境界は前の高さで終わる必要があります。(ほとんどのシアノ アクリル接着剤硬化圧力によって) 骨に簡単にソケットを押します
    。 注: ソケットの真上に光源を配置することが簡単にソケットを配置します
    13. 。
  13. (接着剤は反射するので光でチェック) でソケットの領域内で骨は接着剤の無料を確認します。接着剤の場合流出、ソケットを削除、メスと接着剤をこすり、手順 4.12
    14. 。
  14. ソケットが場所にあり今後刺激エリア無料、接着剤の後はまず流体橋この場所で現在の分流につながる可能性を避けるためにシアノ アクリル接着剤の小さなドロップで周辺の組織にソケットの外側縁をシールします。刺激エリアへと流れ込む場合があります、あまりにも多くの接着剤は適用されません (この場合、4.12 の手順に戻る) です
    。 注: 刺激区域を接着剤の自由を保つ刺激面積の削減が電流密度を大幅に向上可能性がありますので重大である (A/m ²).
  15. シアノ アクリル接着剤ですべてのネジをカバーします
    16. 。
  16. は、小さなシリコン チューブやガラスの二成分歯科アクリル セメントを混ぜます。それは粘性になると、すぐに骨にソケットの残りのボーダーを密封する歯科ヘラで適用します。刺激領域にアクリル セメントの任意のフローを避ける
    17. 。
  17. 最後にカバー全体の頭蓋骨、ネジ、カウンター電極ケーブル、ソケットまで ⅓ 歯科用アクリル セメント ソケットの。セメントが正しい粘度を持っているを確認: かどうかも流体に流れ周囲の組織へ難しい場合、それはそれを均等に分散することは困難です
    18. 。
  18. すべての骨は覆われ、セメントが硬化するとき削除ブルドッグ クランプ; 皮膚既成セメントをタッチする必要がありますだけ縫合が必要ないように。(最初のカットはあまりにも長いと結合組織、筋が表示される場合は、3.12 の手順で説明するように縫合糸を適用する).
  19. カット肌の境界線を綿棒でヨウ素の 1 つの層を適用し、カルプロフェン (5 mg/kg 体重の痛み治療と流体交換 0.9% 生理食塩水 5 7.5 mL に溶解) を皮下注入します
    。 注: 吸入麻酔を使用している場合それをオフになりました
    20. 。 齧歯類が目を覚まし、姿勢の安定性が復元されるまで、
  20. が麻酔からの回復のため地球温暖化ボックスに齧歯類を配置します
    。 メモ: 確認動物 ' s 重量開発傷機関による毎日の州、および一般的な福利基準 ' s 推薦
    21. 。

5。経頭蓋電気刺激プロシージャ

注: 麻酔 tES の効果に影響を与える、可能な限り警告齧歯動物での刺激を実行する勧めします。実験を開始する前に、少なくとも 5 日間 (頭と胸の傷の治癒) 回復する齧歯動物を許可します。実験後に実行できる以前の時点で外科胸の傷は最も過敏な; として、ベストと固定外部カウンター電極を使用する場合しかし、動物はいくつかの日のために電極のベストに慣れる必要があり、行動課題との干渉が発生する可能性が

。
  1. 0.9% 生理食塩水と半分 tES 電極ソケットを記入し、空気の泡を削除します
    2. 。
  2. します。フォア, tDCS セッションは常に塩素処理をチェックし、銀/塩化銀電極が再度塩素 (光沢のある銀面など)、必要な場合。Anodal tDCS セッション前に良好な伝導性の刺激の間ようにサンドペーパーで前の刺激から可能な余分な塩化銀沈殿物を削除します。TES 電極スクリュー キャップ ( 図 1 b、灰色部分) のネジします
    。 注意: 電気化学反応による刺激中に塩素化の枯渇し、有毒なビルドアップは再, tDCS セッション間電極を塩素消毒するため障害にはつながるが。これは組織の損傷を誘発します。刺激持続時間が 20 分に満たない場合、単一セッション内で再塩素処理は必要ありません
  3. は、頭の上の 2 つのコネクタにケーブルを接続 (anodal 刺激のため anodal のケーブルが接続されている反対だし, 刺激のため、スクリュー キャップのコネクタ).
    注: 外部に設置カウンター電極を使用する場合カバー導電性ゲルと齧歯類の場所で対向電極 ' s 胸。これは簡単にする電極は、齧歯動物は刺激中に着ることができる小さい齧歯動物のベストの固定済みです
    4. 。
  4. 自由のための動きができるケージの上回転に接続されているケーブルと実験ケージに齧歯動物の場所
    5. 。
  5. 刺激をオンにし、(刺激強度、期間、時間上下ランプ) 刺激パラメーターを調整します
    6. 。
  6. 安全シャット ダウンと断線警報、市販の刺激装置を使用していないときに、一定の電流をチェックする回路メーター
    。 注: このセットアップで、刺激することができます適用されるパフォーマンスまたは行動のタスクのトレーニング中にします
    7. 。
  7. 刺激時にストレスの兆候や齧歯類の不快感を確認します
    8. 。
  8. 刺激終了後ケーブルを外し、頭に電極キャップをはずし、きれい、綿棒を使ってソケットを乾燥します。家庭環境に齧歯類を返したり、場合必要な行動手順を続行します
    9. 。

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結果

警告齧歯動物で信頼性の高い繰り返し tES のセットアップの説明の実装は、機構の実験、用量反応の研究、または行動のタスクを含む実験に簡単に統合できます。日には、(非侵襲的) tES を使用して動物の研究からのデータの比較は tES 刺激アップ研究室間の変動によって、刺激パラメーター (例えばで適用される様々 な電流密度の違いによって妨げられる法外?...

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ディスカッション

このプロトコルでは、典型的な材料および警告の齧歯動物の後続刺激のためだけでなく、恒久的な tES セットアップの手術実現のための手順について説明します。概念的な面 (人間の条件、特定の頭脳の刺激の予想される効果との比較と同様に、いくつかの方法論的側面 (安全性と忍容性 tes の結果パラメーター) tES 実験、齧歯類の準備中考慮する必要は地域)。方法論的観点から注入された胸?...

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開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

この作品は、ドイツ研究振興協会 (DFG 日時 2740/3-1) によって支えられました。カスタムメイド tES セットアップと直流刺激装置の内製化は、フランク Huethe とトーマス ・ ギュンターをありがとうございます。

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資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Softasept NB. Braun Melsungen AG,
Melsungen, Deutschland		3887138antiseptic agent
Ethanol 70 %Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, DeutschlandT913.1
arched tip forcepsFST Fine science tools, Heidelberg, Deutschland11071-10
Iris Forceps, 10cm, Straight, SerratedWorld Precision Instruments, Inc, Sarasota, FL, USA, Inc, Sarasota, FL, USA15914
Scalpel Handle #3, 13cmWorld Precision Instruments, Inc, Sarasota, FL, USA, Inc, Sarasota, FL, USA500236
Standard Scalpel Blade #10World Precision Instruments, Inc, Sarasota, FL, USA, Inc, Sarasota, FL, USA500239
Zelletten cellulose swabsLohmann und Rauscher, Neuwied, Deutschland133495 x 4 cm 
IsofluraneAbbVie Deutschland GmbH & CoN01AB06
Iris Scissors, 11.5cm, StraightWorld Precision Instruments, Inc, Sarasota, FL, USA, Inc, Sarasota, FL, USA501758small scissors
cotton swab/cotton budsCarl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, DeutschlandEH12.1Rotilabo
Kelly Hemostatic Forceps, 14cm, StraightWorld Precision Instruments, Inc, Sarasota, FL, USA, Inc, Sarasota, FL, USA501241surgical clamp
electrode plate (platinum)custom madeWissenschaftliche Werkstatt Neurozentrum Uniklinik Freiburg, Deutschland10x6 mm, 0.15 mm thickness
insulated copper strands (~1 mm diameter)Reichelt elektronik GmbH & Co. KG, Sande, GermanyLITZE BLelectrode cable
Weller EC 2002 M soldering stationWeller Tools GmbH, Besigheim, GermanyEC2002M1D
Iso-Core EL 0,5 mmFELDER GMBH Löttechnik, Oberhausen, Deutschland20970510lead free solder
MERSILENE Polyester Fiber SutureJohnson & Johnson Medical GmbH, Ethicon Deutschland, Norderstedt, GermanyR871Hnonabsorbable braided suture, 4-0
HistoacrylB. Braun Melsungen AG,
Melsungen, Deutschland		9381104cyanoacrylate
Ketamin 10%Medistar GmbH, Germanyn/aanesthetics
Rompun 2% (Xylazine)Bayer GmbH, Germanyn/aanesthetics

参考文献

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